Name: purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) tildelt Forest Rohwer. Vi takker Epicentre, en Illumina selskap for å gi tidlig tilgang til Ribo-Zero Epidemiologi kits. Vi takker Mark Hatay for design og produksjon av ultrasentrifuge rørholder. Vi takker Andreas Haas og Benjamin Knowles for kritiske lesninger og diskusjoner av manuskriptet, og Lauren Paul for å assistere filming prosessen.

MERK: Indusert sputum prøver ble samlet inn i samsvar med University of California Institutional Review Board (HRPP 081500) og San Diego State University Institutional Review Board (SDSU IRB # 2121), ved forskningskoordinator ved University of California, San Diego (UCSD ) voksen CF klinikken. 1. prøvetaking og Pre-behandling (Pre-treat Prøver innen 30 min etter Collection) <ol><li> Før prøvetakingen, etikett fire 15 ml rør som: (i) viral metagenome, (ii) mikrobiell metagenome, (iii) metatranscriptome, og (iv) ekstra slim. Gjenta for hver prøve. Tilsett 2 ml 0,1 mm silikakuler inn i røret merket &quot;Metatranscriptome&quot;, etterfulgt av 6 ml av guanidinisotiocyanat basert RNA lyseringsbuffer (GITC-lyseringsbuffer). </li><li> Under prøvetakingen, bruk steril saltløsning (60 ml) som et munnskyllemiddel for å minimalisere forurensning av orale mikrober. Samle spyttprøver over en 30 min periode etterinnånding av 4 ml 7% hyperton saltløsning via en forstøver. Prosessprøver umiddelbart, som beskrevet nedenfor. </li><li> Fortynne prøven til et totalt volum på 8 ml. <ol><li> Anslå prøvevolum ved veiing tom sputum cup før og etter prøvetaking. </li><li> Hvis volumet av prøven er mindre enn 8 ml, tilsett passende mengde på 0,02 um-filtrert 1x PBS for å generere et totalt prøvevolum på minst 8 ml. </li><li> Umiddelbart homogenisere prøven med en 3 ml sprøyte inntil ingen synlige klumper forblir i sputum </li><li> Bruker samme sprøyte, trekke opp 2 ml spytt og fortsette umiddelbart til trinn 1.4. </li></ol></li><li> Sikrer Total RNA fra spyttprøve <ol><li> Injiserer 2 ml spyttprøve fra trinn 1.3.4 i &quot;metatranscriptome&quot; rør inneholdende silikaperler og GITC-lyseringsbuffer. </li><li> Lukk lokket og forsegle røret sikkert med Parafilm for å unngå lekkasje. </li><li> Homogenisere sputum umiddelbart på middels hastighet i 10 min. Avhengig av vortexer tilgjengelig, plasser røret horisontalt og fest med tape hvis det er nødvendig. </li><li> Holde røret ved 4 ° C eller i en isboks og transport til laboratoriet om nødvendig. </li></ol></li><li> Ved hjelp av den samme sprøyte, aliquot 2 ml sputum hver i rørene merket &quot;viral metagenome&quot; og &quot;mikrobiell metagenome&quot; og overføre det resterende sputum fra sputum koppen inn i røret merket &quot;ekstra sputum&quot;. </li><li> Lagre alle rørene ved 4 ° C eller isboks og transport til laboratoriet om nødvendig. </li></ol> 2. Generering Viral Metagenome <ol><li> Utarbeidelse av buffere og løsninger <ol><li> Forbered 50 mM dithiothreitol (DTT) i forveien og oppbevares ved 4 ° C. Dette er stabil i 2 uker. </li><li> Forbered Saline Magnesium (SM) buffer (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl; justere pH til 7,4. Filter sterilisere (0,02 mikrometer pore størrelse) og oppbevar ved romtemperatur. </li&gt; <li> Forbered DNase I enzym til 100 U / mL (i molekylær klasse vann) fra frysetørket bovint pankreas-DNase I henhold til aktiviteten defineres av Dornase enheter / mg tørrvekt. </li><li> Forbered 10x DNase I-buffer (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; justere pH til 6,5. Filter sterilisere (0,02 mikrometer pore størrelse) og oppbevar ved romtemperatur. </li><li> Forberede 4% paraformaldehyde. </li><li> Forbered 200x TE-buffer: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filter sterilisere (0,02 mikrometer pore størrelse) og oppbevar ved romtemperatur. </li><li> Forbered 10 ml 10% Sodium (SDS) ved hjelp av molekylære grade vann. </li><li> Forbered 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) med molekylær grade vann. Oppløse CTAB over natten. Hvis bunnfall vedvarer, varme opp løsningen ved 65 ° C. Løsningen er svært tyktflytende i romtemperatur. MERK: filtrering av buffere ved hjelp 0,02 um filter tillater fjerning av viruslignende partikler i løsningen, men ikkegratis nukleinsyre forurensning. </li></ol></li><li> Prøven Forbehandling <ol><li> Forberede passende mengde frisk 6,5 mm dithiothreitol (DTT). </li><li> Fortynn homogenatet ved å tilsette 0,02 um-filtrert SM-buffer til et samlet volum på 6 ml. </li><li> Til hjelp i slim oppløsning, tilsett likt volum (6 ml) av 6,5 mM ditiotreitol (DTT) til prøven, vortex kraftig for å blande og inkubere i 1 time ved 37 ° C. </li><li> Vortex den behandlede prøven kraftig og sentrifugering ved 10 ° C, 3056 x g i 15 til 20 min. </li><li> Samle supernatanten til et nytt 15 ml tube. </li><li> Gjenta trinn 2.2.3 og 2.2.5 for den neste prøve. </li><li> Overføring og filtrere supernatanten med en sprøyte som er montert på et 0,45 um filter til et nytt 15 ml tube. MERK: Hvis filter tresko, hente prøver fra sprøyten og utelate filtreringstrinnet. </li><li> Ta en 100 mL subsample av 0,45 mikrometer-filtrert prøve, utføre kloroform og behandling DNase (se seDette skjer 2.3.12-2.3.15) og legge tilsvarende volum på 4% paraformaldehyde å fikse prøven for epifluorescence mikroskopi (Figur 2A). </li><li> For en &quot;catch-all&quot; viruspartikler berikelse tilnærming (se diskusjon), går du til trinn 2.3.12 å utelate viruspartikler utvalg basert på cesiumkloridgradient ultrasentrifugering. Men dette kan resultere i kloroform-motstandsdyktig bakteriell forurensning og høyere beløp av host-DNA i viral lysatet. </li></ol></li><li> Viral lignende partikler (VLP) Enrichment og rensing <ol><li> Forbered individuelle cesiumklorid (CsCl) løsninger ved å oppløse den riktige mengde av CsCl med ikke-filtrert SM-buffer til den ønskede densitet (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml og 1,2 g / ml). Filtrer hver løsning gjennom et 0,02 um filter før bruk. </li><li> Sett opp CsCl-gradient, som vist i figur 2B. </li><li> Belastnings 1 ml av 1,7 g / ml i hvert rør, last 1 ml 1,5 g / ml i hvert rør, last 1 ml 1,35 g/ ml i hvert rør, last 1,2 g / ml i hvert rør (valgfritt), og slutt legger 6-8 ml prøve inn i det respektive rør. Marker individuelle lag for å betegne stedet for hver fraksjon. </li><li> Balansere hverandre motsatte par av rør til innen 1 mg. </li><li> Laste hvert rør forsiktig inn i spinn bøtte. Spinne alle bøtter selv om de er tomme. Laste spin bøtte på rotoren. </li><li> Sentrifuger ved 82844 x g ved 4 ° C i 2 timer. </li><li> Etter sentrifugering, forsiktig fjerne rørene fra holderen uten å forstyrre tetthetsgradienter. </li><li> Ved hjelp av en 3 ml sprøyte med en 18 G nål stikkes hull i røret like under 1,5 g / ml tetthet lag (figur 2, rød pil) og trekk ~ 1,5 ml inn i sprøyten. </li><li> Samle øvre fraksjon ved langsomt å fjerne kanylen og slik at den gjenværende fraksjon i røret å dryppe inn i et nytt 15 ml rør gjennom punktering. Merke dette som &quot;øvre brøkdel avfall&quot;. </li><li> Samle 1,5 g / ml fraction (som inneholder VLP) fra sprøyten ved å ta ut innholdet i to nye mikrofugerør. </li><li> Gjenta trinn 2.3.8-2.3.10 for alle prøver. </li><li> Legg 0,2 volum kloroform i den virale konsentrat, ristes kraftig, inkuber ved romtemperatur i 10 min sentrifugering ved maksimal hastighet i 5 min, og samle den vandige fase. </li><li> Legg 10x DNase buffer og DNase I (endelig konsentrasjon = 2,5 U / pl) i kloroform-behandlede viruskonsentrat, og inkuberes ved 37 ° C i 1,5-2 timer. </li><li> Inaktivere DNase-aktivitet ved 65 ° C i 15 min. </li><li> Fjerne 15 mL av kloroform og DNase-behandlet viral brøkdel inn i et nytt rør, og legge til 15 mL 4% Paraformaldehyde å fikse prøven for epifluorescence mikroskopi. </li></ol></li><li> DNA Extraction <ol><li> Basseng virale konsentrater fra hver prøve til en rengjort og autoklaveres 50 ml Oak Ridge høyhastighets sentrifugerør. </li><li> Legg til følgende: 0,1 volum 200x TE-buffer, 10 pl 0,5 M EDTA pr ml srikelig, 1 volum av formamid, og 10 ul glykogen. Bland godt og inkuber ved romtemperatur i 30 min. </li><li> Ved hjelp av de nye volumer, tilsett 2 volumer av romtemperatur 100% etanol. Bland godt og inkuber ved 4 ° C i minst 30 min. </li><li> Pellet-DNA ved å spinne rør ved 17226 xg i 20 min, ved 4 ° C ved anvendelse av en SS-34 rotor. </li><li> Kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en serologisk pipette. Vask pelleten to ganger med iskald 70% etanol. </li><li> Fjerne så mye væske som mulig og tillater pelleten lufttørket ved romtemperatur i 15 min. </li><li> Resuspender DNA-pelleten i 567 pl av 1x TE-buffer (pH 8,0). MERK: La det være minst 15 min for fullstendig resuspensjon ved romtemperatur. Oppbevar det resuspenderte DNA over natten ved 4 ° C inntil videre behandling. </li><li> Overfør hele 567 ul av resuspenderte DNA-løsningen inn i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg 30 mL av forvarmet 10% SDS og 3 mL av proteinase K (20 _6; g / ml), blandes grundig og inkuberes i 1 time ved 56 ° C. Pre-varm CTAB / NaCl ved 65 ° C. </li><li> Tilsett 100 mL av 5 M NaCl og bland godt. Legg 80 ul av forvarmet CTAB / NaCl-oppløsning, vortex, og inkuber i 10 min ved 65 ° C. </li><li> Legg likt volum kloroform, vortex-blandes, og sentrifugering ved 16 100 xg i 5 min. </li><li> Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg et likt volum fenol / kloroform, vortex-blandes, og sentrifugering ved 16 100 xg i 5 min. </li><li> Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg et likt volum kloroform, vortex-blandes, og sentrifugering ved 16 100 xg i 5 min. </li><li> Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Legg like stort volum av isopropanol til den overliggende fraksjon, blande og inkubere ved -20 ° C i minst 30 min. </li><li> Pelletere DNA, sentrifugering ved 16 100 xg i 15 min ved 4 ° C. Pipetter av supernatanten forsiktig og vaske pelleten to ganger med iskald 70% etanol. </li&gt; <li> Utføre en kort sentrifugering og fjerne den gjenværende etanol fra røret. Luft tørke pelleten i 15 min. </li><li> Resuspender DNA-pelleten med 50 ul elueringsbuffer (5 mM Tris, pH 8,5). Tillat pelleten å rehydrere i minst 5 minutter i romtemperatur. </li><li> Kvantifisere DNA ved hjelp av en høy følsomhet fluorescens-basert analysen. </li></ol></li><li> Forsterkning ved hjelp Phi29 Polymerase (valgfritt) <ol><li> Forbered 2x sammensmeltningsbuffer: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2. </li><li> Fortynne Phi29 DNA polymerase til 5 U / mikroliter. </li><li> Pre-miksen prøvebuffer som besto av 50 ul tilfeldig heksamer primer (100 pM), 125 ul 2 x annealing-buffer, og 25 ul vann. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C. </li><li> Pre-miksen reaksjonsbuffer, som består av 100 pl Phi29 10x buffer, 40 pl 10 mM dNTP, og 560 pl vann. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C. </li><li> Tilsett 1 mL mal DNA i 4 mL prøve buffer. </li><li> Ruge the blandingen ved 95 ° C i 3 minutter og avkjøles på is. </li><li> Legg 14 ul reaksjonsbuffer inn i blandingen fra 2.4.4, bland ved å pipettere opp og ned. </li><li> Tilsett 1 mL av Phi29 DNA-polymerase, bland ved å pipettere opp og ned, og inkuber ved 30 ° C i 18 timer fulgt av 65 ° C i 10 min. </li><li> Rydd opp reaksjonene ved hjelp genomiske DNA kolonner eller fenol / kloroform og etanolutfellinger. </li></ol></li><li> Epifluorescens Mikroskopi (Se Haas et al. 2014 28 for oppsett filtreringssystem) MERK: Etter isolering og rensing, epifluorescens mikroskopi med nukleinsyrefarvestoffene kan brukes for å bekrefte nærværet og renhet av virale partikler i prøvene (figurene 2A og 2C). Fri DNA i prøven kan gi opphav til høy bakgrunnsfluorescens. Derfor bør prøven være DNase-behandlet før fiksering og farging for mikrografer. <ol><li> Forbered mount løsning (0,1% askorbinsyre, 50% glyserol). Tilsett 100 ul 10% askorbinsyre i 4,9 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), blandes godt. Tilsett 5 ml 100% glyserol til blandingen, bland godt og merke røret som &quot;mount&quot;. </li><li> Filter montere ved hjelp av en 0,02 mikrometer alumina matrise engangssprøyte filter, delmengde inn mikrofugerør, og oppbevares ved -20 ° C. </li><li> Delmengde 100 ul prøve inn i en ny mikrofugerør og legge tilsvarende volum på 4% paraformaldehyde å fikse VLPene. Inkuber blandingen ved romtemperatur i minst 10 min. </li><li> Gjøre opp volumet til en ml ved å legge 800 mL av 0,02 mikrometer-filtrert vann. Tilsett 1 mL av SYBR Gold flekken inn i røret og inkuber ved romtemperatur i 10 min. </li><li> Sett opp filtreringssystem ved å slå på vakuumpumpen mellom -9 og -10 psi (-62,1 og -68,9 kPa). </li><li> Vask pidestall med vann og plassere en 0,02 mikrometer Aluminiumoksydmatriksen filter med ringformet polypropylen støttering inn i filter pidestall. </li><li> Plassere et filter tårn på toppen av filter pidestall med filteret og sikkert med en klemme. </li><li> Pipette innholdet fra 1,5 ml mikrofugerør inn i filteret tårnet, og la noen få minutter for prøve å filtrere gjennom. </li><li> Label og pipette 10 mL av mount reagens i en mikroskopisk lysbilde. </li><li> La vakuum på mens du fjerner filteret tårnet og klemme. </li><li> Ta forsiktig ut filter fra filter pidestall og blot bunnen av filteret med en Kimwipe, deretter plassere filteret direkte på toppen av fjellet på mikroskopisk lysbilde. </li><li> Pipette ytterligere 10 mL av mount reagenset inn i filteret, og sett en dekkglass over filteret. </li></ol></li></ol> 3. Generering Microbial Metagenome <ol><li> Utarbeidelse av buffere og løsninger <ol><li> Forbered 50 ml 1x DNase buffer: 50 mm NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl 2; justere pH til 6,5. Filter sterilisere (0,22 mikrometer) og butikkved romtemperatur. </li><li> Forbered DNase I enzym til 1000 U / mL (i molekylær klasse vann) fra frysetørket bovint pankreas-DNase I henhold til aktiviteten defineres av Dornase enheter / mg tørrvekt. </li><li> Forbered 100 ml SE buffer: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; justere pH til 7,5. Filter sterilisere (0,22 mikrometer) og oppbevar ved romtemperatur. </li></ol></li><li> Prøven Forbehandling Før DNA Extraction <ol><li> Fortynn homogenatet ved tilsetning av 5 volumdeler 0,22 um-filtrert 1x PBS. For eksempel legge til 10 ml 1x PBS i 2 ml av prøven. </li><li> Legg β-merkaptoetanol til 2% (v / v) sluttkonsentrasjon. Rock blandingen (i den kjemiske hette) ved romtemperatur i 2 timer. </li><li> Spinn prøven ved 10 ° C og 3056 x g i 15 min, og supernatanten kastes. </li><li> Resuspender pelleten i 10 ml molekyl grade vann (eller 0,22 um filtrert vann), og inkuber ved romtemperatur i 15 min. </li><li> Gjenta trinn 3.2.3 og 3.2.4 gang. </li><li> Spin ved 10 ° C og 3056 xg i 15 minutter, og kast supernatanten. </li><li> Resuspender pelleten i 5 ml 1 x DNase buffer og tilsettes 15 mL DNase I (1000 U / mL) per ml prøve. </li><li> Inkuber ved 37 ° C med gjentatt blanding i 2 timer. </li><li> Inaktivere DNase-aktivitet ved 65 ° C i 15 min. </li><li> Spinne ved 10 ° C og 3056 xg i 15 minutter, og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 10 ml SE buffer. </li><li> Gjenta trinn 3.2.10. </li><li> Spinne ved 10 ° C og 3056 xg i 15 minutter, og kast supernatanten. </li><li> Resuspender pelleten i 2 ml SE buffer, og overført til to mikrofugerør. </li><li> Pellet cellene i mikrofugerør. Spinne rørene ved 16.100 xg ved romtemperatur i 15 min. </li><li> Fjern supernatanten og pakke DNA fra de pelleterte celler ved anvendelse av en genomisk DNA-ekstraksjon kit, gram-positiv variasjon protokoll. </li></ol></li></ol> 4. Generere Metatranscriptome <ol><li> Eksempel Pre-treatment <ol><li> Utføre mekanisk lyse av cellene ved perle juling i GITC-lysisbuffer umiddelbart etter prøvetaking og homogenisering. Se trinn 1.4. </li><li> Spinne blandingen ved 4 ° C og 600 xg i 5 minutter for å pelletere de silikakuler. </li><li> Overfør supernatanten til et nytt rør. </li><li> Tilsett 200 ul kloroform for hver 750 ul av GITC-lysis buffer som brukes, ristes kraftig for hånd i 15 sekunder, inkuber ved romtemperatur i 10 min og sentrifugering ved 4 ° C og 3056 x g i 15 min. I løpet av denne 15 min spinn, forberede trinn 4.2. </li><li> Etter 15 min sentrifugering (en klar separering av vannfase-interfase-organisk fase former), ekstraher den vandige fase (uten å forstyrre interfase) i ny RNase-frie rør (r). MERK: Den vandige fasen inneholder RNA. Hold rørene på is til neste trinn. </li></ol></li><li> Utføre total RNA ekstraksjon og rensing ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kolonnebaserte RNA rensing kits eller conventional isopropanol-basert RNA nedbør. <ol><li> Silika kolonne-basert RNA Rensing <ol><li> Måle det totale volum av den vandige fraksjon erholdt. </li><li> Legg passende volum av RNA-bindingsbuffer for å prøve og bland godt. </li><li> Justere blandingen til riktig innbindings tilstand i henhold til produsentens protokoll. Bland godt og gjøre en kort sentrifugering. </li><li> Laste blandingen i RNA-kolonnen. For et stort volum prøve, bruke flere lasting og laste hver kolonne opptil 4x. Ellers vurdere å bruke flere kolonner for hver prøve. </li><li> Vask kolonnen riktig i henhold til produsentens protokoll. </li><li> Eluere RNA med minst 30 ul RNase-fritt vann. Dobbelt eluering du forsiktig øke utbyttet av RNA. Men dette vil fortynne RNA-konsentrasjon. </li><li> Mål RNA konsentrasjon og gå direkte til behandling DNase. Bruk Bioanalyzer å sjekke kvaliteten på RNA (anbefales). </li></ol&gt; </li><li> RNA Nedbør <ol><li> Legg et likt volum isopropanol (for eksempel 500 ul av isopropanol i 500 ul av vandige fraksjon) og 2 pl av 10 pg / pl RNase-fritt glykogen til prøven. </li><li> Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 min. </li><li> Sentrifugering ved 12 000 xg og 4 ° C i 15 min. </li><li> Fjern forsiktig supernatanten, tilsett 1 ml RNase-fritt 75% etanol. Spinne blandingen ved 7500 xg og 4 ° C i 5 min for å sørge for at pellets er intakt. </li><li> Fjern forsiktig etanol. </li><li> Gjenta trinn 4.2.2.4 og 4.2.2.5 gang. </li><li> Luft tørke pelleten i 10 min. </li><li> Rehydrere pelleten i 50 ul RNase-fritt vann, inkuberes ved 55 ° C i 5 minutter og gå direkte til DNase-behandling. Bruk Bioanalyzer å sjekke kvaliteten på RNA (anbefales). </li><li> Butikk RNA i alikvoter ved -20 ° C eller -80 ° C for lagring over lang tid. </li></ol></li></ol></li></ol&gt;

The authors have nothing to disclose.

Viral metagenomikk Virale partikler er konsentrert ved hjelp av polyetylenglykol (PEG) utfelling eller lite volum konsentratorer. I noen tilfeller kan konsentrasjonen ikke være nødvendig, men før filtrering eller lavhastighetssentrifugering trinn brukes til å fjerne og eukaryote mikrobielle celler. Virale lysater blir ytterligere anriket og renset ved anvendelse av densitetsgradient-ultrasentrifugering 9,41 eller mindre størrelse filtre (f.eks, 0,45 pm) for å fjerne store og eukaryote mikrobielle celler 25. Densitetsgradient-ultrasentrifugering blir vanligvis utført med tette, men inerte oppløsninger som for eksempel sukrose eller cesium-klorid for å isolere og konsentrere viruspartikler 41. Fysisk separering er basert på størrelsen og flytedensitet av virale partikler. Derfor, riktig valg av filter porestørrelse og streng fremstilling av gradienter er nødvendig for å isolere spesifikke virale miljøer, som lykkes i fysisk utvinning avVLPer bestemmer fellesskap isolert 41 (dvs., virale partikler som ikke passerer gjennom filteret eller faller innenfor ekstraksjon densitet vil ikke bli påvist i det metagenome). Etter viral isolasjon og konsentrasjon, kan det være forurensende ikke-viralt genomisk materiale som er tilstede i prøven, både i form av frie nukleinsyrer og mikrobiologisk og eukaryote celler. Derfor er det viktig å kontrollere renheten av virale partikler i prøvene (figur 1A og 1B). En kloroform behandling brukes vanligvis til å lysere gjenværende celler, etterfulgt av nuklease-behandling for å nedbryte frie nukleinsyrer før nukleinsyre-ekstraksjon. En påminnelse til den presenterte arbeidsflyten var bruken av tettshetsgradient separasjon for å isolere viruspartikler som det kan utelukke omhyllede viruspartikler som kan være for spenstig å gå inn i CsCl gradient. Et alternativ &quot;catch-all&quot; metoden er å utelate densitetsgradienten SEPARasjon og isolere samfunnet DNA fra 0,45 mikrometer - filtratene behandlet med kloroform og DNase I. Denne tilnærmingen er også hensiktsmessig å imøtekomme små prøvevolumer slik som de fra spinner eller blodplasma. Dette kan imidlertid resultere i kloroform-resistente bakterieangrep og høyere mengde av DNase-resistente ekstracellulært DNA. Nåværende sekvense protokoller krever en ng til 1 mikrogram av nukleinsyrer for sekvense bibliotek forberedelse der høyere DNA gir gi et bredere utvalg av sekvense alternativer. DNA-konsentrasjonen av genererte viromes ofte varierer fra under deteksjonsgrensen til mer enn 200 ng / mL. Mengden av virale nukleinsyrer utvinnes kan være utilstrekkelig for direkte sekvense bibliotek preparat. I slike tilfeller, er nukleinsyre-amplifikasjon avgjørende. Linker forsterkning hagle bibliotek (LASLs) 2,42,43 og hele genomet forsterkning basert på multiple forskyvning forsterkning (MDA) er de tometoder som oftest anvendes for å generere tilstrekkelig DNA for sekvensering. MDA fremgangsmåter slik som de som er basert på Phi29 DNA polymerase er kjent for å lide av forsterknings skjevheter, og kan fortrinnsvis forsterke ssDNA og sirkulært DNA, noe som resulterer i ikke-taksonomisk kvantitativ og funksjonell karakterisering 44,45. En optimalisert versjon av LASLs tilnærming har vist seg å innføre bare minimale skjevheter, fremmer høyere sensitivitet (for små mengder av utgangsmaterialet), og er lett tilpasses for forskjellige sekvenseringsplattformene 43. Imidlertid har tilnærmingen mange trinn, krever spesialisert utstyr for å minimalisere tap av DNA, og er begrenset til dsDNA-maler. I vårt laboratorium har denne løsningen blitt tilpasset for å forsterke detekterbar og detekterbar mengde av DNA ekstrahert fra bronchoalveolar lavage-, coral og sjøvann-avledede VLP (upubliserte og Hurwitz et al. 46). Utvikle dataanalyse rørledninger har classically vært en av de mest utfordrende aspektene ved viral metagenomikk analyse på grunn av den svært mangfoldig og stort sett ukjent art av de virale lokalsamfunn. Mens det er anslagsvis 10 8 viral genotyper i biosfæren, til dags dato dagens virus databaser inneholder ~ 4000 virale genomer, som er omtrent 1 / 100.000 av dette omtrentlig total viral mangfold. Derfor likheten baserte søk (som BLAST 47) for taksonomisk og funksjonell oppdrag i virus metagenomes besitter iboende utfordringer. Mange sekvenser klarer å ha betydelige likheter med genomer i databasen, og derfor er klassifisert som ukjent. Selv om homologi baserte søk er de viktigste bruksområdene for tildeling taksonomi og fungere å sekvens data, har alternative tilnærminger basert på database-uavhengig analyse blitt utviklet 48- 50. Fancello et al. 51 gir en fullstendig gjennomgang av dataverktøy og algoritmer som brukes i viral metagenomikk. Mikrobiell metagenomikk Typisk er den totale mengden av DNA ekstrahert fra hypotone lysebehandlet mikrobielle samfunn (HL-DNA) variere fra 20 ng til 5 ug. Utbyttet er sterkt avhengig av pasientens helsetilstand og mengden av spyttprøve oppsamlet, noe som forklarer de variasjoner sett i det totale utbytte av HL-DNA ble ekstrahert i denne studien (tabell 2). De kritiske trinn for å generere god kvalitet sekvensdata er avhengige av kvaliteten av sekvenserings biblioteker genereres. Figur 2 viser en typisk størrelsesområde for sekvense biblioteker genereres fra CF-spytt-avledet mikrobielle DNA ved hjelp av en enzymatisk baserte DNA-fragmentering prosedyre. Den optimale bibliotekstørrelsen er avhengig av valget av sekvenseringsplattformen og anvendelse, og derfor kan den fragmentering måten optimaliseres, om nødvendig, ved alternative metoder som sonikering og forstøvning. Forutende presenterte representative resultater, er suksessen til den presenterte metoden på CF-spytt samlet inn fra flere pasienter på tvers av flere tidspunkter også illustrert i Lim et al. (2012) 9 og Lim et al. (2014) 10. Tidligere studier 9,10 tyder på at hver pasient havner et unikt sett av mikrobiell fellesskap som skifter over tid, og dermed reflekterer utholdenhet av de store aktørene i samfunnet mens svingningene skyldes mest sannsynlig forstyrrelser som for eksempel antibiotika behandlinger. Hvorvidt disse svingningene oppstår daglig selv uten eksterne forstyrrelser eller skyldes utvalgsprosedyre og utvalgets behandling, er fortsatt aktuelle. Basert på HL-DNA metagenomic og 16S rDNA-amplikon analyse, viser 7 dagers langsgående sampling at den daglige svingning av mikrobielle profiler uten antibiotika perturbasjon (dag 1, 2 og 3) var minimal (figur 3A og 3B). Ved introduksjon av oral antibiotika umiddelbart etter Dag 3 prøvetaking, endringer i samfunnet profilen ble klart på dag 4. Mens antibiotika ciprofloxacin rettet mot et bredt spekter av kjente bakterielle patogener som P. aeruginosa, Staphylococcus aureus og Streptococcus pneumonia, øket behandlingen den relative overflod av P. aeruginosa mens redusere Streptococcus spp. og P. melaninogenica. Ved dag 6, samfunnet langsomt gjenvinnes til den opprinnelige start fellesskap struktur. Resultatene tyder på at svingninger i mikrobielle profiler innenfor en enkelt pasient er mer sannsynlig på grunn av samfunnet forstyrrelser i luftveiene. Gitt konsistens mellom de mikrobielle 16S rDNA-profiler av biblioteker og metagenomes fra HL-avledet DNA, styrt vi de skjevheter som stammer fra 16S rRNA-primerne anvendt i denne studien. En mulig forklaring på forskjellene sett over 16S rDNA taksonomiskal profiler genereres fra total DNA og HL-avledet DNA (figur 3B) kan være nærvær av høye mengder av Pseudomonas spp. ekstracellulært DNA etter antibiotikabehandling. Dette understøttes av resultatene at disse forskjellene var mest synlig på dag 7, tre dager etter antibiotika-behandling, som er rettet mot Pseudomonas spp. i tillegg til andre. Ciprofloxacin er ofte brukt som førstelinjebehandling hos pasienter med CF og kronisk P. aeruginosa infeksjon selv om dens spekter av aktivitet inkluderer de fleste CF-assosiert patogener. Vi antok at antibiotikabehandling eradicates mottakelige lokalsamfunn inkludert Streptococcus spp. og dermed skape en nisje fylt av resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa, kan oppnå ved å øke dets motstand biofilm miljøer og ekstracellulært DNA har vist seg å være den viktigste strukturell støtte av sin biofilm arkitektur 52. Selv som tHan samfunnsstruktur restituert, ekstracellulære DNA kan ha forblitt i CF-spytt. Derfor er disse data at hypoton lysis, og vasketrinnene er presentert i denne arbeidsflyten potensielt ha nytte i ikke bare å fjerne human-avledet DNA, men også mikrobielt avledede ekstracellulært DNA som kan uriktige opplysninger om den faktiske mikrobiologiske profiler. Metatranscriptomics En høy kvalitet metatranscriptome bør inneholde relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser og representerer en objektiv prøvetaking av felles transkripsjoner (mRNA). På grunn av den korte halveringstiden og begrenset mengde av mRNA, er det kritisk at den protokoll som er presentert her, reduserer prøvehåndtering for å maksimere antallet transkripter gjenvunnet. I de senere årene har flere tilnærminger for rRNA utarming blitt utviklet og tilpasset i kommersielt tilgjengelige kits. Disse inkluderer Microb Enrich, Ribo-Zero, og sample-spesifikke subtractive hybridizations 53 som er basert på oligonukleotid hybridiseringen, og mRNA-KUN sett som er basert på eksonuklease enzymatisk aktivitet rettet RNA inneholdende et 5&#39;-monofosfat. I tillegg er flere tilnærminger for mRNA enrichments som MessageAmp II-Bakterier Kit som fortrinnsvis polyadenylates og forsterker lineær RNA er også tilgjengelig. Noen av disse metodene (f.eks mRNA-ONLY, Microb E Xpress og MessageAmp) brukes samtidig for optimal effektivitet. Imidlertid er effekten av alle disse tilnærmingene begrenset, spesielt ved arbeid med delvis nedbrutt rRNA, som ofte observert i total RNA hentet fra CF prøver. Polyadenylerings-avhengig RNA-amplifikasjon kan ikke brukes til å generere metatranscriptomes som består av både eukaryot og prokaryote mRNA. I tillegg tilsettes den poly (A) halen til sekvensene kan reduserer mengden av nyttige sekvensdata. Regioner med homopolymere strekninger vil tendens til å ha lavere kvalitet score, cA ved å bruke et betydelig antall leser som skal filtreres ut ved sekvensering og post-sekvensering programvare, og gjennomsnittlig nyttig lese lengde etter trimming av poly (A) haler vil bli redusert betydelig 54. Håndtere komplekse CF mikrobielle samfunn og delvis degradert RNA (Tall 4A og 4C), vår tidligere studie viste at hybridisering-fangst metode ved Ribo-Zero Gold kit var mer effektiv i å fjerne både menneskelig og mikrobiell rRNA i forhold til de kombinerer behandlinger med andre kits 9 (Tabell 3). Den resulterende data tillater samtidig analyse av både menneskelig vert og mikrobielle transkripsjoner. Avhengig av utbytte og kvalitet av RNA, samt endelig valg av sekvense plattform, kan mange av disse prosesser, inkludert cDNA syntesetrinnet være strømlinjeformet med sekvense bibliotek generasjon. For eksempel kan Ribo-Zero behandlet RNA brukes til å lage metatranscriptome sekvense librarier ved hjelp ScriptSeq RNA-Seq Bibliotek Forberedelse kit. Metagenomic analyse av dyreassosierte samfunn gir en omfattende fremstilling av den samlede funksjonell enhet som omfatter verts og assosierte lokalsamfunn. Arbeidsflyten presentert her kan tilpasses en rekke komplekse dyreassosierte prøver, spesielt de som inneholder tykt slim, høye mengder av cellerester, ekstracellulært DNA, protein og glykoprotein-komplekser, så vel som vertsceller i tillegg til det ønskede virale og mikrobielle partikler. Selv om virale og mikrobielle partikler kan gå tapt for hvert skritt, partikler isolering og rensing er nødvendig for å minimalisere mengden av vertens DNA. Mens metagenomikk data gir metabolske potensialer av de samfunnene som ble undersøkt, metatranscriptomics utfylle dette ved å avsløre differensial uttrykk for kodede funksjoner 9. En omfattende vurdering av genomikk og transkripsjoner data har gitt nye insights til dynamikken i samfunnet interaksjoner og forenkler utviklingen av bedre behandlinger 9,10,55.

<html> Virale og mikrobielle samfunn er forbundet med det menneskelige legeme har blitt undersøkt i stor utstrekning i det siste tiåret gjennom anvendelse av sekvenseringsteknologi 1,2. Resultatene har ført til anerkjennelse av betydningen mikrober i menneskers helse og sykdom. Storsatsingen kom fra Normalflora prosjekt som beskriver bakterier (og noen archaea) bosatt på menneskelig hud, og innen munnhulen, luftveier, urogenitaltractus, og mage-tarmkanalen tre. Ytterligere mikrobiomer studier av friske mennesker luftveiene gjennom bronchoalveolar lavage (BAL) 4,5 og nasofaryngeale spinner 4 har vist at lungen kan tjene som en miljøprøvetaking enhet, resulterer i forbigående mikrobiell kolonisering i luftveiene. Imidlertid kan virkningen av mikrobiell kolonisering i svekket luftveis overflater føre til alvorlige og kroniske lungeinfeksjoner, slik som de har sett i Cystisk fibrose (CF) pasienter. t &quot;&gt; CF er en dødelig genetisk sykdom forårsaket av mutasjon i cystisk fibrose transmembranregulator (CFTR) gen 6. Disse mutasjoner gir opphav til defekte CFTR proteiner som i sin tur påvirker transepitelial ionetransport over den apikale overflate av epitel. Sykdommen rammer flere organsystemer, men de fleste av dødelighet og sykelighet skyldes CF lungesykdom 7. CF lunge gir et unikt økosystem for mikrobiell kolonisering. Feilen i ion transport forårsaker slim for å bygge opp i CF luftveiene, noe som skaper microenvironments består av aerobic , mikroaerofile og anaerobe kammer forankret ved en statisk næringsrik slimhinneoverflaten. Dette letter miljø kolonisering og formering av mikroorganismer, inkludert virus, bakterier og sopp. Akutte og kroniske pulmonale mikrobielle infeksjoner føre til konstant men ineffektive immunresponser som resulterer i omfattende luftveis ombygging, tap av lungekapasitet, og til slutt Pulmoordinært fiasko. Bakteriesamfunn knyttet til CF lunge har blitt godt beskrevet ved hjelp av både kultur-avhengige og kulturuavhengig tilnærminger, som inkluderer hjelp 16S ribosomalt RNA (rRNA) gensekvensering 8 og hagle metagenomikk 9,10. 16S rRNA-basert tilnærming er i stand til å karakterisere et bredt spekter av mikrobielle arter og fange brede skift i samfunnet mangfold. Det er imidlertid begrenset i sitt vedtak i å definere de samfunnene (oppsummert i Claesson et al. 2010 11) og spådommer om metabolske potensialer er begrenset til de generelle funksjoner som er kjent for taxa identifisert. Derfor 16S rRNA-genet sekvenseringsmetoder er utilstrekkelige for den nødvendige taksonomiske og funksjonell analytisk nøyaktigheten av de ulike mikrobielle samfunn stede i CF lungene. Den metagenomic tilnærming beskrevet her utfyller 16S rRNA-basert tilnærming, overvinner sine begrensninger, og gjør det mulig for en relativt effektiv måteå analysere både den mikrobielle samfunn taksonomi og genetiske innholdet i CF lungene. Mikrobiell DNA isolert fra dyreassosierte prøvene inneholder ofte en vesentlig mengde av vertens DNA. CF-spytt eller lunge vevsprøver inneholder vanligvis en stor mengde av humant DNA utgitt av neutrofiler i immunresponsen, ofte mer enn 99% av den totale DNA-12-14. Selv om noen intakte humane celler kan være tilstede, er det meste av dette DNA fri i løsning eller adsorbert på overflaten av mikrober. I tillegg er nærvær av usedvanlig tyktflytende slim plugger, cellulært avfall og andre ukjente forurensninger ytterligere kompliserer isolering av mikrobielle celler. Flere metoder ble testet for å tappe disse prøver av humant DNA, inkludert Percoll gradienter til separate humane fra mikrobielle celler 15, behandling med DNase I, etidiumbromid monoazide å selektivt degradere human DNA 16, og både Molysis kit, alle med begrenset suksess.<html> Til dags dato har den mest effektive mikrobielle DNA-renseprosedyre for CF-spytt har vært en modifikasjon av fremgangsmåten beskrevet av Breitenstein et al. (1995) 17. Denne tilnærmingen, heri kalt hypotonisk lysis (HL) -metoden, benytter en kombinasjon av β-merkaptoetanol for å redusere slimstoff disulfidbindinger, hypotonisk lysis av eukaryote celler, og DNase I-behandling av oppløselig DNA-9. Til tross for mangelen på alternativer HL metoden reist noen bekymringer på grunn av (i) mulige skjevheter som følge av uønsket lyse av mikrober og (ii) hvorvidt de observerte svingningene i samfunnet sammensetning 9,10 er en gjenstand av variasjoner knyttet til utvalgets behandling. I tillegg til genereringen av hagle metagenomes, tar vi disse problemene ved å sammenligne 16S rDNA-profiler av det totale DNA og mikrobielle DNA ekstrahert fra HL-metoden ved å bruke samme sett av spyttprøver samlet fra en enkelt pasient over syv påfølgende dager. ent &quot;&gt; Sammenlignet med mikrobielle samfunn, er karakterisering av virus samfunn assosiert med dyr begrenset 18,19 Virus samfunn i CF airways har bare vært preget minimalt 20 -.. 22 Den første metagenomic studien karakteriserer DNA av virus lokalsamfunn i CF airways viste at de fleste virus forbundet med CF lungene er fager 20. Den metabolske potensialet i fag i CF og ikke-CF individer var signifikant forskjellig. Nærmere bestemt fag samfunn i CF individer gjennomført gener reflekterende av bakterielle verts tilpasninger til fysiologi av CF luftveiene, og bakterielle virulens 20. Påfølgende metagenomic studier av virus i CF lungevev demonstrerte tydelig romlig heterogenitet av virus lokalsamfunn mellom anatomiske regioner 22. I tillegg CF lungevev næret den laveste viral mangfold observert hittil i ethvert økosystem 22. De fleste virus identifisert var fagermed potensiale til å infisere CF patogener. Imidlertid ble eukaryote virus som herpesviruses, adenovirus, og human papilloma virus (HPV) også oppdaget. I ett tilfelle hvor cyster i lungevevet ble observert under disseksjon, ble mer enn 99% av et humant papillomavirus genom utvinnes, selv om pasienten aldri ble diagnostisert med en lunge papilloma eller karsinom. Dette tyder på at det virale mangfold tilstede ikke bare gjenspeiler graden av vevsskade, men kan også eksponere og forklare en underliggende uncharacterized sykdom. Protokollen beskrevet her gir en enkel, men effektiv måte å isolere viruslignende partikler (VLP) fra prøver som består av store mengder tykt slim, vert og mikrobielle celler, gratis DNA, samt celleavfall. Utfyller metagenomikk, er metatranscriptomics brukes til å overvåke dynamikken i genuttrykket over den mikrobielle samfunn og verts 9,23. I dette tilfelle, både mikrobielt og host mRNA må fortrinnsvis valgt. Siden bakterielle mRNAs ikke er polyadenylert, kan en oligo-dT-baserte mRNA pull-down metoden ikke utnyttes. Polyadenylerings-avhengig RNA-amplifikasjon, kan ikke brukes i verts-assosiert prøver hvis prøvene er kjent for å inneholde store mengder av eukaryot mRNA. Mange dyreassosierte prøvene, inkludert CF-spytt, inneholder en høy tetthet av celler, i tillegg til høye mengder av cellerester og nukleaser som inkluderer RNaser. Derfor er en annen utfordrende oppgave å hindre omfattende RNA degradering under metatranscriptome behandling. I de fleste tilfeller total-RNA ekstrahert fra CF-spytt er delvis nedbrutt, noe som begrenser den nedstrøms applikasjoner og nytten av den utledede RNA. I de senere årene har flere tilnærminger for rRNA utarming blitt utviklet og tilpasset i kommersielt tilgjengelige kits. Effekten av disse tilnærmingene er imidlertid begrenset, spesielt ved arbeid med delvis degradert rRNA 9,24. Metodene som benyttes her tillateed for gjenfinning av delvis nedbrutt total RNA egnet for effektiv nedstrøms total rRNA fjerning. Direkte sammenligning av effektiviteten i rRNA fjerning fra delvis nedbrutt total RNA sammenligne to forskjellige kits ble illustrert ved Lim et al. (2012) 9. Samlet sett er målet med dette manuskriptet for å gi et komplett sett av protokoller (figur 1) for å generere viral og mikrobielle hagle metagenomes, og en metatranscriptome, fra et enkelt dyr-assosiert prøven etter indusert spyttprøve som et eksempel. Molekylær laboratorium arbeidsflyt bør inkludere egne pre- og postforsterkningsområder for å minimere krysskontaminering. Metodene kan enkelt tilpasses andre typer prøve eksempel vev 22, nasofaryngealt og orofaryngeal vattpinner 25, bronchoalveolar lavage (BAL) og koraller (upubliserte data). Hver prøve skal behandles umiddelbart etter samling spesielt når mikrobielle metagenomikk og møtteatranscriptomics studier er ønskelig. Hvis prøvene ble frosset, begrenser det isolering av intakte mikrobielle celler for mikrobielle metagenomes som frysing forstyrre cellens integritet. Imidlertid, frysing ikke til hinder metatranscriptomics og viral isolasjon, men kvaliteten av RNA og mengden av virale partikler utvinnes kan påvirkes gjennom fryse-tineprosessen. Det er viktig å merke seg at indusert sputum har fungert som den primære kilde til prøver i mange studier assosiert med voksne CF-pasienter og andre kroniske lungesykdommer 26,27 som BAL kan være for invasiv. I våre studier ble spyttprøver oppsamlet med en forsiktig og konsistent prøvetakingsmetoden, dvs. følgende munnvann og skylling av munnhulen ved hjelp av steril saltoppløsning for å holde orale mikrober forurensninger innenfor spyttprøver til et minimum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

Tilgjengeligheten av high-throughput sekvensering har revolusjonert mange felt av biologien. For bedre å forstå verts-assosierte virale og mikrobielle samfunn, ble en omfattende arbeidsflyt for DNA og RNA-ekstraksjon utviklet. Arbeidsflyten samtidig genererer viral og mikrobielle metagenomes, samt metatranscriptomes, fra en enkelt prøve for neste generasjons sekvensering. Koblingen av disse metodene gir en oversikt over både de taksonomiske egenskaper og samfunnet kodet funksjoner. De presenterte metoder bruker Cystisk fibrose (CF) oppspytt, en problematisk prøvetype, fordi det er usedvanlig tyktflytende og inneholder høy mengde muciner, gratis nøytrofile DNA, og andre ukjente forurensninger. Protokollen beskrevet her målrette disse problemene og hell gjenopprette viral og mikrobiell DNA med minimal menneskelig DNA forurensning. Å utfylle metagenomikk studiene ble en metatranscriptomics protokoll optimalisert for å gjenopprette både mikrobiellog verts mRNA som inneholder relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser. En oversikt over dataegenskaper er presentert for å tjene som en referanse for å vurdere suksessen av metodene. Andre CF spyttprøver ble også samlet inn til (i) evaluere konsistensen av mikrobiomer profiler innenfor syv påfølgende dager innenfor en enkelt pasient, og (ii) sammenligne konsistensen av metagenomic tilnærming til en 16S ribosomalt RNA gen-basert sekvensering. Resultatene viste at daglig svingning av mikrobielle profiler uten antibiotika perturbasjon var minimal og taksonomi profiler av de vanlige CF-assosierte bakterier var meget lik mellom 16S rDNA-biblioteker og metagenomes generert fra hypotonisk lysis (HL) avledede DNA. Forskjellene mellom 16S rDNA taksonomiske profiler genereres fra total DNA og HL-avledet DNA antyder at hypoton lysis og vasketrinnene nytte på ikke bare å fjerne human-avledet DNA, men også mikrobielt avledede extracellular DNA som kan gi feil opplysninger de faktiske mikrobielle profiler.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Rense Impure: Sekvense Metagenomes og Metatranscriptomes fra Komplekse Animal-assosiert Samples

Bruke cystisk fibrose airway som et eksempel, presenterer manuskriptet en omfattende arbeidsflyt består av en kombinasjon av metagenomic og metatranscriptomic tilnærminger for å karakterisere mikrobiell og viral lokalsamfunn i dyreassosierte prøver.

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kjemisk-blokkert Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput profilering av bestemt protein Glykosylering i komplekse prøver

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Påvisning av sjeldne genomisk Varianter fra Pooled Sekvensering Bruke Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Målrettet RNA sekvense analysen å karakter Gene Expression og Genomisk Endringer

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Trekke membran nanorør fra gigantiske Unilamellar blemmer

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...