Name: fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 परिवर्तन, अभिव्यक्ति, और शोधन <ol><li> PAD4 परिवर्तन के लिए, रासायनिक सक्षम ई में PAD4 जीएसटी संलयन युक्त pGEX प्लाज्मिड परिणत निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कोली (BL21 (DE3)) कोशिकाओं...

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	<li>Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+protein+language+using+proteomics.">Interpreting the protein language using proteomics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).</li><li>Sims, R. J., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+code+embedded+in+proteins+that+is+based+on+post-translational+modifications.">Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications.</a> Nat. Rev. Mol. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrullination+regulates+pluripotency+and+histone+H1+binding+to+chromatin.">Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin.</a> Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> J. 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Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. 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Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

स्तनधारी प्रोटीन की एक बड़ी संख्या में भारी राइबोसोम से प्रोटीन के जैवसंश्लेषण निम्नलिखित एन्जाइम की क्रिया द्वारा संशोधित कर रहे हैं. ये बाद translational संशोधनों (PTMs) बहुत प्रोटीन 1-3 (अन्य सुविधाओं के बीच) आकार, प्रभारी, संरचना, और oligomerization राज्य बदलकर proteome के कार्यात्मक विविधता को बढ़ा सकते हैं. नतीजतन, प्रोटीन संरचना में परिवर्तन ऐसे प्रोटीन गिरावट, सेलुलर भेदभाव, सिगनल, जीन अभिव्यक्ति में मॉडुलन, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के रूप में शारीरिक परिणामों को जन्म दे सकता है. इन संशोधनों के सभी मानव प्रोटीन का एक बड़ा प्रतिशत में प्रचलित हैं जबकि हिस्टोन प्रोटीन सहसंयोजक संशोधनों 4 की एक असामान्य रूप से उच्च संख्या से गुजरना पर, टर्मिनल समाप्त होता है. हिस्टोन प्रोटीन जीनोमिक डीएनए के संघनन की सुविधा है कि संरचनात्मक प्रोटीन के एक परिवार के हैं. असंरचित हिस्टोन पूंछ के सहसंयोजक संशोधनों के एक वीडियो से बाहर ले गए और विनियमित रहे हैं, अवशेष (लेखकों) के सहसंयोजक संशोधन उत्प्रेरित ही संशोधनों (erasers) रिवर्स, और परिवर्तन के बीच भेद कर सकते हैं कि एंजाइमों के हिस्टोन पूंछ (पाठक) 5-7 पर अंकित किया जा रहा है. वास्तव में, जाना जाता PTMs की सबसे मेथिलिकरण, फास्फारिलीकरण, एसिटिलीकरण, sumoylation, ubiquitination, और citrullination 8 सहित हिस्टोन के इस छोटे खंड के भीतर देखा जा सकता है. Citrullination गैर टी आरएनए इनकोडिंग peptidyl-citrulline (चित्रा 1 ए) के लिए peptidyl-arginine के रूपांतरण शामिल है. इस पक्ष श्रृंखला निराकरण के लिए जिम्मेदार प्रोटीन, पैड के सदस्य हैं कैल्शियम निर्भर एंजाइमों हैं जो सभी के लिए. 9,10, प्रोटीन परिवार (पी एक rginine डी eiminase eptide). तिथि करने के लिए, पैड परिवार के पांच सदस्यों (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, और PAD6) में वर्णित किया गया है. इस परिवार के प्रत्येक सदस्य अलग सेलुलर प्रोटीन लक्षित करने के लिए प्रकट होता है और भी विश्वविद्यालय को प्रदर्शित करता हैकुए ऊतक वितरण प्रोफाइल. PAD4 एक परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम 11 के माध्यम से नाभिक के भीतर स्थानीयकृत हो जाना इस प्रोटीन परिवार का ही सदस्य है. तदनुसार, यह हिस्टोन H2A arginine अवशेषों 3 के एन टर्मिनल पूंछ पर arginine पक्ष श्रृंखला (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, और H3R26) और एच 4 (H4R3) 12 सहित परमाणु ठिकानों की संख्या, deiminate दिखाया गया है, 13. पैड isozymes के प्रत्येक विशिष्ट और महत्वपूर्ण शारीरिक कार्य किया है, वहीं PAD4 कारण रोगग्रस्त और स्वस्थ कोशिकाओं दोनों में मानव प्रक्रियाओं की एक संख्या में अपनी भूमिका के लिए काफी अधिक ध्यान दिया गया है. हाल ही में, PAD4 pluripotency ट्रांस्क्रिप्शनल नेटवर्क 14 के एक सदस्य होना दिखाया गया था. दोनों PAD4 अभिव्यक्ति के स्तर और गतिविधि चूहों में reprogramming और जमीन राज्य pluripotent राज्यों दौरान ऊंचा होना दिखाया गया. स्टेम सेल जीन के विनियमन को नियंत्रित करके, PAD4 सेलुलर reprogramming दक्षता में एक निर्णायक भूमिका रखने सकता है. PAD4 भी में फंसा दिया गया हैपर रोगजनकों के बंधन जो न्युट्रोफिल कोशिकी जाल, के गठन के अपने सिस्टम निकासी कर सकें. PAD4 द्वारा हिस्टोन प्रोटीन का hypercitrullination इस प्रकार जीवाणु संक्रमण 15,16 बंद warding, कोशिकी जाल से रोगजनक बैक्टीरिया की encapsulation के लिए आधार सामग्री के रूप में कार्य करता है जो क्रोमेटिन के decondensation लाती है. साथ ही, PAD4 मानव रोगों की संख्या में एक सक्रिय भूमिका निभाने के लिए पाया गया है. यह पहले से PAD4 की न्यायपालिका अभिव्यक्ति रुमेटी गठिया की शुरुआत को और गंभीरता के साथ जुड़ा हुआ है कि दिखाया गया है, अल्जाइमर, पार्किंसंस रोग, और एकाधिक काठिन्य 17. वास्तव में, विरोधी citrullinated प्रोटीन एंटीबॉडी की उपस्थिति संधिशोथ 18 की सबसे विश्वसनीय और निश्चित निदान और शकुन बायोमार्कर से एक है. इसी तरह, dysregulated PAD4 गतिविधि हाल ही में डिम्बग्रंथि, स्तन, फेफड़े, एक सहित मानव कैंसर की एक संख्या में देखा गया हैडी esophageal कैंसर 19-22. PAD4 और कैंसर के बीच लिंक p53 ट्यूमर शमन प्रोटीन 22,23 ELK1 ओंकोजीन के माध्यम से या के माध्यम से मध्यस्थता होना दिखाया गया है और पिछले काम PAD4 एक उपन्यास विरोधी कैंसर चिकित्सकीय लक्ष्य 17,24,25 हो सकता है कि सुझाव दिया गया है. सिद्धांत अध्ययन का एक सबूत के रूप में, कोलोरेक्टल कैंसर कोशिका लाइन HCT116 में shRNA के माध्यम से PAD4 की कमी apoptosis और सेल चक्र गिरफ्तारी 26 उत्प्रेरण के लिए पर्याप्त होने का पता चला था. हाल ही में विकसित अपरिवर्तनीय PAD4 अवरोध चूहों 27 में ट्यूमर जन में एक सत्तर प्रतिशत कमी आई. काफी उल्लेखनीय है, PAD4 निषेध untransformed कोशिकाओं बख्शते जबकि कैंसर कोशिकाओं के चुनिंदा हत्या के परिणामस्वरूप एक लक्षित चिकित्सा के रूप में कार्य करने के लिए दिखाई दिया. PAD4 का कार्य बंद करने के लिए छोटे अणुओं का उपयोग कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए या मौजूदा कैंसर केमोथेरापी 28 को बढ़ाने के लिए एक शक्तिशाली नई रणनीति साबित हो सकता है. दुर्भाग्य से, एक POतम्बू प्रतिवर्ती PAD4 अवरोध अभी तक की खोज की जा गया है. सहसंयोजक अवरोधकों की संख्या arginine सब्सट्रेट 27,29,30 mimics और स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्य कोशिकाओं दोनों में PAD4 की भूमिका को समझने में व्यावहारिक उपकरण साबित किया है कि क्लोरो / फ्लोरो imidine संभाल का उपयोग कर विकसित किया गया है. हालांकि, इन अणुओं समान शक्ति के साथ सक्रिय पैड के सभी रोकना. इसलिए, PAD4 की गतिविधि पर रिपोर्ट है कि एक सतही परख के लिए जरूरत के लिए महत्वपूर्ण है. तिथि करने के लिए, PAD4 assays के एक वर्णमिति readout के 31 की प्रतिक्रिया से अमोनिया की रिहाई के लिए लिंक है कि वर्णित किया गया है, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण परख 32 के लिए एक fluorescently लेबल chloroamidine सब्सट्रेट अनुरूप उपयोग glyoxal और citrulline 33 के बीच एसिड की सहायता की प्रतिक्रिया पर निर्भर है, और युगल कदम 34 dequenching एक प्रतिदीप्ति को PAD4 गतिविधि. इनमें से केवल सहसंयोजक संशोधक haloacetamidine रणनीति उच्च throughput scre साथ संगत साबित हो गया हैening प्लेटफार्मों 32,35,36. हम मज़बूती से PAD4 की गतिविधि उपाय है कि एक सतही प्रतिदीप्ति आधारित परख का वर्णन. एक मजबूत संकेत करने वाली शोर अनुपात, विश्लेषण की गति, और माप की मजबूती को प्रदर्शित करता है जो परख, वास्तव में एक शक्तिशाली और चयनात्मक PAD4 अवरोध की खोज करने की क्षमता है.

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		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:192px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
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			<td style="width:267px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
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			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td>
			<td style="width:123px;">Amresco</td>
			<td style="width:135px;">J106-2KG</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:192px;">Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP902-25&#160;</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.fishersci.com/">http://www.fishersci.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:192px;">Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technogolies</td>
			<td>15529-019</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:192px;">All Buffer Salts&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:192px;">Protino Glutathione (GSH) agarose&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:135px;">745500.10</td>
			<td style="width:267px;">Store at 4 &#176;C; http://www.mn-net.com/</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Z-&#8203;Arg-&#8203;Arg-&#8203;7-&#8203;amido-&#8203;4-&#8203;methylcoumarin hydrochloride (Zcoum)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C5429</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:192px;">Chloroamidine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Cayman Chemical&#160;</td>
			<td style="width:135px;">10599</td>
			<td style="width:267px;">Store at -20 &#176;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:192px;">Tris(2-&#8203;carboxyethyl)&#8203;phosphine hydrochloride (TCEP HCl)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientifc</td>
			<td style="width:135px;">20490</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.piercenet.com/">http://www.piercenet.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:192px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;">Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:192px;">Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.tecan.com/">www.tecan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:192px;">Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:135px;">N/A</td>
			<td style="width:267px;"><a href="http://www.perkinelmer.com/">http://www.perkinelmer.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

प्रारंभ में, यह ZRcoum एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में PAD4 की गतिविधि पर रिपोर्ट कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया गया. वेल्स सब्सट्रेट ZRcoum साथ और PAD4 की उपस्थिति / अनुपस्थिति में incubated रहे थे. 475/15 एनएम फिल?...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

एक समर्थक प्रतिदीप्ति सब्सट्रेट एनालॉग के माध्यम से PAD4 गतिविधि के प्रतिदीप्ति आधारित निगरानी

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी द्वारा एंटीफ्रीज प्रोटीन के आइस-बाइंडिंग विमानों का निर्धारण

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

एक तेज सुपर निष्कर्षण विधि के माध्यम से सिलिका Aerogel Monoliths तैयारी

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

सतत प्रवाह प्रसंस्करण का उपयोग किया प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय की निगरानी: एक उदाहरण के रूप में 3-Acetylcoumarin की तैयारी

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl की hydrolysis: एक वर्णमिति विशेष रूप से granzyme बी proteolytic गतिविधि उपाय है कि परख

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

एक विधि सतह ऑक्सीकरण और कमी के माध्यम से एक तरल धातु की सतह तनाव में हेरफेर करने के लिए

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

युगपत और माप के HDAC1 HeLa में HDAC6 गतिविधि कक्ष का उपयोग कर UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

निर्माण और तेजी से सुपरक्रिटिकल निष्कर्षण के माध्यम से तैयार उत्प्रेरक Aerogels का परीक्षण

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

एक सक्रिय सतह वृद्धि तंत्र के माध्यम से सब्सट्रेट-बाउंड Au Nanowires का संश्लेषण

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Two-Step Protocol for Umpolung Functionalization of Ketones Via Enolonium Species

Enolonium प्रजातियों के माध्यम से Ketones के Umpolung Functionalization के लिए एक दो-चरणीय प्रोटोकॉल

&#945;-Functionalization of ketones via umpolung of enolates by hypervalent iodine reagents is an important concept in synthetic organic chemistry. ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

Acetonitrile में एक नवसिखुआ Steglich Esterification के माध्यम से एस्टर्स का संश्लेषण

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...