Name: inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors
Uploaded: 2014-11-14T14:00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors at JoVE.com

We willen graag financiële steun van de MRC UK (G0800498) erkennen. We willen ook graag professor JM Fritschy, Universiteit van Zürich, bedanken voor het verstrekken van de GABA A -R subunit-specifieke γ2 antilichaam en Professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, voor het verstrekken van de pcDNA 3.1 (+) expressie vectoren die de resistentie tegen antibiotica genen voor de productie van stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen.

<ol>
	<li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development.">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li><li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABA+excitatory/inhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders.">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li><li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pharmacology,+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes.">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li><li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+action:+opening+of+ligand-gated+ion+channels.">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li><li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy,+cleft+palate,+and+hypersensitive+behavior.">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li><li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li><li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptor+diversity+and+pharmacology.">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li><li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety.">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li><li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid(A)+receptor+subtypes.">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li><li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles.">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li><li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin.">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li><li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gamma+2+subunit+of+GABA(A)+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses.">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li><li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+GABAA+receptors:+form,+pharmacology,+and+function.">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li><li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits.">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li><li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li><li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA(A)+receptors+in+the+hippocampus.">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li><li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA(A)+receptors.">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li><li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses.">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li><li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex.">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus.">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li><li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha(2)-subunit-containing+GABA(A)+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat.">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li><li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing.">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li><li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organizing+complexes.">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin.">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li><li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation,+maturation,+and+function+of+vertebrate+synapses.">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins.">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li><li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors.">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li><li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses.">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li><li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+GABA(A)+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses.">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li><li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain:+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits.">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li><li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum.">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li><li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures.">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li><li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers.">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li><li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development.">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li><li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development.">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hoewel dit protocol is technisch moeilijk uit te voeren, zijn er verschillende kritische stappen die moeten worden gevolgd om de meest nauwkeurige en herhaalbare co-cultuur assays bereiken. Ten eerste moet kweekmedium stekelige neuronen worden gezaaid met een optimale dichtheid. Als gezaaid te dun, neuronen hebben de neiging om heel langzaam te ontwikkelen en overleving is sterk verminderd. Anderzijds, indien geënt te dicht, neuronen neiging te aggregeren waarop de analyse van contacten met HEK293 cellen compromitteert. Ten tweede wordt aanbevolen tijdelijk drukken een fluorescerende reporter, GFP of mCherry in HEK293 cellen die stabiel tot expressie GABA A Rs vóór platting ze in de co-cultuur. Dit maakt een betrouwbare herkenning van HEK293-cellen, die kunnen worden aangetast door gelijkenis in vorm en grootte van deze cellen en zeldzame overleven glia cel van neuronale kweken. De efficiënte transfectie met GFP of mCherry cDNA bereiken, HEK293 cellijnen moeten in de exponentiële groeifase engeënt op de juiste dichtheid in 6-well platen. Spaarzame seeding gevolgd door transfectie zal veroorzaken cellen slecht groeien, terwijl de over-seeding wordt voorkomen dat de cellen van het opnemen van de cDNA. Idealiter moeten de cellen worden gezaaid zodat ze tussen 70-90% confluent op de dag van transfectie. Ten derde moet transfectie worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt, zoals sommige cellijnen gevoeliger zijn dan de anderen. Dit komt omdat constitutieve GABAA-R expressie in HEK293 cellen vermindert celoverleving en het vermogen van cellen om te herstellen na transfectie. Bovendien overleving afhankelijk van het type van GABA A Rs expressie in HEK293-cellen, met enkele cellijnen significant gevoeliger dan de andere. Transfectie met behulp van liposomaal reagens een optimale methode voor het uitdrukken van vreemde eiwitten in snel groeiende cellijnen, die zowel de hoge transfectie-efficiëntie en het niveau van expressie. Echter, dit reagens veroorzaakt te veel schade langzaam groeiende cellijnen voordie we regelmatig een niet-liposomale transfectie reagens. Dit werkt op dezelfde manier als de liposomale reagens, maar de hoeveelheid DNA die nodig is voor efficiënte transfectie aanzienlijk verminderd. Dit maakt een grotere celoverleving (ongeveer 80-90%, vergeleken met 60% met liposomaal reagens) maar met lagere transfectie efficiëntie (60%). Tenslotte het aantal controle HEK293 of α1 / β2 / γ2 HEK293 expressie brengende cellen toegevoegd aan neuronale kweken moet worden geoptimaliseerd. Toevoegen van te weinig cellen compromitteert de succesvolle analyse van de contacten tussen HEK293 cellen en neuronen, omdat ze zeer zeldzaam geworden. Omgekeerd, het toevoegen van te veel HEK293 cellen veroorzaakt neuronale celdood binnen enkele uren. Embryonale medium stekelige neuron culturen moet idealiter worden bereid met striataal weefsel ontleed uit embryonale leeftijd 15 - 17. Toch gebeurt het vaak dat de embryo&#39;s zijn iets jonger of ouder zijn dan de optimale leeftijd. In dit geval, het aantal neuronen in cultuur geëntmoeten worden gevarieerd. Weefsel dat is jonger dan E15 moet worden geënt op een iets lagere dichtheid, terwijl weefsel dat ouder is dan E17 moet worden gezaaid met een hogere dichtheid, optimale celoverleving toestaan. Bovendien kan cytosinearabinoside (Ara-C) worden toegevoegd aan oudere kweken groei van glia, die meer overvloedig in oudere weefsel voorkomen. Bij het maken van co-culturen, is het belangrijk om het optimale aantal getransfecteerde HEK293 of α1 / β2 / γ2 HEK293 expressie brengen plaat, zoals hierboven vermeld. Echter, kan het nodig zijn om dit te bepalen voor elke cellijn, vanwege verschillen in overleving. Typisch 30.000 cellen in een maximaal volume van 50 ul worden toegevoegd aan elk putje van een 24-putjes, die reeds bevat 500 ul neuronale kweekmedium, aangezien dit ervoor zorgt dat het geconditioneerde medium neuronale niet te veel wordt verdund en dat de voorwaarden binnen elk putje vrij constant blijft, bv </em&gt; De concentratie van groeifactoren. Volumes toevoegen van meer dan 50 pi aan elk putje zou in het algemeen de dood van de neuronen. Een van de grote nadelen van de co-cultuur techniek is dat de neuronale culturen gemaakt van gedissocieerde cellen gekweekt als een monolaag, waardoor de neuronen zijn verwijderd uit hun normale micro en kunnen hun normale anatomische structuur vaststellen. Derhalve missen zij de juiste verbindingen, ingangen en afgescheiden moleculen van andere cellen die de eerste stadia van synapsen ontwikkeling kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, in vivo medium stekelige neuronen dicht geïnnerveerd door glutamaat input van de cortex, thalamus en andere hersengebieden 34 echter in onze neuronale kweken glutamaat synapsen behoren niet omdat deze ingangen worden beschadigd tijdens dissectie van de striatale weefsels. Hoe de afwezigheid van functionele glutamatergische synapsen in gekweekte medium stekelige neuronen affsp hun vermogen om GABA-erge synapsen met elkaar en / of HEK293 cellen die GABAA-Rs vormen blijft een open vraag. Deze vraag kan gemakkelijk worden opgelost door het kweken medium stekelige neuronen met corticale neuronen glutamaat zodat hij met functionele synapsen 35 vóór de toevoeging van HEK293 cellen vormen. Een alternatieve benadering zou zijn om een ​​co-cultuurmodel te ontwerpen gebaseerd op organotypische slice cultures, die enkele van de cytoarchitecture die belangrijk zijn voor rijping en synapsvorming kunnen handhaven. Echter, organotypische slice culturen hebben dichte en heterogene neuropil waarop de analyse hier uitgevoerd in gevaar kunnen brengen. Een ander belangrijk nadeel van het gebruik van co-cultuur assays is dat GABA A Rs uitgedrukt op het oppervlak van HEK293 cellen niet gegroepeerd zoals in neuronen, maar dit blijkt niet noodzakelijk synapsvorming gegeven een voldoende hoge oppervlakte-expressie 30 worden. Bijvoorbeeld, in de rOdent hersenen en in hippocampale culturen, α1 de GABAA-subeenheid R wordt in de meeste GABAerge synapsen alle postsynaptische domeinen van pyramidale cellen. Echter, de α2 specifiek in een subset van synapsen op de somata en dendrieten maar is sterk verrijkt in de axon eerste segment, zoals geopenbaard door immunofluorescentie en elektronenmicroscopie 36. Aangezien synapsvorming in de co-cultuur nog betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd en geanalyseerd 30, suggereert dit dat de dichtheid van GABA A Rs op het celoppervlak van HEK293 cellen vergelijkbaar met of zelfs hoger dan de dichtheid van deze receptoren in synaptische kan clusters in neuronen. Dit kan verklaren, althans gedeeltelijk, waarom synaptische adhesie-eiwitten, zoals neuroligin en postsynaptische dichtheid eiwitten, zoals gephyrin, niet noodzakelijk synapsvorming in de co-cultuur, wanneer het geschikt geassembleerde GABAA-R aanwezig zijn in voldoende dichtheid. Het is goed gedocumenteerd dat GABA A R structureel en functioneel heterogene, en dat de receptor subunit samenstelling bepaalt de subcellulaire lokalisatie en farmacologische eigenschappen. Bijvoorbeeld wordt de opname van 2 subeenheden bekend als een voorwaarde voor de synaptische lokalisatie van GABA A Rs terwijl de subeenheid vrijwel uitsluitend aanwezig in extrasynaptic GABAA-Rs. De receptoren die nemen alleen αβ combinaties worden ook gedacht aan voornamelijk worden gelokaliseerd aan de extrasynaptic domeinen 12- 14. Of dit specificiteit wordt gehandhaafd in onze co-kweeksysteem kan eenvoudig worden getest door tijdelijk transfecteren 2 of subeenheid cDNAs in HEK293-cellijnen die stabiel α en β-subeenheden, alvorens ze toe te voegen aan neuronale culturen. Onze voorlopige experimenten met deze benadering suggereren dat synaptische contacten gemakkelijk worden alleen gevormd in aanwezigheid van de 2 subunit, wat aangeeft dat de specificity waargenomen in vivo waarschijnlijk in vitro te behouden (gegevens niet getoond). Bovendien worden GABAA Rs waarin verschillende α subeenheden selectief gelokaliseerd synaptische contacten gevormd met specifieke soorten presynaptische neuronen. Bijvoorbeeld, in de globus pallidus, de α1-GABA A R&#39;s meestal aangetroffen striatopallidal (str-GP) en palliopallidal (GP-GP) synapsen, die zich op dendrieten en somatische gebieden van het medium stekelige neuronen, respectievelijk. De α3-GABA A R&#39;s zijn gevestigd in perisomatic regio van medium stekelige neuronen en in contact komen met de plaatselijke huisarts axon collateralen, terwijl de α2-GABA A R&#39;s bevinden zich aan distale dendrieten van deze neuronen en vooral gecontacteerd door de input van het striatum 32. Expressie van specifieke α subeenheden in verschillende synapsen en in verschillende neuronale compartimenten is ook aangetoond in andere hersengebieden zoals hippocampus 21 en neocortex 18,20. Deze bevindingen doen de vraag hoe de specifieke remmende synapsen zijn gevormd in de hersenen. Heeft de hechting van een specifiek type van presynaptische terminal induceren de invoeging van specifieke GABA A R subtypen in de punten van contact? Zijn de receptoren verhandeld specifieke subcellulaire locaties volgens hun subunit samenstelling, waarbij de plasmamembraan insertie is een voorwaarde voor de adhesie van axonale terminals bepaalde oorsprong? Tot op heden zijn deze vragen onbeantwoord. Het gebruik van verlaagde modelsystemen zoals de co-cultuurmodel systeem, kunnen we beginnen beantwoorden van deze complexe vragen omdat het systeem lastig om transfectie van DNA constructen en toepassing van reagentia en, belangrijker, is het geschikt voor live cell beeldverwerkingsanalyses 30. Dus, door dit modelsysteem we beginnen testen van de rol van individuele moleculen, waaronder verschillende soorten GABA A Rs, weetn aanwezig te zijn bij synaptische contacten zijn. Een ander voordeel is dat synapsen in dit modelsysteem vorm snel, binnen enkele minuten tot uren, waardoor de duur van de experimenten. Vergelijkbare co-cultuurmodel systemen succesvol gebruikt in het verleden om te screenen op de nieuwe synaptogenic moleculen 27,37,38. Begrijpen hoe het centrale zenuwstelsel ontwikkelt, rijpt en vormen verbindingen tussen neuronen zo ingewikkeld om de controle, bijvoorbeeld, gedrag of cognitie, is van fundamenteel belang. Deze afstand doel alleen bereikt door afbakening van de moleculaire mechanismen die de stappen van herkenning en cel-cel communicatie regelen tijdens de ontwikkeling. Vanwege enorme complexiteit, kan de moleculaire details van deze meervoudige cellulaire interacties momenteel bestudeerd worden met precisie slechts in verminderde systemen. De mogelijkheid om de complexiteit van deze systemen verhogen door expressie meervoudige combinaties van eiwitten en bestuderen hoeze interageren heeft een aantal voordelen in vergelijking met bijvoorbeeld genetische deletie benaderingen. Dit is omdat nauwkeurige interpretatie van de effecten van een enkel gen deletie wordt vaak aangetast door veranderingen geassocieerd compenserende mechanismen maskeren van de effecten van oorspronkelijke laesies, vooral in de zich ontwikkelende hersenen. De eenvoudige maar informatieve co-cultuur techniek beschreven is toegestaan ​​een ontdekking van de structurele rol van GABA A Rs in synapsvorming en opende de mogelijkheid te onderzoeken hoe GABA A Rs en andere celadhesie moleculen en / of synaptische matrixeiwitten met elkaar tijdens synaptogenese. Synaptische matrixeiwitten van bijzonder belang omdat zij onlangs aangetoond een belangrijke rol bij de glutamaterge synapsvorming 39 spelen. Verdere ontwikkeling van co-cultuur modellen is belangrijk omdat ze de potentie hebben om onze kennis van de moleculaire mechanismen die leiden de &#39;normale &amp; vooruit# 8217; hersenontwikkeling en verhogen ons begrip van deze mechanismen worden veranderd in veel neurologische aandoeningen, zoals epilepsie, schizofrenie, autisme spectrum stoornissen en vele anderen.

GABA is een van de oudste neurotransmitters in de embryonale hersenen, vóór de meest voorkomende excitatoire neurotransmitter glutamaat 1. Tijdens de ontwikkeling, GABA depolariseert en prikkelt onvolwassen neuronen spelen een belangrijke rol in de regulering van celproliferatie, migratie en vorming van neuronale netwerken zonder induceren excitotoxiciteit. In de volwassen hersenen, is de omkeringspotentiaal voor GABAA-receptor kanalen verschoven naar meer negatieve potentialen door een afname in de intracellulaire concentratie van chloride. Deze verschuiving wordt veroorzaakt door de up-regulatie van de kalium-chloride co-transporter (KCC2), die chloride transporteert uit de cel, en, in parallel, down-regulatie van de natrium-kalium-chloride transporter (NKCC1), die heeft het tegenovergestelde effect 2. In de hersenen, GABA voornamelijk bindt aan zowel GABA A of B GABA receptoren snelle of langzame synaptische remming bemiddelen, respectievely. GABAA-Rs zijn een klasse van receptors ook bekend als heteropentamere ionotrope of ligand-gated Cys-lus ionkanalen. Twee moleculen van GABA zijn vereist voor de activering van de receptor, dat doorlaatbaar is voor chloride-ionen en in mindere mate, bicarbonaat ionen. De toename chloride conductantie vermindert de doeltreffendheid van depolariserende, prikkelende gebeurtenissen activeren het postsynaptische neuron 3. Structurele diversiteit van GABA A Rs is al lang erkend als een belangrijke factor in het bepalen van hun breed scala aan functionele en farmacologische eigenschappen. Inheemse GABA A Rs zijn hetero-pentameren samengesteld uit subeenheden met meerdere isovormen ingedeeld: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π en θ 3, met een gemeenschappelijke transmembraan topologie omvattende een groot N-terminaal extracellulair domein, vier transmembraandomeinen (TM), en een grote intracellulaire domein van TM 3 en 4 4. Deβ3 en γ2 subeenheden zijn essentieel voor synaptische inhibitie en organisme overleven, omdat muizen met genetische verwijdering van deze subeenheden na de geboorte sterven 5,6. Daarentegen individuele isovormen van α subeenheid zijn belangrijk voor de functie van specifieke synaptische verbindingen in de hersenen geassocieerd met verschillende gedragingen zoals angst, sedatie, opwinding, en anderen, maar zijn niet individueel, essentieel voor het leven 7-9. GABAA-Rs zijn de belangrijkste plaatsen van werking voor verschillende geneesmiddelen met krachtige kalmerend, hypnotische, anxiolytische en anticonvulsieve effecten, zoals benzodiazepinen, barbituraten, neurosteroids en anesthetica 7,10,11. Synaptische GABA A Rs bevatten typisch een γ2 subeenheid, twee β subeenheden (meestal β2 en β3) en twee α subeenheden (α1, α2, α3 of α5) 12,13. De overheersende klasse van extra-synaptische receptoren bevat de δ subunit in combinatietwee α subeenheden (α4 of α6) en twee β subeenheden (β2 of β3) 14. Subcellulaire lokalisatie van GABA A Rs tot de neuronen, dendrieten of soma, en insertie in de plasmamembraan zijn afhankelijk van de aanwezigheid van β-subeenheden 15,16. Echter, selectieve opname van verschillende GABA A R subtypes in verschillende typen synapsen goed correleert met de aanwezigheid van specifieke α subeenheden (α1, α2, α3 of α5) 7,17,18. Belangrijk deletie van α1 en α2 subeenheid van muizen veroorzaakt ultrastructurele veranderingen op remmende synapsen 19. Dit suggereert dat GABA RS zelf kan een directe rol spelen bij het ​​reguleren synapsvorming. Aanwijzingen dat GABAerge synaps ontwikkeling een nauwkeurig gecoördineerd reeks gebeurtenissen, waarbij zowel de neuronale doelen gecontacteerd door verschillende soorten remmende axonen en de receptoren die piekt aanelke klasse van remmende synapsen zijn selectief en functioneel afgestemd 17,20-22. Dit fundamentele beginsel van specificiteit bij GABAergic synapsen werpt de vraag op hoe de pre- en postsynaptische partners herkennen elkaar tijdens de inleiding van synaptische contacten. In vitro co-kweek tests met succes toegepast op sommige van de mechanismen van synapsvorming bestuderen en de rol van individuele synaptische spleet-spanning eiwitten testen in dit proces. Een van de gemeenschappelijke trans-synaptische interactie eiwit combinaties die bi-directioneel te synaps vorming en rijping bemiddelen functioneren, zijn de neurexins (Nrxns) en neuroligins (NLS). Nrxns zijn presynaptische eiwitten die alternatieve splicing vertonen in hun laminine-neurexin-geslachtshormoon bindend eiwit domeinen die tot verschillende isovormen 23. Terwijl de Nrxns ook interactie met andere eiwitten, zijn NLS gedacht om hun alomtegenwoordige postsynaptische pa zijnRTNERS 24. Samen vormen deze eiwitten bijdragen aan het vasthouden van de presynaptische en postsynaptische membranen in nauwe en rigide appositie 25. De twee meest voorkomende isovormen NL-1 en NL-2 die aanwezig prikkelende en remmende synapsen, respectievelijk 26 zijn. Een van de eerste co-cultuurmodel systemen, die trans-synaptisch eiwit interacties te onderzoeken, toegepast verschillende soorten niet-neuronale cellen, meestal onsterfelijke cellijnen zoals humane embryonale nier (HEK) 293-cellen tot overexpressie NL- 2. Wanneer deze cellen werden gekweekt met pontine neuronen, werd een accumulatie van presynaptische eiwitten in de nabijheid van het oppervlak van de HEK cellen waargenomen, wat aangeeft vorming van synapsen-achtige contacten. Toevoeging van oplosbaar β-neurexin deze co-kweken remde de vorming van contacten, suggereert dat trans-synaptische interacties tussen Nrxns en NLS nodig synaptische contact wordt 27 zijn. Bovendien transiënte expressievan β-neurexin in COS (C V-1 (mensaap) in O rigin, en het dragen van de S V40 genetisch materiaal) cellen samen gekweekt met gedissocieerde hippocampus Glu en GABA-erge neuronen geïnduceerde expressie van de postsynaptische eiwit gephryin en van GABA A R subeenheden γ2 en α2 bij raakpunten tussen deze twee cellen vormen 28. Een ander voorbeeld van een co-cultuurmodel gebruikt synapsvorming studie betrokken HEK293 cellen tijdelijk getransfecteerd met GABA A R subeenheden α2 / β3 / γ2 en NL-2, en een gemengde populatie van neuronen van de hypothalamus 29. De conclusie dat de expressie van NL-2 is een absolute vereiste voor de vorming van remmende synapsen. Echter, in de laatste co-cultuur onderzoek stabiel getransfecteerd α1 / β2 / γ2 GABAA Rs in HEK293 cellen bleken voldoende functionele synapsen te induceren wanneer samen gekweekt met GABAerge medium stekelige neuronen, zonder extra trans-synaptische of postsynaptische adhesie-eiwitten. Echter, een belangrijke verhoging van synapsvorming en kracht waargenomen wanneer NL-2 werd co-expressie gebracht met GABAA-Rs 30. Dit geeft aan dat de co-cultuurmodel systeem heeft voordelen boven eerder beschreven modelsystemen, meest duidelijk een verhoogde gevoeligheid en betrouwbaarheid van synaptische contacten detectie. Twee belangrijke factoren die bijdragen aan de algehele verbetering in detectie van synaptische contacten: i) het gebruik van stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen met een hoge en consistente expressie van GABA A R subeenheden op het oppervlak van afzonderlijke cellen. Deze consistentie vergemakkelijkt kwantitatieve vergelijkingen tussen verschillende co-kweekomstandigheden. ii) Het gebruik van een zuivere populatie van GABAerge medium stekelige neuronen gekweekt uit de embryonale striatum 31 verwijdert complicaties en dubbelzinnigheden door het gebruik van gemengde neuronale populaties en allows bijvoorbeeld selectie van de meest geschikte postsynaptische GABA A R die kunnen worden vergeleken met elkaar tijdens synapsvorming. Vorming van synapsen wordt dat vele trans-synaptische signalen in pre- en postsynaptische cel adhesie complexen omvatten. Door de bi-directionele aard van synaptische signalering en de enorme aantallen van celadhesie moleculen, is het moeilijk om belangrijke componenten betrokken bij synapsvorming identificeren. Aldus transfecteren van een cel adhesie eiwit in een niet-neuronale cellen (in dit geval, de twee meest voorkomende postsynaptische targets voor GABAergic medium stekelige neuronen in vivo, α1 / β2 / γ2 of α1 / β3 / γ2 GABA A R 32) sterk vermindert de complexiteit van trans-synaptische signalen beschikbaar bij de postsynaptische oppervlak en maakt een nauwkeurige kwantitatieve analyse van de werkzaamheid van dit eiwit bevorderen synapsvorming.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Het protocol voor deze neuron-HEK293 cel co-cultuur model systeem is volledig afgestemd op een optimale overleving van de cel mogelijk te maken. In dit systeem, vorming van synaps-achtige contacten en hun analyse berust op een stabiele en consistente expressie van alle drie de GABA A R subeenheden die assembleren tot een functionele receptor. Het is daarom belangrijk om immunocytochemische analyse gebruiken om te testen voor subeenheid expressie op het oppervlak van HEK293 cellen alvorens te voegen aan neuronale culturen. In deze experimenten celoppervlak expressie van α1, β2 en γ2 subeenheden (Figuur 1A) of α1, β3 en γ2 subeenheden (Figuur 1B), werd gedetecteerd onder gebruikmaking subunit antilichamen die binden aan het extracellulaire epitopen van deze subeenheden. Een hoge mate van co-lokalisatie tussen deze subeenheden in de HEK293 oppervlak aangetoond. Na de oppervlakte-expressie en co-lokalisatie van GABA A bevestigtR subeenheden in HEK293-cellen, co-kweken werden bereid met HEK293-cellen die α1 / β2 / γ2 GABA A R subeenheden en medium stekelige neuronen gekweekt gedurende 14 dagen (14 dagen in vitro (DIV)). Cellen in co-kweek werden gedurende 24 uur, gefixeerd en met behulp van immunocytochemie en confocale microscopie geanalyseerd. Analyse contacten aangegeven dat GAD65 positieve GABAerge axon terminals gevormd sporadisch contacten met de controle HEK293-cellen (Figuur 2A, 2B). Het aantal contacten gedetecteerd 4 uur was 7,3 ± 0,9 per HEK293 cel, en dit aantal werd verminderd tot 5,5 ± 0,5 verbindingen (gemiddelde ± SEM) per HEK293 cellen 24 uur na het toevoegen van HEK293 cellen aan de gekweekte neuronen. In contrast, GAD65-positieve GABAergic axon terminals gevormd tal synaps-achtige contacten met HEK293 cellen die GABA A Rs. Het aantal contacten verkregen 4 uur na toevoeging van HEK293-cellen was 28,3 ± 4,7 per HEK293 cel en dit aantal verdere stijgingd 52,1 ± 6,3 (gemiddelde ± SEM) per HEK293 cel bij 24 uur in co-kweek (Figuur 2A, 2B). Om te bepalen of deze synaps-achtige contacten waren &#39;actief&#39; ie ondersteund vesiculaire transmitter release, werd een vesikel-luminale domein-specifieke anti-synaptotagmin Cy5 geconjugeerd antilichaam aan de co-kweekmedium toegevoegd na 23 uur incubatie. Dit antilichaam wordt alleen opgenomen in presynaptische zenuwuiteinden wanneer een porie vormen tussen het synaptische vesikel lumen en de extracellulaire vloeistof in de synaptische spleet tijdens neurotransmitter release. Na afgifte, de poriën sluit, waardoor de synaptotagmin Cy5-geconjugeerd fluorescerend antilichaam aan synaptotagmin in het blaasje. Op deze wijze worden alleen de vesicles actief in neurotransmitter afgifte gelabeld met het antilichaam. In deze experimenten weinig of geen contact tussen de controle HEK293 cellen en het medium stekelige zenuwuiteinden waren actieve &amp; #8217; zoals getoond door het gebrek aan co-localisatie tussen de presynaptische GAD65 / synaptotagmin fluorescentie en mCherry fluorescentie in HEK293-cellen (Figuur 3A). Daarentegen werden veel &quot;actieve&quot; contacten gevormd tussen het medium stekelige zenuwuiteinden en α1 / β2 / γ2 expressie HEK293 cellen, hetgeen blijkt uit de hoge mate van co-localisatie van GAD65 / synaptotagmin en mCherry uitgedrukt bijzonder in HEK293-cellen ( figuur 3B). Om te testen of een ander subtype van GABA A R ook kunnen bevorderen synaps-achtige formatie in vitro, hebben we samen gekweekt α1 / β3 / γ2 uiten HEK293 cellen met medium stekelige neuronen. Nogmaals, controle HEK293 cellen zelden ontvangen contacten met synapsin-positieve presynaptische terminals bereiken 10,8 ± 0,48 (gemiddelde ± SEM) contacten per HEK293 cel na 24 uur in co-cultuur (Figuur 4A links, 4B). Echter, HEK293 cellen dieα1 / β3 / γ2 GABA A Rs vorm significant meer synaps-achtige contacten met synapsin-positieve presynaptische terminals van medium stekelige neuronen bereiken van 25,3 ± 0,27 (gemiddelde ± SEM) contacten per HEK293 cel na 24 uur in co-cultuur (Figuur 4A rechts, 4B). Dit geeft aan dat α1 / β3 / γ2 GABAA-R tot expressie gebracht in HEK293-cellen kunnen ook synaptische contacten vorming bevorderen, hoewel hun vermogen lager is dan de sterkte van α1 / β2 / γ2 bevattende GABA A Rs. Deze experimenten geven aan dat de co-cultuurmodel ontwikkeld in ons laboratorium maakt kwantitatieve analyse van synaptische contacten vorming in vitro en de beoordeling van de effectiviteit van verschillende subtypes van GABAA-Rs in dit proces. Deze experimenten demonstreren verder dat GABAA-Rs, naast kritiek functionele componenten van GABAerge synapsen, kan een belangrijke rol spelenin het proces van herkenning en vorming van synaptische contacten tussen remmende neuronen en neuronale geschikte doelcellen, onafhankelijk van andere synaptische adhesie-eiwitten. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Figuur 1. Immunocytochemische analyse van expressie van GABA A R α1 / β2 / γ2 of α1 / β3 / γ2 in HEK293 stabiele cellijnen. Antilichamen die de extracellulaire domeinen van GABA A R subeenheden werden gebruikt label receptoren tot expressie op het celoppervlak. ( A) HEK293 cellijn die α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) en γ2 (Cy5) op een hoog niveau. (B) HEK293 cellijn die α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) en γ2 (Cy5)subeenheden op een hoog niveau. Schaal bar:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Figuur 2. GABAergische medium stekelige neuronen vormen synaps-achtige contacten met α1 / β2 / γ2- uiten HEK293 cellen in co-cultuur. (A) TL-etikettering van presynaptische terminals met anti-GAD65 antilichamen (in het groen) en HEK293 cellen met mCherry (in rood, links) of de GABA A R γ2 subunit (in blauw, rechts), onthulde punten van co-localisatie tussen deze markers aangeeft vorming van synapsen-achtige contacten na 4 of 24 uur in co-cultuur. Schaal bar: 10 pm (B) Kwantitatieve analyse van synaps-achtige co.<html> ntacts. HEK293 cellen werden geïdentificeerd op basis van hun vorm zoals blijkt uit DIC imaging en / of mCherry expressie en het aantal contacten tussen GAD-65 positieve puncta (groen) en het oppervlak van HEK293 cellen werd geteld door gaten in elke optische deel van een Z-stack series (8-10) per cel met de beeldvormende software, en uitgedrukt als het aantal contacten / cel. De grafiek toont het aantal contacten tussen medium stekelige neuronen en controle HEK293 cellen (lichtgrijs) of α1 / β2 / γ2-HEK293 cellen (zwarte) na 4 en 24 uur in co-cultuur (gemiddelde ± SEM; n = 8 in elke toestand van twee onafhankelijke experimenten). Dit cijfer is gewijzigd van Fuchs et al. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <html> ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figuur 3. GABA A Rs bevorderen vorming van actieve synaptische contacten. Immunolabeling van synaps-achtige contacten gevormd na 24 uur in co-cultuur tussen medium stekelige neuron terminals positief voor GAD65 (Alexa Fluor 405 cyaan) en (A) controle HEK293 cellen, of (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 cellen, zowel tijdelijk met mCherry construct (rood). Actieve contacten worden geïdentificeerd door co-localisatie tussen de vesikel luminale domein-specifieke anti-synaptotagmin antilichaam (Cy5) en GAD65 specifiek antilichaam zowel in presynaptische terminals en mCherry expressie in HEK293 cellen. Schaal bar:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> igure 4 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figuur 4. GABAergische medium stekelige neuronen vormen synaps-achtige contacten met α1 / β3 / γ2- subunit uiten HEK293 cellen in co-cultuur. (A) Fluorescent labeling van presynaptische terminals met anti-synapsin I antilichamen (groen), en controle HEK293-cellen (links) of α1 / β3 / γ2 expressie HEK293 cellen tijdelijk getransfecteerd met zowel mCherry (rood), geopenbaarde punten co-localisatie tussen deze markers hetgeen de vorming van synapsen-achtige contacten na 24 uur in co-cultuur. Schaal bar: 10 pm (B). Kwantitatieve analyse van de synaps-achtige contacten. HEK293-cellen werden geïdentificeerd door expressie mCherry en het aantal contacten tussen synapsin I-positieve puncta (groen) en het oppervlak van HEK293 cellen werd geteld door gaten in elk gedeelte van een optische Z-stapel series (8-10) per cel met behulp van imaging-software, en uitgedrukt als het aantal contacten / cel. De grafiek toont het aantal contacten tussen medium stekelige neuronen en controle HEK293 cellen (lichtgrijs) of α1 / β3 / γ2-HEK293 cellen (zwarte) na 24 uur in co-cultuur (gemiddelde ± SEM, n = 8-12 cellen in elke aandoening, van twee onafhankelijke experimenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors at JoVE.com

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptoren

De moleculaire mechanismen die de coördinatie van de vorming van remmende GABA-erge synapsen tijdens ontogenie zijn grotendeels onbekend. Om deze processen te onderzoeken, hebben we een co-cultuurmodel systeem dat embryonale medium stekelige GABAerge neuronen samen gekweekt met stabiel getransfecteerde humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen die functionele GABAA-receptoren omvat ontwikkeld.

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

Het testen van oppervlakte-expressie van receptoren Chemosensory in heterologe cellen

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Een Functionele Motor-eenheid in de cultuur Dish: Co-cultuur van het ruggenmerg Explantaten-en spiercellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primaire cel cultuur van gezuiverde erge of glutamaterge neuronen opgericht door fluorescentie-geactiveerde cel sorteren

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...