Name: inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors
Uploaded: 2014-11-14T14:00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors at JoVE.com

私たちは、MRC英国（G0800498）からの財政支援に感謝し。我々はまた、抗生物質耐性を含むをpcDNA 3.1（+）発現ベクターを提供するために、GABA A -Rサブユニット固有のγ2抗体および教授R·ハーベイ、薬局のUCLスクールを提供するため、教授JM Fritschy、チューリッヒ大学に感謝したいと思います安定にトランスフェクトされたHEK293細胞株の産生のための遺伝子。

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The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルは実行することが技術的に困難ではありませんが、最も正確で再現性の共培養アッセイを達成するために従わなければならない、いくつかの重要なステップがあります。まず、培養された中型有棘ニューロンは、最適な密度で播種されなければならない。あまりにまばらに播種した場合、ニューロンは、非常にゆっくりと進行する傾向があり、生存率が大幅に低減される。あまりにも密に播種一方、ニューロンは、HEK293細胞との接触の分析を損なうどの凝集する傾向がある。第二に、それは一過性に安定的に前に共培養にそれらをplattingに、GABA Aルピーを発現するHEK293細胞中の蛍光レポーター、GFPまたはmCherryを表現することをお勧めします。これは、神経細胞培養中のこれらの細胞および希生き残っグリア細胞間形状および大きさの類似性が損なわれることがありHEK293細胞の信頼性の高い認識を可能にする。 GFPまたはmCherryをcDNAと効率的なトランスフェクションを達成するために、HEK293細胞株は指数増殖期にある必要と6ウェルプレート中の適切な密度で播種した。トランスフェクションに続いてスパース播種はオーバーシーディングのcDNAを取ってから細胞を防ぐことができますしながら、細胞は、成長が悪いことになります。トランスフェクションの当日に90％コンフルエント - 彼らは70との間になるように理想的には、細胞が播種されるべきである。いくつかの細胞株は他のものより敏感であるように第三に、トランスフェクションは、使用される各細胞株について最適化されなければならない。 HEK293細胞における構成的GABA A Rの発現が細胞の生存およびトランスフェクション後に回復する細胞の能力を低下させるためである。さらに、生存はGABA A Rの種類に依存し、いくつかの細胞系は他のものより有意に敏感であると共に、HEK293細胞で発現。リポソーム試薬を用いてトランスフェクションは、発現の高いトランスフェクション効率およびレベルの両方を提供し、急速に成長している細胞株において外来タンパク質を発現させるための最適な方法である。しかし、この試薬をゆっくりために、細胞株を成長させるためにあまりにも多くの損傷を引き起こすどの我々は定期的に非リポソームトランスフェクション試薬を使用しています。これは、リポソーム試薬と同様に動作しますが、効率的なトランスフェクションのために必要なDNAの量が大幅に低減される。 （ - 90％60％がリポソーム試薬を使用した場合に比べて約80）が、低いトランスフェクション効率（60％）でこれは大きな細胞の生存を可能にする。最後に、制御HEK293またはニューロン培養物に添加α1/β2/γ2HEK293発現する細胞の数を最適化する必要がある。彼らは非常にまれになっているのであまりにも少数の細胞を追加すると、HEK293細胞とニューロン間の接触に成功し分析を損なう。逆に、あまりにも多くのHEK293細胞を添加して数時間以内に神経細胞死を引き起こす。 胚の中型有棘ニューロン培養物は、理想的には、胚の年齢15から解剖線条体組織を用いて調製されるべきである - しかし17、それはしばしば胚は、最適な年齢より少し若い歳以上であることが起こる。この場合、ニューロンの数は、培養物に播種意志変化させる必要がある。 E15よりも若いです組織は、E17は、最適な細胞の生存を可能にするために、より高い密度で播種する必要があるかもしれないより古い組織しながら、わずかに低い密度で播種する必要があるかもしれません。さらに、シトシンアラビノシド（Ara-C）は、古い組織においてより豊富であるグリア細胞の成長を防止するために、古い培養物に添加する必要があるかもしれない。 共培養物を作成する際に上述したように、それは、トランスフェクトされたHEK293またはα1/β2/γ2HEK293発現する細胞の最適な数をめっきすることが重要である。しかし、それは、それらの生存率の違いにより、各個々の細胞株のためにこれを決定する必要があるかもしれない。この馴化ニューロン培地はあまり希釈し、条件ことないことを保証するように、典型的に50μlの最大容量で30,000細胞は、すでにニューロン培養培地500μlを含んでいる24ウェル皿の各ウェルに添加されるべきである各ウェル内、 例えばかなり一定のまま</em&gt;成長因子の濃度。各ウェルに50μlを上回るボリュームを追加すると、一般的にニューロンを殺す。 共培養技術の主な欠点の1つは、神経細胞培養は、ニューロンがその正常な微小環境から除去され、それらの正常な解剖学的組織を確立することができないされていることを意味する単層として増殖させ、解離した細胞から作成されることである。したがって、それらは、シナプスの発達の初期段階に影響を及ぼし得る他の細胞からの適切な接続、入力および分泌された分子を欠いている。例えば、in vivoでの中型有棘ニューロンが密にグルタミン酸作動性皮質からの入力、視床や他の脳領域34によって支配されているこれらの入力は、線条体組織の切開中に損傷されているので、しかし、私たちの神経細胞培養グルタミン酸作動性シナプスでは形成しない。どのように培養された中型有棘ニューロンにおける機能グルタミン酸作動性シナプスの不在はAFFクト互いに、および/ ​​またはGABA AのRを発現しているHEK293細胞とGABA作動性シナプスを形成する能力は、未解決の問題のままである。この質問は容易に皮質グルタミン酸作動性ニューロンは、それによって、それらを35の前HEK293細胞の添加に機能的シナプスを形成させるとともに、中型有棘ニューロンを培養することによって対処することができる。別のアプローチは、成熟およびシナプス形成のために重要であり得る細胞構築の一部を維持する器官型スライス培養に基づく共培養モデル系を設計することであろう。しかし、器官切片培養は、ここで行われた分析が損なわれる可能性が緻密かつ異種の神経網を持っている。これは十分に高い表面発現30を与えシナプス形成に必要でないように見えるが、共培養アッセイを使用することの別の重要な欠点は、GABA A Rは、それらが神経細胞内にあるようにクラスタ化されていないHEK293細胞の表面で発現されるということである。例えば、rの中odent脳と海馬培養において、α1、GABA AのRサブユニットは、錐体細胞のシナプス後のすべてのドメイン上で最もGABA作動性シナプスで発見されている。しかし、α2は、具体的には細胞体と樹状突起上のシナプスのサブセットに位置しているが、免疫蛍光および電子顕微鏡36によって明らかにされたように、軸索の初期セグメントで非常に濃縮されている。共培養におけるシナプス形成が依然として確実に検出することができることを考えると30分析し、これは、HEK293細胞の細胞表面でのGABA A Rs の密度は、シナプス内のこれらの受容体の密度よりも同様に、またはそれ以上であることを示唆しているニューロン内のクラスタ。これが適切に組み立てられたGABA A Rs が十分に存在する場合、少なくとも部分的には、なぜそのようなニューロリギンシナプス接着タンパク質、およびそのようなgephyrinなどのシナプス後肥厚タンパク質は、共培養においてシナプス形成に必要ではなく、説明することができ密度。 これはよく、GABA A Rs は構造的および機能的に不均一であることを文書化され、かつ受容体サブユニット組成物は、それらの細胞内局在および薬理学的特性を決定する。サブユニットは、ほぼ独占的に存在する領域外GABA A Rs のであるが、例えば、2サブユニットの組み込みは、GABA A Rのシナプス局在化のための前提条件であることが知られている。組み合わせのみαβ組み込む受容体はまた、主にシナプス外ドメイン12- 14に局在していると考えられている。この特異性は、我々の同時培養系で維持されているか否かを容易に一過性ニューロン培養物に追加する前に、安定してαおよびβサブユニットを発現するHEK293細胞株に2又はサブユニットのcDNAをトランスフェクトすることによって試験することができる。このアプローチを使用して我々の予備実験では、シナプス結合が容易にspeciことを示す、2つだけのサブユニットの存在下で形成されていることを示唆しているin vivoで観察ficity、インビトロで維持される可能性がある（データは示さず）。 さらに、異なるαサブユニットを組み込んGABA A Rs が選択的に、シナプス前ニューロンの特定のタイプで形成されたシナプスの連絡先に局在している。例えば、淡蒼球内、α1-GABA A Rs は 、一般的に線条体淡蒼球（STR-GP）で発見され、それぞれ、中型有棘ニューロンの樹状突起および体領域の上に配置されているpalliopallidal（GP-GP）シナプス、。 α3-GABA A Rs は中型有棘ニューロンのperisomatic地域に位置しており、これらのニューロンの遠位樹状突起上に位置し、線条体32からの入力によって主に接触されるα2-GABA A Rs をしながら、地元のGP軸索担保によって接触される。シナプスの異なるタイプ及び異なるニューロンコンパートメントにおける特定のαサブユニットの発現はまた、ヒップなどの他の脳領域において実証されているocampus 21と18,20新皮質。これらの知見は、特定の抑制性シナプスは、脳内に形成されているどのように問題を提起する。シナプス前終末の特定のタイプの接着は接触点に特定のGABA A Rサブタイプの挿入を誘導していますか？受容体は、それらの形質膜挿入は、特定の起源の軸索の端末の接着のための前提条件である彼らのサブユニット組成によれば、特定の細胞内位置に人身売買されていますか？現在までに、これらの問題は未解決のままである。このような共培養モデル系として縮小モデル系の使用は、システムが重要なのは、DNA構築物および試薬の適用のトランスフェクションを容易に適しているとので、私たちは、この複雑な質問への回答を開始することができ、それは、生細胞イメージングの分析に適して30。したがって、我々は、GABA A Rs の異なるタイプを含む個々の分子の役割のテストを開始することができ、このモデル系を使用して、知っているnはシナプスの連絡先に存在することができます。別の利点は、数分から数時間以内に急速にこのモデル系の形のシナプスは、実験の持続時間を減らすことである。同様に共培養モデル系が正常に新規のシナプス分子27,37,38をスクリーニングするために過去に使用した。 中枢神経系は、制御、例えば、行動や認知に非常に複雑にニューロン間の接続を、開発し成熟し、フォームを理解、基本的に重要である。この遠い目的は、開発中に認識および細胞間通信の個々のステップを支配する分子メカニズムの輪郭を描くことによって達成される。による複雑性のために、これらの複数の細胞の相互作用の分子的詳細は現在、縮小システムに精度で調べることができる。しかし、能力は、タンパク質の複数の組み合わせを表現する方法、および研究することによって、これらのシステムの複雑さを増加させるそれらは、例えば、遺伝子欠失のアプローチと比較していくつかの利点を有する相互作用する。単一の遺伝子欠失の効果の正確な解釈は、多くの場合、特に発達中の脳において、元の病変の影響をマスクする代償機構に伴う変化に影響されるためである。ここで説明するシンプルで有益な共培養技術は、シナプス形成におけるGABA A Rの構造的役割の発見を可能にし、GABA A Rs と他の細胞接着分子および/ ​​またはシナプスマトリックスタンパク質が相互作用するかを検討する可能性を開いているシナプス形成の間。シナプスマトリックスタンパク質は、それらが最近グルタミン酸作動性シナプス形成39において重要な役割を果たすことが実証されていることを考えると特に重要である。これらは「通常＆ガイド分子機構の知識を前進させる可能性があるため、共培養モデルのさらなる開発は重要である＃8217;したがって、脳の発達とは、これらのメカニズムは、例えば、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害や他の多くのような多くの神経発達疾患において変化している方法についての我々の理解を向上させる。

GABAは、最も豊富な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸1に先行する胚の脳に見られる最も初期の神経伝達物質の一つである。開発中に、GABAは、興奮毒性を誘導することなく、細胞の増殖、遊走および神経回路網の形成を調節する上で重要な役割を果たし、未熟ニューロンを脱分極して励起する。成体の脳では、GABA A受容体チャネルのための逆転電位に起因塩化物の細胞内濃度の低下をより負電位にシフトする。このシフトは、並行して、アップレギュレーション細胞から塩化物を輸送する塩化カリウム、塩化カルシウム共輸送体（KCC2）のによって引き起こされ、ダウンレギュレーションがあり、ナトリウム - カリウム - 塩化物輸送体（NKCC1）の逆の効果2。 脳では、GABAは主に、それぞれ、高速または低速シナプス抑制を媒介するために、GABA AまたはGABA B受容体のいずれかに結合し、LY。 GABA A Rs はまた、ヘテロ五イオンチャネルまたはリガンド依存性のCysループイオンチャンネルとして知られている受容体のクラスである。 GABAの二つの分子は、重炭酸イオン、塩化物イオン、およびより少ない程度に透過性であり、受容体の活性化に必要である。クロライドコンダクタンスの増加は、シナプス後ニューロン3の活性化に脱分極、興奮するイベントの有効性を低下させる。 GABA A Rの構造的多様性は、長い機能的および薬理学的特性のそれらの広い範囲を決定する際の重要な因子として認識されている。共通で、α（1-6）、β（1-3）、γ（1-3）、δ、ε、π、θ3：ネイティブGABA A Rs はと分類、複数のアイソフォームのサブユニットからなるヘテロ五量体である大きなN末端 ​​細胞外ドメインを含む膜貫通トポロジーは、4つの膜貫通ドメイン（TMS）、及びTMの3及び4 4の間の主要な細胞内ドメインザこれらのサブユニットの遺伝子欠失を有するマウスは、出生5,6-後に死ぬので、β3およびγ2サブユニットは、シナプス抑制と生物の生存に不可欠である。これとは対照的に、αサブユニットの個々のアイソフォームは、そのような不安、鎮静、覚醒、および他のような異なる動作に関連する脳内の特定のシナプス結合の機能にとって重要である、しかし、個別に、人生7-9に必須ではない。 GABA A Rs は強力な鎮静、催眠、抗不安薬などベンゾジアゼピン、バルビツレート、神経ステロイドや麻酔薬7,10,11など抗痙攣効果、との種々の薬物のための行動の主な部位である。 シナプスのGABA A Rs は通常、γ2サブユニット、2つのβサブユニット（最も一般的にβ2またはβ3）と2つのαサブユニット（α1、α2、α3またはα5）12,13を含んでいます。余分なシナプス受容体の主要なクラスを組み合わせてδサブユニットが含まれています2つのαサブユニット（α4またはα6）、および2つのβサブユニット（β2またはβ3）14。プラズマ膜への軸索、樹状突起や細胞体、および挿入にGABA A Rs の細胞内局在は、βサブユニット15,16の存在に依存している。しかし、シナプスの別個のタイプへの異なるGABA A Rサブタイプの選択的な取り込みは、特定のαサブユニット（α1、α2、α3またはα5）7,17,18の存在とよく相関する。重要なことは、マウスでのα1またはα2サブユニットの削除は、抑制性シナプス19で超微細構造変化を引き起こす。これは、GABA A自体がシナプス形成の調節に直接的な役割を果たし得ることを示唆しているRS。 証拠は、GABA作動性シナプスの開発は、神経ターゲットの両方が、異なる抑制性軸索の種類とでクラスター化される受容体が接触したイベントの正確配位シーケンスであることを示しています抑制性シナプスの各クラスは、選択的かつ機能的に同調している17,20-22。 GABA作動性シナプスにおける特異性のこの基本的な原則は、前とシナプス後パートナーがシナプスの連絡先の開始時にお互いを認識してどのように問題を提起。 in vitroで共培養アッセイは、シナプス形成のメカニズムのいくつかを研究するために、このプロセスでは、個々のシナプス間隙貫通タンパク質の役割をテストするために首尾よく適用されている。シナプス形成および成熟を仲介する双方向機能の共通トランスシナプス相互作用タンパク質の組み合わせの1つは、ニューレキシン（Nrxns）およびニューロリギン（NLS）である。 Nrxnsは、多くの異なるアイソフォーム23を生じさせる、彼らのラミニンニューレキシン-性ホルモン結合タンパク質ドメイン内の選択的スプライシングを示すシナプス前タンパク質である。 Nrxnsはまた、他のタンパク質と相互作用しながら、NLSは、その遍在性シナプス後年率であると考えられているrtners 24。一緒にこれらのタンパク質は近いと剛性同格25にシナプス前及びシナプス後膜を保持に貢献しています。 2最も豊富なアイソフォームは、興奮性と抑制性シナプス、それぞれ26で存在しているNL-1及びNL-2である。トランスシナプスのタンパク質相互作用を調査するために設計された最も初期の共培養モデル系の一つは、非神経細胞の異なるタイプを採用し、そのような過剰発現NL-に対するヒト胎児腎臓（HEK）293細胞、最も一般的に不死化細胞株2。これらの細胞は脳橋神経細胞とともに培養した場合には、HEK細胞の表面に近接したシナプス前タンパク質の蓄積は、シナプスのようなコンタクトの形成を示す、観察された。これらの共培養物への可溶性β-ニューレキシンの添加はNrxnsとNLSとの間のトランスシナプスの相互作用は、シナプスコンタクト形成27のために必要であることを示唆し、コンタクトの形成を阻害した。また、一過性の発現シナプス後タンパク質gephryinのと、GABA A Rサブユニットの発現を誘導し、解離海馬グルタミン酸作動性及びGABA作動性ニューロンとCOS（C V-1（ 入出力 riginで）サル、およびS V40遺伝物質を運ぶ）細胞共培養におけるβニューレキシンのこれら二つの細胞型28との間の接触点でγ2及びα2。シナプス形成を研究するために使用される共培養モデルのもう一つの例は、一過性のGABA A Rは、α2/β3/γ2とNL-2、および視床下部ニューロン29の混合集団をサブユニットトランスフェクトしたHEK293細胞を、関与。この研究は、NL-2の発現は、抑制性シナプスの形成のための絶対条件であると結論した。 しかし、最近の共培養の研究では、安定にトランスフェクトされたα1/β2/γ2GABA A HEK293細胞中のRは、機能的シナプスを誘導するのに十分であることが見出された共培養した場合、GABA作動メッドと追加のトランスシナプスまたはシナプス後接着タンパク質を必要とせずにイウム有棘ニューロン、。 NL-2 GABA AのR 30と共発現させた場合が、シナプス形成および強度の顕著な増加が観察された。これは、この共培養モデル系は、前述のモデル系、シナプス接触検出の最も明らかに増加した感度及び信頼性上の利点を有していることを示している。シナプス結合の検出における全体的な改善に貢献する二つの重要な要因は、i）個々の細胞の表面でのGABA A Rサブユニットの高くかつ一貫した発現を有する安定にトランスフェクトされたHEK293細胞株を使用する。この一貫性は、異なる共培養条件との定量的比較を容易にします。 ⅱ）胚線条体31から培養GABA作動性中型有棘ニューロンの純粋な集団の使用が混在ニューロン集団と同種の使用から生じる合併症や曖昧さを取り除くwsは、例えば、シナプス形成の間に相互に比較することができ、最も適切なシナプス後GABA A Rの種類を選択する。 シナプスの形成は、前およびシナプス後細胞接着複合体内の多くの経シナプスシグナルが関与すると考えられている。によるシナプス伝達および細胞接着分子の膨大な数の双方向性のために、それがシナプス形成に関与する重要な要素を識別することは困難である。このように、非神経細胞への単一細胞接着タンパク質をトランスフェクション（この場合は、in vivoでの GABA作動性中型有棘ニューロンのための2つの最も普及しているシナプス後の目標、α1/β2/γ2またはα1/β3/γ2GABA Aルピー32）を大幅にシナプス後表面で利用可能なトランスシナプスの信号の複雑さを低減し、シナプス形成の促進におけるこのタンパク質の有効性の正確な定量分析を可能にする。

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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
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			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
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		</tr>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
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		</tr>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
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			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
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			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
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		<tr height="21">
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		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
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		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
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		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
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		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
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		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
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		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

このニューロンHEK293細胞の共培養モデル系のためのプロトコルは、細かく最適な細胞の生存を可能にするために調整された。このシステムでは、シナプスのような接触の形成とそれらの分析は、機能性受容体に集合するすべての3つのGABA A Rサブユニットの安定した一貫性の発現に依存している。これは、神経細胞培養に追加する前にHEK293細胞の表面におけるサブユニットの発現を試験するために免疫細胞化学的解析を使用することが重要である。これらの実験では、α1、β2、およびγ2サブユニット（ 図1A）、またはα1、β3およびγ2サブユニット（ 図1B）の細胞表面発現は、これらのサブユニットの細胞外エピトープに結合するサブユニット特異的抗体を用いて検出した。 HEK293表面でこれらのサブユニットの間の共局在の高度が示された。 GABA Aの表面発現と共局在を確認した後HEK293細胞中のRサブユニットは、共培養物は、14日（試験管内（DIV）で14日間）培養α1/β2/γ2GABA A Rサブユニットおよび中型有棘ニューロンに発現するHEK293細胞を用いて調製した。共培養中の細胞を、24時間インキュベートし、固定し、免疫細胞化学および共焦点顕微鏡を用いて分析した。連絡先の分析は、GAD65陽性GABA作動性軸索終末対照HEK293細胞（ 図2A、2B）のみ散発的な接触を形成することを示した。 4時間後に検出された接点の数は、HEK293細胞あたり7.3±0.9であり、この数は、培養されたニューロンにHEK293細胞に添加した後24時間後にHEK293細胞あたり5.5±0.5接続（平均±SEM）に減少した。対照的に、GAD65陽性GABA作動性軸索端末はGABA A Rs とを発現しているHEK293細胞を用いた多数のシナプスのような接点を形成した。 HEK293細胞を加えた後、4時間で得られた接点の数はHEK293細胞あたり28.3±4.7であり、この数はさらに増加し​​た52.1±6.3へdは共培養中で24時間（ 図2A、2B）でHEK293細胞当たり（平均±SEM）。 これらのシナプスのような接点があったかどうかを判断するには「アクティブ&#39; すなわち水疱性伝達物質の放出を支持し、小胞-腔側ドメイン固有抗シナプトタグミンのCy5コンジュゲート抗体は、インキュベーションの23時間後に共培養培地に添加した。この抗体は、唯一のシナプス前神経末端のシナプス小胞の内腔および神経伝達物質の放出の間のシナプス間隙内の細胞外液の間の細孔の形態に組み込まれている。リリースに続いて、毛穴、小胞の内部シナプトタグミンに添付シナプトタグミンのCy5共役蛍光抗体を残して、閉じます。このように、積極的に神経伝達物質の放出に従事するのみ小胞は、抗体で標識されている。いくつかのこれらの実験では任意のコントロール間の接触HEK293細胞や中型有棘ニューロン端末があった場合には「アクティブ＆＃8217; HEK293細胞中のシナプス前GAD65 /シナプトタグミン蛍光とmCherryを蛍光（ 図3A）との間の共局在の欠如によって示されるように。 GAD65 /シナプトタグミンとmCherryを間に共局在度の高いによって明らかにされたようにこれとは対照的に、多くの「アクティブ」接点は、中型有棘ニューロン端末およびα1/β2/γ2発現HEK293細胞との間に形成された、HEK293細胞（に特異的に発現図3B）。 GABA A Rの異なるサブタイプはまた、インビトロでシナプスのような形成を促進することができるかどうかをテストするために、我々は中型有棘ニューロンと共培養α1/β3/γ2発現するHEK293細胞を持っている。再び、めったに（ 図4Aは、図4B 左 ）共培養における24時間後のHEK293細胞あたり10.8±0.48（平均±SEM）の接点に到達するシナプシン陽性シナプス前終末との接触を受けていないHEK293細胞を制御します。しかしながら、HEK293細胞が発現するシナプシン陽性シナプス前の共培養における24時間後のHEK293細胞あたり25.3±0.27（平均±SEM）の連絡先に到達した中型有棘ニューロンの端子（ 図4A 権を持つシナプスのような接点α1/β3/γ2GABA Aルピーフォーム有意に多く、図4（b））。これはα1/β3/γ2GABA A RsはHEK293細胞で発現していることを彼らの効力がα1/β2/ GABA A Rs は γ2含有の効力よりも低いとはいえ、またシナプス接触形成を促進することができていることを示します。 これらの実験は、我々の研究室で開発された共培養モデル系は、定量的なインビトロでのシナプスのコンタクト形成の分析、ならびにこのプロセスにおけるGABA A Rの異なるサブタイプの有効性の評価を可能にすることを示している。これらの実験はさらに、GABA A Rs は 、GABA作動性シナプスの重要な機能的構成要素であることに加えて、重要な役割を果たし得ることを実証認識及び互いに独立して、シナプス接着タンパク質の抑制性ニューロンおよび適切な神経標的細胞間のシナプス接触の形成の過程において。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> GABA A Rα1/β2/γ2の発現または安定なHEK293細胞株において/γ2α1/β3図1.免疫細胞化学的分析。GABA A Rサブユニットの細胞外ドメインを認識する抗体は、細胞表面で発現される受容体を標識するために使用した。（ α1（アレクサフルオロ488）、β2（アレクサフルオロ555）とγ2を発現A）高レベルでα1（アレクサフルオロ488）、β2（アレクサフルオロ555）とγ2（Cy5標識）を発現するHEK293細胞株（B）HEK293細胞株（Cy5で）高レベルでのサブユニット。スケールバー：10μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> 図2. GABA作動性中型有棘ニューロンは、α1/β2/γ2-共培養HEK293細胞に発現したシナプスのような接点を形成する。 （ 右 、青で）、これらの間の共局在の点を明らかにしたγ2サブユニットmCherryを（赤、 左 ）またはGABA A R抗GAD65抗体（緑色）とHEK293細胞とのシナプス前末端の（A）蛍光標識共培養の4または24時間後にシナプス様コンタクトの形成を示すマーカー。スケールバー：10μmの（B）のシナプスのような共同の定量分析<html> ntacts。それぞれの光学部に目で数えたDIC画像および/またはmCherryを発現、およびGAD-65陽性の斑点（緑色）およびHEK293細胞の表面との間の接触の数によって明らかにされたHEK293細胞は、その形状に基づいて同定されたZスタックシリーズ - イメージングソフトウェアを使用して細胞あたり（8〜10）、および連絡先/細胞の数として表される。グラフは、中型有棘ニューロン間の接点の数を示しており、4の後にHEK293細胞（ライトグレー）またはα1/β2/γ2-HEK293細胞（黒）を制御し、共培養中で24時間（平均±SEM、N =各8 2つの独立した実験からの条件）。この図は、フックスらから変更されている。（2013）30。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html>広告/ 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;幅=&quot; 600 &quot;/&gt; 図3. GABA A Rs は中型有棘ニューロン間の共培養24時間後に形成されたシナプスのような連絡先の免疫標識GAD65用の正の端子（アレクサフルオロ405シアン）、（A）は HEK293細胞を制御します。アクティブなシナプス接触の形成を促進する 、または両方の一過mCherryををトランスフェクトし、（B）HEK293-α1/β2/γ2細胞は、（赤）を構築。アクティブな連絡先は、シナプス前終末の両方の小胞腔ドメイン特異的抗シナプトタグミン抗体（Cy5の）およびGAD65特異的抗体との間の共局在によって識別され、そしてmCherryをHEK293細胞に発現させた。スケールバー：10μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> igure 4 &quot;FO：コンテンツ幅=&quot; 6インチ &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;幅=&quot; 600 &quot;/&gt; 図4. GABA作動性中型有棘ニューロンは、共培養における発現HEK293細胞α1/β3/γ2-サブユニットとのシナプスのような接点を形成する。 （A）抗シナプシン（左）I抗体（緑色）、および対照HEK293細胞、またはα1とのシナプス前終末の蛍光標識/β3/γ2HEK293細胞に発現、両方の一過性（赤）mCherryをでトランスフェクトされたが、点を明らかにした共培養中で24時間後シナプスに似たコンタクトの形成を示すこれらのマーカーの間の共局在。スケールバー：10μmの（B）。 シナプスのようなコンタクトの定量分析。 HEK293細胞を、mCherryを発現により同定し、シナプシンI陽性涙点（緑色）およびHEK293細胞の表面との間の接触数がZスタックシリーズの各光学部に目でカウントした（1 - 80）細胞当たりのイメージングソフトウェアを使用して、連絡先/細胞の数として表される。グラフは中型有棘ニューロンおよび対照HEK293細胞（ライトグレー）またはα1/β3/γ2-HEK293細胞（黒）共培養における24時間後の間の接触の数を示しています（平均±SEM、N = 8-12細胞内で2つの独立した実験から各条件、）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現<sub&gt; A</sub&gt;受容体

個体発生時に抑制性GABA作動性シナプスの形成をコーディネイト分子機構はほとんど不明である。これらの過程を研究するために、我々は、機能的なGABA A受容体を発現する安定にトランスフェクトされたヒト胚腎臓293（HEK293）細胞と共に培養した胚性中型有棘GABA作動性ニューロンを組み込んだ共培養モデル系を開発した。

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

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