Name: purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00
Duration: 11 min 23 s
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<p class="jove_content"> यह काम वन Rohwer सम्मानित करने के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1 R01 GM095384-01) द्वारा समर्थित किया गया। हम Ribo-जीरो महामारी विज्ञान किट के लिए जल्दी पहुँच प्रदान करने के लिए Epicentre, एक Illumina कंपनी धन्यवाद। हम ultracentrifugation ट्यूब धारक के डिजाइन और उत्पादन के लिए मार्क Hatay धन्यवाद। हम फिल्माने की प्रक्रिया की सहायता के लिए महत्वपूर्ण रीडिंग और पांडुलिपि के विचार विमर्श के लिए एंड्रियास हास और बेंजामिन नोल्स धन्यवाद, और लॉरेन पॉल। </p>

<p class='jove_content'>The authors have nothing to disclose.</p>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

<p class="jove_content"> उच्च throughput अनुक्रमण की पहुंच जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में क्रांति ला दी है। बेहतर मेजबान जुड़े वायरल और सूक्ष्म समुदायों को समझने के लिए, डीएनए और आरएनए निकासी के लिए एक व्यापक कार्यप्रवाह विकसित किया गया था। कार्यप्रवाह समवर्ती अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक भी नमूना से वायरल और माइक्रोबियल metagenomes, साथ ही metatranscriptomes, उत्पन्न करता है। इन तरीकों से युग्मन वर्गीकरण विशेषताओं और समुदाय इनकोडिंग कार्यों दोनों के एक सिंहावलोकन प्रदान करता है। यह असाधारण चिपचिपा है और mucins की उच्च राशि, नि: शुल्क न्युट्रोफिल डीएनए, और अन्य अज्ञात संदूषकों क्योंकि इसमें प्रस्तुत तरीकों, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) थूक, एक समस्याग्रस्त नमूना प्रकार का उपयोग करें। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इन समस्याओं को निशाना बनाने और सफलतापूर्वक न्यूनतम मानव डीएनए संदूषण के साथ वायरल और माइक्रोबियल डीएनए की वसूली। Metagenomics पढ़ाई के पूरक हैं, एक metatranscriptomics प्रोटोकॉल दोनों माइक्रोबियल ठीक करने के लिए अनुकूलित किया गया थाअपेक्षाकृत कुछ ribosomal शाही सेना (rRNA) दृश्यों में शामिल है कि और मेजबान mRNA के। डेटा विशेषताओं का अवलोकन विधियों की सफलता का आकलन करने के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए प्रस्तुत किया है। अतिरिक्त CF थूक के नमूने भी (मैं) एक ही मरीज के भीतर लगातार सात दिनों के पार microbiome प्रोफाइल के संगति का मूल्यांकन, और (ii) एक 16S ribosomal शाही सेना जीन के आधार पर क्रमबद्ध करने के लिए metagenomic दृष्टिकोण की स्थिरता तुलना करने के लिए एकत्र किए गए थे। परिणाम एंटीबायोटिक गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल प्रोफाइल के दैनिक उतार-चढ़ाव कम से कम था और आम CF-जुड़े बैक्टीरिया का वर्गीकरण प्रोफाइल के hypotonic सेल (एच) व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न -16 rDNA पुस्तकालयों और metagenomes के बीच अत्यधिक इसी तरह के थे कि पता चला है। Hypotonic lysis और धोने कदम केवल मानव व्युत्पन्न डीएनए को दूर नहीं में लाभ का सुझाव है कि हालांकि, 16S rDNA वर्गीकरण प्रोफाइल के बीच मतभेद कुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न, लेकिन यह भी extracellul माइक्रोबियल व्युत्पन्नवास्तविक माइक्रोबियल प्रोफाइल को गलत ढंग से पेश हो सकता है कि गिरफ्तारी के डीएनए। </p>

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

अशुद्ध सफ़ाई: अनुक्रमण Metagenomes और Metatranscriptomes जटिल जानवर जुड़े नमूनों से

<p class="jove_content"> एक उदाहरण के रूप में सिस्टिक फाइब्रोसिस वायु-मार्ग का उपयोग करना, पांडुलिपि पशु-जुड़े नमूनों में सूक्ष्म और वायरल समुदायों को चिह्नित करने के लिए metagenomic और metatranscriptomic दृष्टिकोण का एक संयोजन शामिल एक व्यापक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है। </p>

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

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