Name: purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (1 R01 GM095384-01) הוענק ליער Rohwer. אנו מודים Epicentre, חברת Illumina למתן גישה מוקדמת לערכות Ribo-אפס לאפידמיולוגיה. אנו מודים למארק Hatay לעיצוב והייצור של בעל צינור ultracentrifugation. אנו מודים אנדריאס האס ובנימין נואלס לקריאה ודיונים של כתב היד קריטיים, ולורן פול לסיוע לתהליך הצילום.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomics ויראלי חלקיקים נגיפיים מרוכזים באמצעות פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) או ריכוז נפח קטן. במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך בריכוז, אבל מראש סינון או צעדי צנטריפוגה במהירות נמוכים משמשים להסרת תאים האיקריוטים וחיידקים. lysates ויראלי יהיה מועשר יותר ומטוהר באמצעות ultracentrifugation צפיפות שיפוע 9,41 או מסנני גודל קטנים (למשל, 0.45 מיקרומטר) להסרת תאי חיידקים האיקריוטים וגדולים 25. ultracentrifugation שיפוע צפיפות מבוצע בדרך כלל עם פתרונות צפופים אבל אינרטי כגון כלוריד סוכרוז או צזיום לבודד ולהתרכז חלקיקים נגיפיים 41. הפרדה פיזית מבוססת על הגודל וצפיפות קלילה של חלקיקים נגיפיים. לכן, בחירה נכונה של גודל נקבובית מסנן וההכנה הקפדנית של מילויים הן חיוניים לבודד את הקהילות נגיפיות ספציפיות, כמו ההצלחה של ההתאוששות הפיסית שלVLPs קובע את הקהילה מבודדת 41 (כלומר, חלקיקים נגיפיים שאינו עוברים דרך המסנן או נפילה בתוך צפיפות החילוץ לא יזוהה בmetagenome). לאחר בידוד וריכוז נגיפיים, ייתכנו זיהום נוכחי חומר הגנומי שאינו נגיפי במדגם הן בצורה של חומצות גרעין וחופשיות של חיידקים ותאים האיקריוטים. לכן, זה קריטי כדי לוודא את טוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות (איורים 1 א ו -1 B). טיפול כלורופורם משמש בדרך כלל לlyse תאים הנותרים, ואחריו טיפול nuclease להשפיל חומצות גרעין חופשיות לפני מיצוי חומצות גרעין. אזהרה לעבודה שהוצגה הייתה השימוש בהפרדת שיפוע צפיפות לבודד חלקיקים נגיפיים כפי שהוא עשוי לכלול חלקיקים נגיפיים עטפו שעשויה להיות קליל מדי כדי להזין את שיפוע CsCl. חלופי &quot;לתפוס את כל-&quot; השיטה היא להשמיט separ שיפוע הצפיפותation ולבודד את ה- DNA הקהילה מ0.45 מיקרומטר - filtrates טופל בכלורופורם וDNase I. גישה זו היא גם מתאים כדי להתאים כרכי מדגם קטנים כמו אלה ממטליות או פלזמה דם. עם זאת, זה עלול לגרום לזיהום חיידקי כלורופורם עמיד וכמות גבוהה יותר של DNA תאי DNase I-עמיד. פרוטוקולי רצף הנוכחיים דורשים 1 ng עד 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין להכנת ספריית רצף לפי תשואות DNA גבוהות יותר לספק מבחר רחב יותר של אפשרויות סידור. ריכוז ה- DNA של viromes נוצר לעתים קרובות נע בין מתחת לסף הגילוי ליותר מ -200 ng / μl. הסכום של חומצות גרעין נגיפיות התאוששו עשוי להיות מספיק להכנת ספריית רצף ישירה. במקרים כאלה, הגברה חומצות גרעין היא חיונית. ספריות הגברה רובה לינקר (LASLs) 2,42,43 והגברת הגנום כולו מבוססת על הגברה עקירה מרובה (מד&quot;א) הן שנישיטות נפוצות ביותר ליצירת DNA מספיק עבור סידור. שיטות מד&quot;א כגון אלה המבוססים על DNA פולימרז Phi29 ידועות סובלות מהטיות הגברה, ואולי מעדיפים להגביר ssDNA וDNA המעגלי, וכתוצאה מכך המיון שונה שאינו כמותיים ואפיון פונקציונלי 44,45. גרסה מותאמת של גישת LASLs הוכח להציג רק הטיות מינימליות, מקדמת רגישות גבוהה יותר (לכמויות קטנות של חומר מוצא), והוא מותאם בקלות לפלטפורמות שונות רצף 43. עם זאת, יש לו את הגישה שלבים רבים, דורשת ציוד מיוחד כדי להקטין את איבוד DNA, ומוגבל לתבניות dsDNA. במעבדה שלנו, גישה זו הותאמה בהצלחה להגברת כמות לזיהוי וגילוי של DNA שחולץ מlavage- רונכואלוואולרית, VLPs coral- וים-נגזרים המים (לא פורסם והורביץ et al. 46). יש לפתח צינורות ניתוח נתונים CLAssically היה אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של ניתוח metagenomics הנגיפי בשל האופי המגוון מאוד וידוע ברובם של קהילות ויראלי. אמנם יש 10 8 גנוטיפים מוערכים נגיפיים בביוספרה, למאגרי מידע נגיפיים הנוכחיים תאריך להכיל ~ 4,000 הגנום נגיפי, שזה בערך 1 / 100,000 של גיוון נגיפי כולל משוער זה. לכן, חיפושים מבוססי דמיון (כגון תפציץ 47) למשימה הטקסונומי ופונקציונלית בmetagenomes הנגיפי יש אתגרים הגלומים. רצפים רבים נכשלים יש קווי דמיון משמעותיים לגנומים באתר, ולכן, מסווגים כידועים. למרות חיפושים מבוססי הומולוגיה הם היישומים החשובים ביותר לצורך קביעת טקסונומיה ולתפקד רצף נתונים, גישות חלופיות המבוססות על ניתוח של מסדי נתונים עצמאיים פותחו -48 50. Fancello et al. 51 מספקים סקירה של כלים חישוביים ואלגוריתמים המשמשים בVira מלאהmetagenomics l. החיידקים metagenomics בדרך כלל, את הסכום הכולל של ה- DNA שחולץ מקהילות hypotonic טופל תמוגה חיידקים (HL-DNA) נע בין 20 ng עד 5 מיקרוגרם. התשואה תלויה מאוד במצב בריאותו של המטופל ואת כמות מדגם ליחה שנאסף, מה שמסביר את השינויים ראו בתשואה הכוללת של HL-DNA שחולץ במחקר זה (טבלה 2). השלבים הקריטיים כדי להפיק נתונים רצף איכות טובה להסתמך על האיכות של ספריות רצף שנוצרו. איור 2 מציג מגוון גודל אופייני לספריות רצף שנוצרו מה- DNA של חיידקים שמקורם בכיח CF באמצעות הליך פיצול ה- DNA מבוסס האנזימטית. גודל הספרייה האופטימלי תלוי בבחירה של פלטפורמת רצף ויישום, ולכן, יכול להיות מותאם הליך הפיצול, במידת צורך, דרך גישות חלופיות כגון sonication ועִרפּוּל. בנוסף לתוצאות הנציג הציגו, ההצלחה של השיטה המוצגת בכיח CF שנאסף מחולים מרובים על פני נקודות זמן מרובות היא גם מאוירת באל Lim et. (2012) 9 וLim et al. (2014) 10. מחקרים קודמים 9,10 מציעים שכל חולה מטפח קבוצה ייחודית של קהילת חיידקים שעוברת לאורך זמן, ובכך משקף את ההתמדה של השחקנים המרכזיים בקהילה תוך תנודות צפויות עקב הפרעות כגון טיפולים אנטיביוטיים. אם תנודות אלה מתרחשות מדי יום גם ללא הפרעות חיצוניות או בשל שיטת דגימה ועיבוד מדגם, עדיין בשאלה. בהתבסס על metagenomic HL-DNA וניתוח amplicon 16S rDNA, דגימת אורך 7 הימים מראה כי התנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיות (יום 1, 2, ו -3) היה מינימאלי (איורים 3 א ו 3 ב &#39;). על introduction של אנטיביוטיקה דרך הפה מייד לאחר דגימת יום 3, שינויים בפרופיל הקהילה התבררו ביום 4. בעוד ציפרופלוקסצין האנטיביוטיקה מיועד למגוון רחב של חיידקים פתוגנים ידועים כגון P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, ודלקת ריאות Streptococcus, הטיפול הגדילו את השפע היחסי של P. aeruginosa תוך הפחתת spp Streptococcus. ופ melaninogenica. לפי יום 6, הקהילה התאוששה לאט למבנה קהילת המוצא הראשוני. התוצאות מצביעות על כך שתנודות של פרופילים של חיידקים בתוך מטופל אחד יש סיכוי גבוה יותר בשל הפרעות קהילה בדרכי הנשימה. בהתחשב בעקביות בין פרופילי חיידקים של ספריות 16S rDNA וmetagenomes מDNA נגזר HL, שללנו ההטיות שמקורן בפריימרים 16S rRNA שימשו במחקר זה. הסבר אפשרי אחד להבדלים לראות פני הטקסונומית 16S rDNAפרופילי אל שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL (איור 3) עשויים להיות הנוכחות של כמויות גבוהות של spp Pseudomonas. DNA תאי לאחר הטיפול האנטיביוטי. זו נתמכת על ידי הממצאים שההבדלים אלה היו בולטים ביותר ביום 7, שלושה ימים לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, אשר מטרות spp Pseudomonas. בנוסף לאחרים. ציפרופלוקסצין משמש בדרך כלל כטיפול הקו הראשון בחולים עם CF ופ הכרוני זיהום aeruginosa למרות שהספקטרום של פעילותה כולל את רוב פתוגנים הקשורים CF. חוקרים שערנו כי הטיפול האנטיביוטי מבטל קהילות רגישות כולל spp Streptococcus. ולכן יצירת נישה מולא על ידי פ &#39;עמיד aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa עשוי להרוויח התנגדות באמצעות הגדלת קהילות biofilm וDNA תאי הוכח להיות התמיכה המבנית העיקרית של אדריכלות biofilm 52. אפילו כtהוא מבנה הקהילה התאושש, DNA תאי אולי נשאר בכיח CF. לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שתמוגה hypotonic ושלבי הכביסה שהוצגו בעבודה זו עשויה להיות תועלת בכך שלא להסיר את ה- DNA המופק רק בני האדם, אבל DNA תאי גם הנגזרות של חיידקים שעלולות לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל. Metatranscriptomics איכות גבוהה metatranscriptome צריכה להכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA) ומייצגת דגימה משוחדת של תמלילי הקהילה (mRNA). בשל זמן מחצית החיים קצרים וכמות מוגבלת של mRNA, זה קריטי, כי הפרוטוקול, כפי שהוצג כאן, ממזער טיפול מדגם כדי למקסם את המספר של תמלילים התאוששו. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. אלה כוללים MICROB להעשיר, Ribo-אפס, ומדגם ספציפי h תוסףybridizations 53 המבוססים על הכלאת oligonucleotide, וmRNA בלבד הערכה המבוססת על RNA מיקוד הפעילות האנזימטית exonuclease מכיל monophosphate 5 &#39;. בנוסף, מספר גישות למוספים לmRNA כגון ערכת II-החיידקים MessageAmp שמעדיף polyadenylates ומגביר RNA ליניארי זמינות גם. חלק מהשיטות הללו (למשל, mRNA בלבד, Xpress MICROB E וMessageAmp) משמש במקביל ליעילות אופטימלית. עם זאת, היעילות של כל הגישות הללו מוגבלות, במיוחד כשעובדים עם rRNA המושפל באופן חלקי, כפי שנצפה לעתים קרובות בסך RNA שחולץ מן דגימות CF. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בם כדי ליצור metatranscriptomes מורכב משני mRNA אוקריוטים ופרוקריוטים. בנוסף, פולי הזנב () הוסיף לרצפים רשאי מפחית את כמות נתוני רצף שימושיים. אזורים עם מתיחות homopolymer נוטים לקבל ציוני איכות נמוכות יותר, גausing מספר משמעותי של קורא ליסונן על ידי רצף ותוכנה שלאחר רצף-, ואורך הקריאה השימושי הממוצע לאחר זמירה מפולי זנבות () יקטנו באופן משמעותי 54. התמודדות עם קהילות מורכבות של חיידקים CF ו- RNA המושפל באופן חלקי (איורים 4 א ו4C), המחקר הקודם שלנו הראה כי שיטת הכלאה-ידי לכידת ערכת זהב Ribo-Zero הייתה יותר יעילה בהסרת שני rRNA האדם וחיידקים בהשוואה לטיפולים משלבים שימוש ב ערכות אחרות 9 (לוח 3). נתונים כתוצאה מאפשר ניתוח מקביל של שני מארח אנושי ותמלילים של חיידקים. בהתאם לתפוקה והאיכות של RNA, כמו גם בחירה אולטימטיבית של פלטפורמת רצף, רב של תהליכים אלה כוללים את צעד סינתזת cDNA יכול להיות יעיל עם דור ספריית רצף. לדוגמא, RNA טופל Ribo-אפס יכול לשמש להכנת libra רצף metatranscriptomeריס באמצעות ערכת ScriptSeq RNA-Seq ספריית הכנה. ניתוח metagenomic של הקהילות הקשורים לבעלי חיים מספק ייצוג מקיף של הישות התפקודית הכוללת הכוללת את המארח והקהילות הקשורים אליו. העבודה שהוצגה כאן היא להתאמה למגוון של דוגמאות הקשורים לבעלי חיים מורכבים, במיוחד אלה המכילים ריר סמיך, כמויות גבוהות של פסולת תא, DNA תאי, חלבון ומתחמי גליקופרוטאין, כמו גם תאי מארח בנוסף לחיידקים ויראליים והרצויים חלקיקים. למרות שחלקיקים נגיפיים וחיידקים עלולים ללכת לאיבוד בכל שלב, חלקיקי בידוד וטיהור חיוניים כדי למזער את כמות ה- DNA מארח. בעוד נתוני metagenomics מספק פוטנציאל המטבולי של הקהילות שנבדקו, metatranscriptomics להשלים זאת על ידי חושף את ביטוי ההפרש של פונקציות מקודדות 9. הערכה מקיפה של נתונים גנומיקה ותמלילים הניבה תוספות חדשותights לדינמיקה של אינטראקציה קהילתית ומקל על פיתוח טיפולים לשיפור 9,10,55.

<html> קהילות ויראלי וחיידקים הקשורים לגוף האדם נחקרו בהרחבה בעשור האחרון באמצעות היישום של טכנולוגיות רצף 1,2. התוצאות הובילו להכרה בחשיבות החיידקים בבריאות ומחלות של בני אדם. היוזמה העיקרית הגיעה מהפרויקט האנושי Microbiome המתאר את החיידקים (וגם כמה חיידקים קדומים) המתגורר בעור אדם, ובתוך חלל פה, דרכי הנשימה, בדרכי מין ושתן, ומערכת עיכול 3. מחקרי Microbiome נוספים של דרכי הנשימה של אדם בריא באמצעות שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) 4,5 ומטליות אף ולוע 4 הראו כי הריאות יכולות לשמש כמכשיר דגימה סביבתי, תוצאות בקולוניזציה של חיידקים חולפים בדרך הנשימה. עם זאת, ההשפעה של קולוניזציה חיידקים במשטחים בדרכי נשימה לקויה יכולה לגרום לזיהומי ריאות חמורים וכרוניים, כגון אלה שראו בסיסטיק פיברוזיס (CF) מטופלים. t &quot;&gt; CF הוא מחלה גנטית קטלנית הנגרמת על ידי המוטציה בסיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור (CFTR) גן 6. מוטציות אלה להצמיח חלבוני CFTR פגומים שבתורו משפיע על הובלת יון transepithelial פני משטח הפסגה של האפיתל. המחלה פוגעת מספר רב של מערכות איברים, אבל הרוב המכריע של תמותה ותחלואה מיוחסת למחלת ריאות CF 7. CF הריאות מספקת מערכת אקולוגית ייחודית להתיישבות חיידקים. הפגם בהובלת יון גורם ריר לבנות בדרכי נשימת CF, יצירת מייקרו-הסביבות מורכבות של אירובי , Microaerophilic, ותאים אנאירוביים מעוגנים על ידי משטח הרירי עשירים בחומרים מזין סטטי. סביבה זו מאפשרת התישבות ושגשוגם של חיידקים, כולל, חיידקים, ופטריות נגיפיות. אקוטי וזיהומי חיידקי ריאה כרוניים להוביל לתגובות חיסוניים קבועות, אבל לא אפקטיביות, וכתוצאה מכך שיפוץ נרחב בדרכי נשימה, אובדן כושר ריאות, ובסופו pulmoכישלון nary. קהילות חיידקים הקשורים לריאות CF תוארו גם באמצעות שני גישות תלויות התרבות ותרבות העצמאית, הכוללים שימוש ב16S RNA ריבוזומלי (rRNA) רצף של גנים 8 וmetagenomics רובה 9,10. הגישה מבוססת-rRNA 16S היא מסוגלת לאפיין מגוון רחב של מינים של חיידקים וללכוד משמרות רחבות במגוון קהילה. עם זאת, הוא מוגבל בהחלטתה בהגדרת הקהילות (מסוכם בClaesson et al. 2010 11) והתחזיות של פוטנציאלי חילוף חומרים מוגבלות לפונקציות הכלליות אלה ידועים למינים שזוהו. לכן, שיטות לקביעת רצף גן 16S rRNA אינן מספיקות לדיוק האנליטי הטקסונומי ופונקציונלי ההכרחי של קהילות חיידקים השונות הנמצאות בריאות CF. גישת metagenomic המתוארת כאן משלימה את הגישה מבוססת-rRNA 16S, מתגברת על המגבלות שלו, ומאפשרת דרך יעילה יחסיתכדי לנתח את שתי טקסונומיה קהילת חיידקים ותוכן גנטי בריאות CF. DNA של חיידקים שבודדו מהדגימות הקשורים לבעלי חיים לעתים קרובות מכיל כמות גדולה של DNA מארח. דגימות כיח או רקמת הריאה CF מכילות בדרך כלל כמות גדולה של DNA האנושי שפורסמה על ידי נויטרופילים בתגובה החיסונית, לעתים קרובות יותר מ- 99% של ה- DNA הכולל 12 - 14. למרות שחלק מתאים אנושיים שלמים יכולים להיות נוכחים, רוב ה- DNA הזה הוא חופשי בפתרון או את הספיחה של חיידקים. בנוסף, הנוכחות של תקעים צמיגים במיוחד ריר, סלולרית פסולת ומזהמים ידועים אחרים לסבך עוד יותר את הבידוד של תאי חיידקים. כמה שיטות נבדקו למדלדלות דגימות אלה של ה- DNA האנושי, כוללים שיפועי Percoll לאדם נפרד מתאי חיידקים 15, הטיפול בDNase אני, ethidium ברומיד monoazide להשפיל DNA האנושי 16, וערכת MolYsis, כל עם הצלחה מוגבלת באופן סלקטיבי.<html> עד כה הליך טיהור DNA של חיידקים היעילים ביותר לליחת CF כבר שינוי של התהליך שתואר על ידי Breitenstein et al. (1995) 17. גישה זו, במסמך הידוע בשם שיטת hypotonic תמוגה (HL), משתמשת בשילוב של β-mercaptoethanol כדי להפחית אג&quot;ח mucin דיסולפיד, תמוגה hypotonic של תאים האיקריוטים, ואני DNase טיפול בDNA המסיס 9. למרות חוסר חלופות שיטת HL העלתה חששות בשל (i) הטיות אפשריות הנובעות מתמוגה לא רצויה של חיידקים ו( ii) אם התנודות שנצפו בהרכב קהילת 9,10 הם תוצר של תנודות הקשורות לעיבוד המדגם. בנוסף לדור של metagenomes רובה, אנו לטפל בבעיות אלה על ידי השוואת הפרופילים גנטי 16S rRNA של DNA הכולל וDNA של חיידקים שחולץ מן שיטת HL באמצעות אותה הקבוצה של דגימות כיח שנאספו ממטופל אחד על פני שבעה ימים רצופים. אף אוזן גרון &quot;&gt; בהשוואה לקהילות חיידקים, האפיון של קהילות נגיפיות הקשורים לבעלי חיים הוא מוגבל 18,19 קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF יש רק מאופיינות מינימאלית 20 -.. 22 המחקר metagenomic הראשון המאפיין את ה- DNA של קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF הראה כי רוב הווירוסים הקשורים לריאות CF הם פאגים 20. הפוטנציאל המטבולי של הפאג בCF ויחידים שאינם CF היה שונה באופן משמעותי. באופן ספציפי, קהילות הפאג באנשי CF נשאו גנים רעיוני של עיבודי מארח חיידקים לפיסיולוגיה של דרכי הנשימה CF, ומחקרי חיידקי ארסיות 20. לאחר metagenomic של וירוסים ברקמת הריאה CF הפגינו ההטרוגניות המרחבית שונה של קהילות נגיפיות בין אזורים אנטומיים 22. בנוסף, רקמת הריאה CF טיפחה את המגוון הנגיפי הנמוך ביותר שנצפה עד כה בכל מערכת אקולוגית 22. רוב הווירוסים שזוהו היו פאגיםעם הפוטנציאל להדביק פתוגנים CF. עם זאת, וירוסים האיקריוטים כגון herpesviruses, אדנו-וירוסים, ווירוסי הפפילומה אנושיים (HPV) היו גם זוהו. באירוע אחד, שבו ציסטות ברקמת הריאה נצפו במהלך נתיחה, יותר מ 99% מהגנום וירוס הפפילומה אנושי היה התאושש, למרות שהמטופל מעולם לא אובחן עם הפפילומה או קרצינומה של ריאות. זה מצביע על כך הווה הגיוון הנגיפי משקף לא רק את חומרת נזק לרקמות, אלא גם עלול לחשוף ולהסביר מחלה uncharacterized בסיסית. הפרוטוקולים שתוארו כאן מספקים דרך פשוטה, אך רבת עוצמה לבודד את חלקיקים נגיפיים דמוי (VLPs) מדגימות שמורכבות מכמויות גדולות של ריר סמיך, מארח ותאי חיידקים, DNA החופשי, כמו גם פסולת תא. משלים metagenomics, metatranscriptomics משמש כדי לפקח על הדינמיקה בביטוי גנים ברחבי קהילת החיידקים והמארח 9,23. במקרה זה, שני חיידקים והוזt mRNA צריך להיבחר באופן מועדף. מאז mRNAs חיידקים אינם polyadenylated, לא ניתן לנצל שיטה נפתחת mRNA מבוסס אוליגו-DT. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בדגימות הקשורים מארח אם הדגימות ידועות מכילות כמויות גדולות של mRNA אוקריוטים. דוגמאות רבות הקשורים בבעלי חיים, כוללים ליחה CF, מכילות צפיפות גבוהה של תאים בנוסף לסכומים גבוהים של פסולת הסלולר וnucleases הכוללים RNases. לכן, עוד משימה מאתגרת היא למנוע השפלה RNA נרחבת במהלך metatranscriptome עיבוד. ברוב המקרים, רנ&quot;א הכל חולץ מליחת CF הוא מושפל באופן חלקי, המגביל את היישומים ושירות במורד הזרם של RNA נגזר. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. היעילות של גישות אלה עם זאת מוגבל, במיוחד כשעובדים עם אופן חלקי מושפל 9,24 rRNA. השיטות המועסקות כאן לאפשרed לאחזור של רנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי המתאים להסרה מוחלטת rRNA במורד הזרם יעיל. השוואה ישירה של היעילות בהסרת rRNA מרנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי השוואת שתי ערכות שונות שהומחש על ידי אל Lim et. (2012) 9. בסך הכל, המטרה של כתב היד הזה היא לספק סט שלם של פרוטוקולים (איור 1) כדי ליצור metagenomes רובה נגיפי וחיידקים, וmetatranscriptome, ממדגם הקשורים לבעלי חיים יחיד, תוך שימוש במדגם ליחה נגרם כדוגמא. עבודה מעבדה מולקולרית צריכה לכלול אזורים נפרדים הגברה לפני ואחרי כדי למזער את הזיהום צולב. השיטות להתאמה בקלות לסוגי מדגם אחרים, כגון רקמה 22, אף ולוע ומטליות לוע תחתונים 25, שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ואלמוגים (נתונים שלא פורסמו). כל דגימה צריכה להיות מעובד מייד עם אוסף במיוחד כאשר metagenomics חיידקים ונפגשהמחקרי atranscriptomics הם רצויים. אם הדגימות הוקפאו, הוא מגביל את הבידוד של תאי חיידקים שלמים לmetagenomes חיידקים כהקפאת פוטנציאל לשבש את שלמות התא. עם זאת, הקפאה אינה מונעת metatranscriptomics ובידוד נגיפי, אבל איכות של RNA וכמות חלקיקים נגיפיים התאוששו עשויה להיות מושפע בתהליך ההפשרה הקפאה. חשוב לציין כי ליחה מושרה שימשה כמקור העיקרי של דגימות במחקרים רבים הקשורים לחולי CF מבוגרים ומחלות ריאה כרוניות אחרות 26,27 כBAL יכול להיות פולשני מדי. במחקרים שלנו, דגימות כיח נאספו עם שיטה זהירה ועקבית דגימה, כלומר, מי פה הבא ושטיפה של חלל הפה באמצעות תמיסת מלח סטרילית כדי לשמור על זיהום חיידקים אוראליים בתוך דגימות הליחה למינימום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

הנגישות של רצף תפוקה גבוהה יש מהפכה בתחומים רבים של ביולוגיה. על מנת להבין טוב יותר קהילות נגיפיות וחיידקים הקשורים מארח, עבודה מקיפה להפקת DNA ו- RNA פותחה. העבודה במקביל יוצרת metagenomes נגיפי וחיידקים, כמו גם metatranscriptomes, ממדגם יחיד עבור סידור הדור הבא. הצימוד של גישות אלה מספק סקירה של שני מאפייני המיון השונים ופונקציות הקהילה מקודדת. שיטות שהוצגו להשתמש סיסטיק פיברוזיס ליחה (CF), סוג מדגם בעייתי, משום שהוא צמיג במיוחד ומכיל כמות גבוהה של mucins, DNA נויטרופילים חופשי, ומזהמים אחרים לא ידועים. הפרוטוקולים שתוארו כאן למקד את הבעיות הללו והצלחה לשחזר DNA הנגיפי וחיידקים עם זיהום הדנ&quot;א אנושי מינימאלי. כדי להשלים את לימודי metagenomics, פרוטוקול metatranscriptomics היה מותאם להתאושש שני החיידקיםוmRNA מארח המכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA). סקירה של מאפייני הנתונים מוצגת ללשמש כנקודת התייחסות להערכת ההצלחה של השיטות. דגימות כיח CF נוספות גם נאספו ל( i) להעריך את העקביות של פרופילי Microbiome על פני שבעה ימים רצופים בתוך מטופל בודד, וכן (ii) להשוות את העקביות של גישת metagenomic לסידור המבוסס על גן 16S RNA ריבוזומלי. התוצאות הראו כי תנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיקה היו מינימליות ופרופילי טקסונומיה של החיידקים הקשורים CF הנפוצים היו דומים מאוד בין ספריות 16S rDNA וmetagenomes שנוצרו מDNA תמוגה hypotonic (HL) -derived. עם זאת, ההבדלים בין פרופילי מיון שונים 16S rDNA שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL מציעים שתמוגה hypotonic והצעדים הכביסה ליהנות בלא הסרת DNA האדם נגזר בלבד, אלא גם של חיידקים שמקורם בextracellulDNA ar שעלול לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...