Name: purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) delas Forest Rohwer. Vi tackar Epicentrum, ett Illumina bolag för att ge tidig tillgång till Ribo-Zero Epidemiologi kit. Vi tackar Mark Hatay för design och produktion av ultracentrifugeröret innehavaren. Vi tackar Andreas Haas och Benjamin Knowles för kritiska läsningar och diskussioner av manuskriptet, och Lauren Paul för att bistå filmandet processen.

OBS: inducerat sputum samlades in i enlighet med University of California Institutional Review Board (HRPP 081.500) och San Diego State University Institutional Review Board (SDSU IRB # 2121), genom forskningskoordinator vid University of California, San Diego (UCSD ) vuxna CF klinik. 1. Provtagning och förbehandling (Förbehandla Prover inom 30 min efter samling) <ol><li> Före provsamling, etikett fyra 15 ml rör som: (i) viralt metagenome, (ii) mikrobiell metagenome, (iii) metatranscriptome, och (iv) extra upphostningar. Upprepa för varje prov. Tillsätt 2 ml 0,1 mm kiseldioxidpärlor i röret märkt &quot;Metatranscriptome&quot;, följt av 6 ml guanidinisotiocyanat baserad RNA lyseringsbuffert (GITC-lysbuffert). </li><li> Under provsamling, använd steril koksaltlösning (60 ml) som en mun skölj att minimera förorening med orala mikrober. Samla sputumprover under en 30 min period efterinhalation av 4 ml av 7% hyperton saltlösning via en nebulisator. Processprover omedelbart, såsom beskrives nedan. </li><li> Späd provet till en total volym av 8 ml. <ol><li> Uppskatta provvolym genom att väga tom sputum cup före och efter provtagningen. </li><li> Om volymen av provet är mindre än 8 ml, tillsätt lämplig mängd av 0,02 ^ m-filtrerad 1 x PBS för att generera en total provvolym på minst 8 ml. </li><li> Omedelbart homogenisera provet med en 3 ml sprutan tills inga synliga klumpar kvar inom sputum </li><li> Med samma spruta, utarbeta 2 ml slem och omedelbart gå till steg 1.4. </li></ol></li><li> Bevara Total RNA från upphostningsprov <ol><li> Injicera 2 ml slem prov från steg 1.3.4 i &quot;metatranscriptome&quot; rör innehållande kiseldioxid pärlor och GITC-lyseringsbuffert. </li><li> Stäng locket och försegla röret säkert med Parafilm för att undvika läckage. </li><li> Homogeni sputum omedelbart vid medelhastighet under 10 kmn. Beroende på virvel tillgängliga, placera röret horisontellt och säkra med tejp vid behov. </li><li> Håll röret vid 4 ° C eller i ett is låda och transport till laboratoriet om så är nödvändigt. </li></ol></li><li> Med samma spruta, delprov 2 ml slem vardera i rören märkta &quot;viral metagenome&quot; och &quot;mikrobiell metagenome&quot; och överföra de återstående slem från sputum koppen i röret märkt &quot;extra slem&quot;. </li><li> Förvara alla rör vid 4 ° C eller isbox och transport till laboratoriet vid behov. </li></ol> 2. Generera Viral Metagenome <ol><li> Framställning av buffertar och lösningar <ol><li> Förbered 50 mM ditiotreitol (DTT) i förväg och förvara vid 4 ° C. Detta är stabil i 2 veckor. </li><li> Förbered Saline Magnesium (SM) buffert (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO 4, 50 mM Tris-HCl; justera pH till 7,4. Filter sterilisera (0,02 um porstorlek) och förvara i rumstemperatur. </li&gt; <li> Förbered DNas I enzym till 100 U / l (i molekylär kvalitet vatten) från frystorkat bovint pankreas DNas I enlighet med den verksamhet som definieras av Dornase enhet / mg torrvikt. </li><li> Förbered 10x DNas I-buffert (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl2; justera pH till 6,5. Filter sterilisera (0,02 um porstorlek) och förvara i rumstemperatur. </li><li> Förbered 4% paraformaldehyd. </li><li> Förbered 200x TE-buffert: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Filter sterilisera (0,02 um porstorlek) och förvara i rumstemperatur. </li><li> Bered 10 ml av 10% natriumdodecylsulfat (SDS) med användning av molekylärbiologisk kvalitet vatten. </li><li> Förbered 50 ml CTAB / NaCl (10% CTAB. 700 mM NaCl) med hjälp av molekylärbiologisk kvalitet vatten. Lös CTAB över natten. Om fällningar kvarstår, värma upp lösningen vid 65 ° C. Lösningen är mycket viskös i rumstemperatur. OBS: Den filtrering av buffertar som använder 0,02 ìm filter medger avlägsnande av viruslika partiklar i lösningen, men intefri nukleinsyra föroreningar syra. </li></ol></li><li> Prov Förbehandling <ol><li> Bered lämplig mängd färskt 6,5 mM ditiotreitol (DTT). </li><li> Späd blandningen med tillsats av 0,02 ^ m-filtrerad SM-buffert för att alstra en total volym av 6 ml. </li><li> För att underlätta slem upplösning, tillsätt lika volym (6 ml) av 6,5 mM ditiotreitol (DTT) till provet, skaka kraftigt för att blanda och inkubera under en timme vid 37 ° C. </li><li> Vortex det behandlade provet kraftigt och centrifugera vid 10 ° C, 3056 x g under 15 till 20 min. </li><li> Samla upp supernatanten i en ny 15 ml tub. </li><li> Upprepa steg 2.2.3 och 2.2.5 för nästa prov. </li><li> Överföring och filtrera supernatanten med ett filter 0,45 | im är monterad på en spruta in i en ny 15 ml tub. OBS: Om filter träskor, hämta proverna från sprutan och utelämna filtreringssteget. </li><li> Ta en 100 l delprov av 0,45 um-filtrerat prov, utför kloroform och DNas I-behandling (se seInsatser 2.3.12-2.3.15) och tillsätt lika stor volym av 4% paraformaldehyd för att fixera provet för epifluorescensmikroskopi (Figur 2A). </li><li> För en &quot;catch-all&quot; viruspartiklar anriknings synsätt (se diskussion), gå till steg 2.3.12 att utelämna viruspartiklar urval baserat på cesiumkloridgradient ultracentrifuge. Emellertid kan detta resultera i kloroform-resistent bakteriell förorening och högre mängd värd-DNA i det virala lysatet. </li></ol></li><li> Viral lika partiklar (VLP) Anrikning och rening <ol><li> Förbered individuell cesiumklorid (CsCl) lösningar genom upplösning av den lämpliga mängden av CsCI med ofiltrerat SM-buffert till den önskade densiteten (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml och 1,2 g / ml). Filtrera varje lösning genom ett 0,02 pm filter före användning. </li><li> Konfigurera CsCl-gradient som visas i figur 2B. </li><li> Belastning 1 ml av 1,7 g / ml i varje rör, belastning 1 ml 1,5 g / ml i varje rör, belastning 1 ml 1,35 g/ ml i varje rör, last 1,2 g / ml i varje rör (tillval), och slutligen lasta 6-8 ml prov i respektive rör. Markera enstaka skikt för att beteckna placeringen av varje fraktion. </li><li> Balanserar varandra motsatta par rör på 1 mg. </li><li> Lasta varje rör i spinn hinken. Spin alla skopor även om de är tomma. Ladda spin skopan på rotorn. </li><li> Centrifugera vid 82844 xg vid 4 ° C under 2 h. </li><li> Efter centrifugering, försiktigt bort rören från innehavaren utan att störa de densitetsgradienter. </li><li> Med användning av en 3 ml spruta med en 18 G nål, genomborra röret strax under 1,5 g / ml densitet skikt (figur 2, röd pil) och dra ~ 1,5 ml in i sprutan. </li><li> Samla upp den övre fraktionen genom att långsamt ta bort nålen och att låta den återstående fraktionen i röret för att droppa in i ett nytt 15 ml rör genom punktionen. Märk detta som &quot;övre fraktionen avfall&quot;. </li><li> Samla 1,5 g / ml FRACTIOn (innehållande VLP) från sprutan genom att mata ut innehållet i två nya mikrofugrör. </li><li> Upprepa steg 2.3.8-2.3.10 för alla prover. </li><li> Lägg 0,2 volym kloroform i den virala koncentratet, skaka kraftigt, inkubera vid RT i 10 min, centrifuge vid max hastighet i 5 min, och samla vattenfasen. </li><li> Lägg 10x DNas buffert och DNas I (slutlig koncentration = 2,5 U / | il) i kloroform behandlade viruskoncentrat, och inkubera vid 37 ° C under 1,5-2 h. </li><li> Inaktivera DNas aktiviteten vid 65 ° C i 15 minuter. </li><li> Avlägsna 15 ul av kloroform och DNas I-behandlad virusfraktionen till ett nytt rör och tillsätt 15 | il 4% paraformaldehyd för att fixera provet för epifluorescensmikroskopi. </li></ol></li><li> DNA-extraktion <ol><li> Pool virala koncentrat från varje prov i en rengjord och autoklaveras 50 ml Oak Ridge höghastighetståg centrifugrör. </li><li> Lägg till följande: 0,1 volym 200x TE-buffert, 10 pl 0,5 M EDTA per ml sriklig, 1 volym formamid och 10 pl glykogen. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 30 min. </li><li> Använda de nya volymer, tillsätt 2 volymer av rumstemperatur 100% etanol. Blanda väl och inkubera vid 4 ° C under minst 30 min. </li><li> Pellets DNA genom spinning röret vid 17.226 xg under 20 min, vid 4 ° C med användning av en SS-34-rotor. </li><li> Kassera supernatanten försiktigt med hjälp av en serologisk pipett. Tvätta pelleten två gånger med iskall 70% etanol. </li><li> Avlägsna så mycket vätska som möjligt och göra det möjligt för pelleten lufttorka vid rumstemperatur i 15 min. </li><li> Resuspendera DNA-pelleten i 567 | il 1 x TE-buffert (pH 8,0). OBS: Lämna minst 15 min för fullständigt upplöst vid rumstemperatur. Förvara återsuspenderades DNA över natten vid 4 ° C tills vidare bearbetning. </li><li> Överför hela 567 pl suspenderade DNA-lösning i en ny 1,5 ml mikrofugrör. Lägg 30 pl förvärmda 10% SDS och 3 pl proteinas K (20 _6; g / ml), blanda väl och inkubera i 1 timme vid 56 ° C. Pre-varma CTAB / NaCl vid 65 ° C. </li><li> Lägg 100 pl av 5 M NaCl och blanda väl. Lägg 80 | il av förvärmda CTAB / NaCl-lösning, virvel, och inkubera under 10 min vid 65 ° C. </li><li> Lägg lika stor volym kloroform, virvelström för att blanda, och centrifugera vid 16.100 xg under 5 minuter. </li><li> Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör. Tillsätt en lika volym av fenol / kloroform, virvelström för att blanda, och centrifugera vid 16.100 xg under 5 minuter. </li><li> Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör. Tillsätt en lika stor volym kloroform, virvelström för att blanda, och centrifugera vid 16.100 xg under 5 minuter. </li><li> Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrofugrör. Lägg lika volym isopropanol till supernatanten fraktionen, blanda och inkubera vid -20 ° C under minst 30 min. </li><li> Pellets DNA, centrifugera vid 16.100 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Pipettera supernatanten försiktigt och skölj pelleten två gånger med iskall 70% etanol. </li&gt; <li> Utför en kort centrifugering och avlägsnande av kvarvarande etanol ur röret. Lufttorka pelleten i 15 min. </li><li> Resuspendera DNA-pelleten med 50 pl elueringsbuffert (5 mM Tris, pH 8,5). Låt pelleten rehydrera i minst 5 min i rumstemperatur. </li><li> Kvantifiera DNA med en högkänslig fluorescens-baserad analys. </li></ol></li><li> Förstärkning med hjälp Phi29 polymeras (tillval) <ol><li> Bered 2x pamingsbuffert: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2. </li><li> Späd Phi29 DNA-polymeras till 5 U / ^. </li><li> Förblandning provbuffert, som består av 50 pl slumpmässig hexamer primer (100 M), 125 pl 2x pamingsbuffert och 25 pl vatten. Alikvotera och förvara vid -20 ° C. </li><li> Förblandning reaktionsbuffert, som består av 100 l Phi29 10x buffert, 40 pl 10 mM dNTP och 560 l vatten. Alikvotera och förvara vid -20 ° C. </li><li> Lägg ett pl mall-DNA i 4 pl provbuffert. </li><li> Inkubera the blandningen vid 95 ° C under 3 min och kyler på is. </li><li> Lägg 14 | il reaktionsbuffert i blandningen från 2.4.4, blanda genom att pipettera upp och ned. </li><li> Lägg ett pl av Phi29 DNA-polymeras, blanda genom att pipettera upp och ner, och inkubera vid 30 ° C under 18 h följt av 65 ° C under 10 min. </li><li> Städa upp reaktionerna använder iska DNA-kolonner eller fenol / kloroform och etanolutfällningar. </li></ol></li><li> Epifluorescensmikroskopi (Se Haas et al. 2014 28 för filtrering systeminställnings) OBS: Efter isolering och rening, epifluorescensmikroskopi med nukleinsyra-färgämnen kan användas för att verifiera närvaron och renhet av virala partiklar i prover (figurerna 2A och 2C). Fri DNA i provet kan ge upphov till hög bakgrundsfluorescens. Därför bör provet vara DNas I-behandlad före fixering och färgning för mikrofotografier. <ol><li> Förbered monteringslösning (0,1% askorbinsyra, 50% glycerol). Lägg 100 pl av 10% askorbinsyra till 4,9 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), blanda omsorgsfullt. Tillsätt 5 ml av 100% glycerol till blandningen, blanda väl och märka röret som &quot;mount&quot;. </li><li> Filter montera med hjälp av en 0,02 um aluminiummatris engångsspruta filter, portion i mikrofugrör, och förvara vid -20 ° C. </li><li> Alikvot 100 pl prov till ett nytt mikrofugrör och lägga lika stor volym av 4% paraformaldehyd fixa VLP. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under åtminstone 10 min. </li><li> Gör upp volymen till 1 ml genom att tillsätta 800 pl 0,02 um-filtrerat vatten. Lägg ett pl av SYBR Gold fläck i röret och inkubera vid rumstemperatur i 10 min. </li><li> Ställ in filtreringssystem genom att slå på vakuumpumpen mellan -9 och -10 psi (-62,1 och -68,9 kPa). </li><li> Tvätta piedestalen med vatten och placera en 0,02 um aluminiummatrisfilter med ringformig polypropylen stödring i filter piedestal. </li><li> Placera en filtertorn på toppen av filtret piedestal med filtret och säker med en klämma. </li><li> Pipet innehållet från 1,5 ml mikrofugrör i filtertornet, och låt några minuter för prov för att filtrera igenom. </li><li> Etikett och pipett 10 ul mount reagens i ett objektglas. </li><li> Låt vakuum på när du tar bort filtret tornet och klämma. </li><li> Ta försiktigt bort filtret från filter piedestal och blot botten av filtret med en Kimwipe, sedan placera filtret direkt på toppen av berget på objektglaset. </li><li> Pipet ytterligare 10 pl mount reagens på filter och placera ett täck över filtret. </li></ol></li></ol> 3. Generera Mikrobiell Metagenome <ol><li> Framställning av buffertar och lösningar <ol><li> Bered 50 ml 1x DNas buffert: 50 mM NaAc, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2; justera pH till 6,5. Filtersterilisera (0,22 ^ m) och lagravid rumstemperatur. </li><li> Förbered DNas I enzym till 1000 U / l (i molekylär kvalitet vatten) från frystorkat bovint pankreas DNas I enlighet med den verksamhet som definieras av Dornase enhet / mg torrvikt. </li><li> Bered 100 ml av SE-buffert: 75 mM NaCl, 25 mM EDTA; justera pH till 7,5. Filter sterilisera (0,22 um) och förvara i rumstemperatur. </li></ol></li><li> Prov Förbehandling Före DNA Extraction <ol><li> Späd blandningen med tillsats av 5 volymer av 0,22 ^ m-filtrerad 1 x PBS. Till exempel, tillsätt 10 ml 1x PBS i 2 ml prov. </li><li> Lägg β-merkaptoetanol till 2% (volym / volym) slutlig koncentration. Vagga blandningen (i dragskåp) vid rumstemperatur under 2 h. </li><li> Spin provet vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten. </li><li> Återsuspendera pelleten i 10 ml av molekylärbiologisk kvalitet vatten (eller 0,22 | im filtrerat vatten) och inkubera vid rumstemperatur i 15 min. </li><li> Upprepa steg 3.2.3 och 3.2.4 gång. </li><li> SpiN vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten. </li><li> Återsuspendera pelleten i 5 ml 1x DNas buffert och tillsätt 15 | il DNas I (1000 U / ^) per ml av provet. </li><li> Inkubera vid 37 ° C med upprepad blandning under 2 h. </li><li> Inaktivera DNas aktiviteten vid 65 ° C i 15 minuter. </li><li> Spin vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten. Suspendera pelleten i 10 ml SE buffert. </li><li> Upprepa steg 3.2.10. </li><li> Spin vid 10 ° C och 3056 x g under 15 min och kassera supernatanten. </li><li> Suspendera pelleten i 2 ml SE buffert, och överför till två mikrofugrör. </li><li> Pellets cellerna i mikrofugrör. Snurra rören vid 16.100 xg vid rumstemperatur under 15 min. </li><li> Avlägsna supernatanten och extrahera DNA från de pelleterade celler med användning av ett genomiskt DNA-extraktion kit, Grampositiva variationsprotokoll. </li></ol></li></ol> 4. Generera Metatranscriptome <ol><li> Prov Pre-Behandling <ol><li> Utför mekanisk lys av celler genom pärla slå i GITC-lyseringsbuffert omedelbart efter provtagning och homogenisering. Se steg 1.4. </li><li> Snurra blandningen vid 4 ° C och 600 xg under 5 minuter för att pelletisera kiseldioxidpärlor. </li><li> Överför supernatanten till ett nytt rör. </li><li> Tillsätt 200 pl kloroform för varje 750 pl GITC-lyseringsbuffert används, skaka kraftigt för hand i 15 sek, inkubera vid rumstemperatur i 10 min, och centrifugera vid 4 ° C och 3056 xg under 15 min. Under denna 15 min spinn, förbereda för steg 4.2. </li><li> Efter 15 min spinn (en klar åtskillnad mellan vattenfasen-inter-organiska fasen former), extrahera vattenfasen (utan att störa interfas) till nya RNas fria rör (s). OBS: Den vattenhaltiga fasen innehåller RNA. Håll rören på is fram till nästa steg. </li></ol></li><li> Utför total RNA-extraktion och rening med hjälp av kommersiellt tillgängliga kolumnbaserad RNA rening kit eller conventional isopropanol baserade RNA nederbörd. <ol><li> Kiseldioxidkolonn-baserade RNA Rening <ol><li> Mät den totala volymen av den vattenhaltiga fraktionen erhålles. </li><li> Lägg lämplig volym av RNA-bindande buffert till prov och blanda väl. </li><li> Justera blandning till lämpliga bindande villkor enligt tillverkarens protokoll. Blanda väl och gör en kort centrifugering. </li><li> Ladda blandningen i RNA-kolumnen. För en stor volym prov, använda flera lastning och ladda varje kolumn upp till 4x. Annars överväga att använda flera kolumner för varje prov. </li><li> Tvätta kolonnen lämpligt enligt tillverkarens protokoll. </li><li> Eluera RNA med åtminstone 30 ^ il RNas-fritt vatten. Dubbel eluering kommer något öka utbytet av RNA. Detta kommer dock att späda ut RNA-koncentration. </li><li> Mät RNA-koncentrationen och gå direkt till DNas I-behandling. Använd Bioanalyzer att kontrollera kvaliteten hos RNA (rekommenderas). </li></ol&gt; </li><li> RNA Utfällning <ol><li> Tillsätt en lika stor volym isopropanol (t.ex., 500 | il isopropanol till 500 ul av vattenhaltig fraktion) och 2 ul av 10 ug / ul RNas-fri glykogen till provet. </li><li> Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 10 min. </li><li> Centrifugera vid 12000 xg och 4 ° C under 15 min. </li><li> Ta försiktigt bort supernatanten, tillsätt 1 ml RNas-fri 75% etanol. Snurra blandningen vid 7500 xg och 4 ° C under 5 min för att se till att pelleten är intakt. </li><li> Försiktigt bort etanolen. </li><li> Upprepa steg 4.2.2.4 och 4.2.2.5 gång. </li><li> Lufttorka pelleten i 10 min. </li><li> Rehydrera pelleten i 50 | il RNas-fritt vatten, inkubera vid 55 ° C under 5 min och fortsätta direkt till DNas-behandling. Använd Bioanalyzer att kontrollera kvaliteten av RNA (rekommenderas). </li><li> Store RNA i portioner vid -20 ° C eller -80 ° C för långtidsförvaring. </li></ol></li></ol></li></ol&gt;

The authors have nothing to disclose.

Virala metagenomiken Viruspartiklar är koncentrerade använder polyetylenglykol (PEG) utfällning eller små volym koncentratorer. I vissa fall kan koncentrationen inte behövas, men pre-filtrering eller låghastighetscentrifugering steg används för att avlägsna eukaryota och mikrobiella celler. Viral lysat kommer ytterligare berikas och renas med hjälp av densitetsgradient ultracentrifuge 9,41 eller mindre storlek filter (t.ex. 0,45 pm) för att ta bort eukaryota och stora mikrobiella celler 25. Densitetsgradient-ultracentrifugering utförs typiskt med täta men inerta lösningar såsom sackaros eller cesium-klorid för att isolera och koncentrera virala partiklar 41. Fysisk separering är baserad på storleken och flytdensitet av virala partiklar. Därför lämpligt val av filter porstorlek och den rigorösa framställning av gradienter är väsentliga för att isolera specifika virala samhällen, eftersom framgången för fysiska återhämtningVLP bestämmer samhället isolerade 41 (dvs viruspartiklar som inte passerar genom filtret eller faller inom utvinning tätheten kommer inte upptäckas i metagenome). Efter viral isolering och koncentration, kan det finnas kontaminerande icke-viralt genomiskt material som är närvarande i provet, både i form av fria nukleinsyror och mikrobiell och eukaryota celler. Därför, är det kritiskt att kontrollera renheten av virala partiklar i prover (figurerna 1A och 1B). En kloroformlösning behandling är vanligen används för att lysera återstående cellerna, följt av nukleasbehandling att nedbryta fria nukleinsyror före nukleinsyra extraktion. En varning till den presenterade arbetsflödet var användningen av densitetsgradienten separation för att isolera viruspartiklar som det kan utesluta omhöljda viruspartiklar som kan vara för stark för att komma in i CsCl lutning. Ett alternativ &quot;catch-all&quot; metod är att utelämna densitetsgradienten separation och isolera samhället DNA från de 0,45 um - filtrat behandlades med kloroform och DNas I. Detta tillvägagångssätt är också lämpligt att rymma små provvolymer som de från Toppar eller blodplasma. Detta kan dock resultera i kloroform resistenta bakteriekontamination och högre mängd DNas I-resistenta extracellulärt DNA. Aktuella sekvense protokoll kräver 1 ng till 1 pg av nukleinsyror för förberedelse sekvense bibliotek vari högre DNA avkastning ger ett större utbud av sekvense alternativ. Den DNA-koncentration av genererade viromes varierar ofta från under detektionsgränsen till mer än 200 ng / l. Mängden av virala nukleinsyror återvunna kan vara otillräckligt för direkt sekvensebiblioteks förberedelser. I sådana fall är nukleinsyraamplifiering väsentlig. Linker förstärknings hagelgevär bibliotek (LASLs) 2,42,43 och hela genomet förstärkning baserad på flera förskjutningsförstärkning (MDA) är de tvåmetoder som används oftast för att generera tillräckligt med DNA för sekvensering. MDA metoder såsom de som baseras på Phi29 DNA-polymeras är kända för att lida av förstärknings fördomar, och kan företrädesvis förstärka ssDNA och cirkulärt DNA, vilket resulterar i icke-kvantitativa taxonomiska och funktionell karakterisering 44,45. En optimerad version av LASLs tillvägagångssätt har visat att införa endast minimala fördomar, främjar högre känslighet (för små mängder av utgångsmaterial), och är lätt anpassas för olika sekvense plattformar 43. Emellertid har det tillvägagångssätt många steg, kräver specialiserad utrustning för att minimera DNA-förlust, och är begränsad till dsDNA mallar. I vårt laboratorium, har detta tillvägagångssätt varit framgångsrikt anpassat att förstärka detekterbara och omätbara mängd DNA extraherat från bronkoalveolär lavage-, coral- och havsvatten-härledda VLP (opublicerade och et al. Hurwitz 46). Utveckla dataanalys rörledningar har classically varit en av de mest utmanande aspekterna av viral metagenomik analys på grund av den mycket skiftande och till stor del okända arten av de virala samhällen. Även om det finns uppskattningsvis 10 8 virala genotyper i biosfären hittills nuvarande virusdatabaser innehåller ~ 4000 virala genom, vilket är ungefär 1 / 100.000: i denna ungefärliga totala viral mångfald. Därför likhet baserade sökningar (t.ex. BLAST 47) för taxonomiska och funktionell uppdrag i virus metagenomes besitter inneboende utmaningar. Många sekvenser inte har betydande likheter med genomen i databasen, och därför klassificeras som okända. Även om homologisbaserade sökningar är de viktigaste applikationer för att tilldela taxonomi och funktion för att sekvensdata, har alternativa metoder baserade på databas-oberoende analys utvecklats 48- 50. Fancello et al., 51 ger en fullständig översyn av beräkningsverktyg och algoritmer som används i viral metagenomiken. Mikrobiell metagenomiken Typiskt, den totala mängden DNA som extraherats från hypotona lys behandlade mikrobiella samhällen (HL-DNA) sträcker sig från 20 ng till 5 mikrogram. Utbytet är i hög grad beroende på patientens hälsotillstånd och mängden upphostningsprov uppsamlades, vilket förklarar variationerna som ses i det totala utbytet av HL-DNA som extraherats i denna studie (tabell 2). De kritiska steg att generera sekvensdata av god kvalitet är beroende av kvaliteten på sekvensebibliotek genereras. Figur 2 visar en typisk storleksintervall för sekvense biblioteken genererade från CF slem-härledda mikrobiell DNA med hjälp av en enzymatisk-baserad DNA fragmentering förfarande. Den optimala biblioteksstorleken beror på valet av sekvense plattform och tillämpning, och därför kan det fragmenteförfarandet optimeras, om nödvändigt, genom alternativa metoder såsom ultraljudsbehandling och nebulisering. Förutomde presenterade representativa resultat, är framgången för den presenterade metoden på CF slem samlas in från flera patienter över flera tidpunkter illustreras också i Lim et al. (2012) 9 och Lim et al. (2014) 10. Tidigare studier 9,10 tyder på att varje patient hyser en unik uppsättning av mikrobiell gemenskap som skiftar över tiden, vilket återspeglar uthållighet av de större aktörerna i samhället medan fluktuationer är sannolikt på grund av störningar såsom antibiotikabehandlingar. Huruvida dessa fluktuationer sker dagligen även utan yttre störningar eller på grund av provtagningsförfarandet och provbearbetning, är fortfarande i fråga. Baserat på HL-DNA metagenomic och 16S rDNA amplikon analys, visar 7-dagars längd provtagning att den dagliga fluktuationer i mikrobiella profiler utan antibiotika störning (Dag 1, 2, och 3) var minimala (Figur 3A och 3B). Upon introproduktion av orala antibiotika direkt efter Dag 3 provtagning, förändringar i samhället profilen blev uppenbart på dag 4. Medan antibiotikumet ciprofloxacin riktar ett brett spektrum av kända bakteriella patogener såsom P. aeruginosa, Staphylococcus aureus och Streptococcus pneumonia, ökade behandlingen den relativa förekomsten av P. aeruginosa samtidigt minska Streptococcus spp. och P. melaninogenica. Genom Dag 6, samhället återhämtade långsamt till den ursprungliga startsamhällsstruktur. Resultaten tyder på att fluktuationer i mikrobiella profiler inom en enda patient är mer sannolikt på grund av samhälls störningar i luftvägarna. Med tanke på överensstämmelse mellan de mikrobiella profiler av 16S rDNA bibliotek och metagenomes från HL-härledda DNA, vi uteslutit de fördomar som härrör från 16S rRNA primers som används i denna studie. En möjlig förklaring till skillnaderna ses över 16S rDNA taxonomiskal-profiler som genereras från total DNA och HL-härledda DNA (Figur 3B) kan vara förekomsten av höga halter av Pseudomonas spp. extracellulärt DNA efter antibiotikabehandling. Detta stöds av resultaten att dessa skillnader var mest uppenbara vid Dag 7, tre dagar efter antibiotikabehandling, som riktar Pseudomonas spp. utöver andra. Ciprofloxacin används ofta som den första linjens behandling av patienter med CF och kronisk P. aeruginosa-infektion även om dess aktivitetsspektrum omfattar de flesta CF-associerade patogener. Vi antog att den antibiotikabehandling utrotar mottagliga samhällen inklusive Streptococcus spp. och därmed skapa en nisch fylld av resistenta P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kan få motståndet genom att öka sina biofilm samhällen och extracellulärt DNA har visat sig vara den viktigaste strukturella stöd för sin biofilm arkitektur 52. Även som tHan återhämtade samhällsstrukturen, extracellulärt DNA kan ha kvar i CF slem. Därför är dessa data tyder på att hypoton lysering och tvättsteg som presenteras i detta arbetsflöde potentiellt gynnas inte bara ta bort DNA humanhärrörande, men också mikrobiell härledda extracellulärt DNA som kan förvränga den verkliga mikrobiella profilerna. Metatranscriptomics En hög kvalitet metatranscriptome bör innehålla relativt få ribosom RNA (rRNA) sekvenser och representerar en opartisk provtagning av de gemensamma avskrifter (mRNA). På grund av den korta halveringstiden och begränsad mängd mRNA, är det viktigt att protokollet, som presenteras här, minimerar provhantering för att maximera antalet utskrifter återvunna. Under senare år har flera metoder för rRNA utarmning utvecklats och anpassats i kommersiellt tillgängliga kit. Dessa inkluderar Microb Enrich, Ribo-Zero, och prov specifik subtraktiv hybridizations 53 som är baserade på oligonukleotidhybridisering, och mRNA-ONLY kit som bygger på exonukleas enzymatisk aktivitet targeting RNA innehållande en 5 &#39;monofosfat. Dessutom har flera metoder för mRNA anrik såsom MessageAmp II-Bakterier Kit som företrädesvis polyadenylates och förstärker linjärt RNA finns också. Vissa av dessa metoder (t.ex. mRNA-ONLY, Microb E xpress och MessageAmp) används samtidigt för optimal effektivitet. Men effekten av alla dessa metoder begränsad, speciellt vid arbete med delvis försämrad rRNA, som ofta observeras i totalt RNA extraherat från CF prover. Polyadenylering-beroende RNA-amplifiering kan inte användas för att generera metatranscriptomes bestående av både eukaryot och prokaryot mRNA. Dessutom, poly (A) svansen sattes till sekvenserna får reducerar mängden användbara sekvensdata. Regioner med homo sträckor tenderar att ha lägre kvalitetsresultat, causing ett betydande antal läser som ska filtreras genom sekvensering och eftersekvense mjukvara, och den genomsnittliga nyttjande lästa längd efter trimning av poly (A) svansar kommer att minska avsevärt 54. Att handskas med komplexa CF mikrobiella samhällen och delvis försämrat RNA (figur 4A och 4C), visade vår tidigare studie att hybridisering-fångstmetod av Ribo-Zero Gold kit var effektivare i att ta bort både mänskliga och mikrobiell rRNA jämfört med de kombinerar behandlingar med andra kit 9 (tabell 3). Den resulte uppgifter möjliggör samtidig analys av både mänsklig värd och mikrobiella avskrifter. Beroende på avkastning och kvalitet av RNA, liksom ultimata valet av sekvense plattform, många av dessa processer, inklusive cDNA syntessteget kan effektiviseras med sekvensebiblioteksgenerering. Till exempel kan Ribo-Zero behandlat RNA användas för att göra metatranscriptome sekvense librarier använder ScriptSeq RNA-Seq Library Förberedelser kit. Metagenomic analys av djurrelaterade samhällen ger en övergripande presentation av det övergripande funktionell enhet som innehåller värden och dess tillhörande samhällen. Arbetsflödet som presenteras här är anpassningsbara till en mängd komplexa djurassocierade prover, speciellt de som innehåller tjockt slem, höga mängder av celldebris, extracellulär DNA, protein och glykoprotein-komplex, såväl som värdceller i tillägg till den önskade virala och mikrobiella partiklar. Även om virala och mikrobiella partiklar kan förloras vid varje steg, partiklar isolering och rening är viktigt att minimera mängden av värd-DNA. Medan uppgifterna metagenomik ger metabola potentialer hos de undersökta samhällen, metatranscriptomics komplettera detta genom att avslöja differentialuttryck av kodade funktioner 9. En omfattande utvärdering av genomik och avskrifter data har gett nya insights till dynamiken i samhällsinteraktioner och underlättar utvecklingen av förbättrade terapier 9,10,55.

<html> Virala och mikrobiella samhällen som är förknippade med den mänskliga kroppen har undersökts i stor omfattning under det senaste decenniet genom tillämpning av sekvenseringsteknologier 1,2. Utfallen har lett till erkännande av betydelsen mikroberna i människors hälsa och sjukdom. Den större initiativ kom från den mänskliga microbiome projekt som beskriver bakterierna (och vissa arkéer) bosatt på mänsklig hud, och inom orala håligheter, luftvägar, urogenitala området, och mag-tarmkanalen 3. Ytterligare microbiome studier av friska humana luftvägar genom bronkoalveolär lavage (BAL) 4,5 och nasofarynxpinnar 4 har visat att lungan kan tjäna som en miljöprovtagningsanordning, resulterar i övergående mikrobiell kolonisering i luftvägarna. Däremot kan effekterna av mikrobiell kolonisering i nedsatt luftvägsytor leda till allvarliga och kroniska lunginfektioner, såsom de framgår av cystisk fibros (CF) patienter. t &quot;&gt; CF är en dödlig genetisk sjukdom som orsakas av mutation i cystisk fibros transmembran regulator (CFTR) gen 6. Dessa mutationer ger upphov till defekta CFTR-proteiner som i sin tur påverkar transepitelial jontransport över det apikala ytan av epitelet. Sjukdomen drabbar flera organsystem, men majoriteten av dödlighet och sjuklighet är hänförlig till CF lungsjukdom 7. CF lungan ger ett unikt ekosystem för mikrobiell kolonisering. Defekten i jontransport orsakar slem att bygga upp i CF luftvägarna, skapar mikromiljöer som består av aerob , mikroaerofila och anaeroba fack förankrad med en statisk näringsrikt slemhinneyta. Denna miljö underlättar kolonisering och spridning av mikrober, inklusive virala, bakterier och svampar. Akuta och kroniska pulmonella mikrobiella infektioner leder till konstanta men ineffektiva immunsvar, vilket resulterar i omfattande luftvägs ombyggnad, förlust av lungkapacitet, och i slutändan pulmonary misslyckande. Bakteriella samhällen som är förknippade med CF lungan har beskrivits väl med båda kulturberoende och kulturoberoende metoder, bland annat med hjälp av 16S ribosomalt RNA (rRNA) genen sekvense 8 och shotgun metagenomik 9,10. 16S rRNA-baserade tillvägagångssätt är i stånd att karakterisera ett brett spektrum av mikrobiella arter och fånga breda förskjutningar i gemenskap mångfald. Det är dock begränsad i sin resolution att definiera de samhällen (sammanfattade i Claesson et al. 2010 11) och förutsägelser metabola potentialer är begränsade till dessa allmänna funktioner kända för taxa identifieras. Därför 16S rRNA genen sekvenseringsmetoder är otillräckliga för den nödvändiga taxonomiska och funktionell analytisk noggrannhet de olika mikrobiella samhällen som finns i CF lungorna. Den metagenomic tillvägagångssätt beskrivs här kompletterar 16S rRNA synsätt, övervinner sina begränsningar, och möjliggör ett relativt effektivt sättatt analysera både den mikrobiella taxonomi och genetiska innehållet i CF lungorna. Mikrobiell DNA isolerat från animaliska associerade prover innehåller ofta en stor mängd värd-DNA. CF sputum eller lungvävnadsprover innehåller vanligtvis en stor mängd mänskligt DNA släpptes av neutrofiler i immunsvaret, ofta mer än 99% av den totala DNA 12-14. Även om vissa intakta humana celler kan vara närvarande, är det mesta av detta DNA-fria i lösning eller adsorberas till ytan av mikrober. Dessutom närvaron av exceptionellt viskösa slemproppar, cellrester och andra okända föroreningar ytterligare komplicera isolering av mikrobiella celler. Flera metoder testades för att tömma dessa prover av humant DNA, inklusive Percoll-gradienter för att separera humana från mikrobiella celler 15, behandling med DNas I, etidiumbromid monoazide att selektivt nedbryta humant DNA 16 och MolYsis satsen, alla med begränsad framgång.<html> Hittills har mest effektiv mikrobiell DNA förfarande för CF-sputum rening har varit en modifiering av förfarandet beskrivet av Breitenstein et al. (1995) 17. Detta tillvägagångssätt, häri känt som hypotonisk lys (HL) metoden, använder en kombination av β-merkaptoetanol för att minska mucin disulfidbindningar, hypotonisk lys av eukaryota celler, och DNas I-behandling av lösligt DNA 9. Trots bristen på alternativ HL metoden väckt vissa farhågor på grund av (i) eventuella fördomar till följd av oönskad lys av mikrober och (ii) om de observerade fluktuationer i samhällets sammansättning 9,10 är en artefakt av variationer i samband med provbearbetning. Förutom alstringen av shotgun metagenomes, vi itu med dessa frågor genom att jämföra 16S rRNA-genen profiler av det totala DNA och mikrobiell extraheras DNA från HL-metoden med användning av samma uppsättning av sputumprover uppsamlade från en enda patient över sju dagar i följd. ent &quot;&gt; Jämfört med mikrobiella samhällen, är karakterisering av virus samhällen förknippas med djur begränsad 18,19 De virala samhällena i CF airways har endast karakteriseras minimalt 20 -.. 22 Den första metagenomic studien karakterisera DNA av virus samhällen i CF airways visade att de flesta virus förknippade med CF lungorna är fager 20. Den metaboliska potential fag i CF och icke-CF individer var signifikant olika. Specifikt fag samhällen i CF individer genom gener reflekterande av bakteriella värd anpassningar fysiologi CF luftvägar, och bakteriella virulens 20. Efterföljande metagenomic studier av virus i CF lungvävnad visade distinkt rumslig heterogenitet av virala samhällen mellan anatomiska regioner 22. Dessutom CF lungvävnad hyste lägsta viral mångfald observerats hittills i alla ekosystem 22. De flesta virus identifierade var fagermed potential att infektera CF patogener. Men eukaryota virus såsom herpesvirus, adenovirus och humana papillomvirus (HPV) har också upptäckts. I ett fall där cystor i lungvävnaden observerades under dissektion, var mer än 99% av ett humant papillomvirus genomet återvinns, trots att patienten aldrig diagnostiserats med en lung papillom eller carcinom. Detta indikerar att den virala mångfalden närvarande inte bara återspeglar hur allvarlig vävnadsskada, men kan också avslöja och förklara en underliggande okaraktäriserat sjukdom. De protokoll som beskrivs här ger ett enkelt, men ändå kraftfullt sätt att isolera viruslika partiklar (VLP) från prov som består av stora mängder tjockt slem, värd och mikrobiella celler, fritt DNA, såväl som cellrester. Komplement metagenomik är metatranscriptomics används för att övervaka dynamiken i genuttryck över mikrobiella och värd 9,23. I det här fallet, både mikrobiellt och HOSt-mRNA måste företrädesvis väljas. Eftersom bakterie mRNA inte polyadenyleras, kan en oligo-dT-baserade mRNA rullgardins metoden inte utnyttjas. Polyadenylering-beroende RNA-förstärkning kan inte användas i värdassocierade prover om provtagningen är kända för att innehålla stora mängder eukaryot mRNA. Många djurrelaterade prover, inklusive CF slem, innehåller en hög täthet av celler förutom stora mängder cellrester och nukleaser som inkluderar RNaser. Därför är en annan utmaning för att förhindra omfattande RNA nedbrytning under metatranscriptome bearbetningen. I de flesta fall är total RNA extraherat från CF slem delvis försämrad, begränsar nedströms applikationer och verktyg för den härledda RNA. Under senare år har flera metoder för rRNA utarmning utvecklats och anpassats i kommersiellt tillgängliga kit. Effekten av dessa metoder är dock begränsad, speciellt vid arbete med delvis försämrad rRNA 9,24. De metoder som används här tillåtered för hämtning av delvis nedbrutet totalt RNA lämpligt för effektiv nedströms totala rRNA borttagning. Direkt jämförelse av effektiviteten i rRNA avlägsnande från delvis försämrat total RNA jämföra två olika satser illustrerades av Lim et al. (2012) 9. Sammantaget är målet för detta manuskript för att ge en komplett uppsättning protokoll (Figur 1) för att generera virala och mikrobiella hagelgevär metagenomes, och en metatranscriptome, från ett enda djur associerad prov, med hjälp av inducerat sputum provet som ett exempel. Molekylär laboratorium arbetsflöde bör omfatta separata för- och efterförstärkningsområden för att minimera korskontaminering. Metoderna är lätt att anpassa till andra provtyper såsom vävnads 22, nasofaryngeal och svalg 25, bronkoalveolärt lavage (BAL) och korall (opublicerade data). Varje prov bör behandlas omedelbart efter samlingen speciellt när mikrobiella metagenomik och träffadeatranscriptomics studier önskas. Om proverna frystes, begränsar det isolering av intakta mikrobiella celler för mikrobiella metagenomes som frysning potentiellt störa cellernas integritet. Däremot frysning inte utesluta metatranscriptomics och viral isolering, men kvaliteten på RNA och mängden av viruspartiklar återvunna kan påverkas genom frys-tö process. Det är viktigt att notera att inducerad sputum har fungerat som den primära källan av prover i många studier i samband med vuxna CF-patienter och andra kroniska lungsjukdomar 26,27 som BAL kan vara för invasiva. I våra studier var sputumprover samlas med en noggrann och konsekvent provtagningsmetod, dvs efter munvatten och sköljning av munhålan med steril koksaltlösning för att hålla muntliga mikrober förorening inom sputumprover till ett minimum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cole-Parmer</td>
			<td>YO-36270-62</td>
			<td>Zirconia-Silicate Beads were used in this study</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder)</td>
			<td style="width:119px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">V3155</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile syringe filter; 0.45 &#181;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I enzyme&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Sterile syringe filter; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-13</td>
			<td>Diameter: 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right">344059</td>
			<td>9/16 X 3 &#189; in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Beckman</td>
			<td align="right" style="width:119px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SS-34 Fixed Angle Rotor</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 DNA polymerase</td>
			<td>Monserate Biotech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4001</td>
			<td>10 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Phi29 Random Hexamer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0181</td>
			<td>Previously bought from Fidelity Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">09-926-34</td>
			<td>Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free DNase I&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0303S</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">FERR0551</td>
			<td>Can be purchased from any other company</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">05-562-16B</td>
			<td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Total rRNA removal kit</td>
			<td style="width:119px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">MRZE724</td>
			<td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Cesium chloride&#160;</td>
			<td style="width:119px;">FisherScientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

Tillgängligheten av hög genomströmning sekvense har revolution många områden av biologin. För att bättre förstå värdassocierad virala och mikrobiella samhällen, var en omfattande arbetsflöde för DNA och RNA-extraktion utvecklas. Arbetsflödet genererar samtidigt virala och mikrobiella metagenomes samt metatranscriptomes, från ett enda prov för nästa generations sekvensering. Kopplingen av dessa metoder ger en översikt över både de taxonomiska egenskaper och samhälls kodade funktioner. De presenterade metoderna använder Cystisk fibros (CF) sputum, en problematisk provtyp, eftersom det är utomordentligt viskös och innehåller höga halter av muciner, fri neutrofil-DNA, och andra okända föroreningar. De protokoll som beskrivs här rikta dessa problem och framgångsrikt återhämta virus och mikrobiell DNA med minimal mänsklig DNA kontamination. För att komplettera metagenomiken studierna gjordes en metatranscriptomics protokoll optimerad för att återvinna både mikrobielloch värd mRNA som innehåller relativt få ribosomalt RNA (rRNA) sekvenser. En översikt av dataegenskaperna presenteras för att tjäna som en referens för att bedöma framgången av metoderna. Ytterligare CF sputumprover ades också in för att (i) utvärdera konsistens av microbiome profiler inom sju dagar i följd inom en enda patient, och (ii) jämför konsistensen av metagenomic förhållningssätt till en 16S ribosom RNA-gen-baserad sekvensering. Resultaten visade att daglig fluktuation av mikrobiella profiler utan antibiotika störning var minimal och taxonomi profilerna för de gemensamma CF-associerade bakterier var mycket likartad mellan 16S rDNA bibliotek och metagenomes genererade från hypotonisk lys (HL) härrörande DNA. Skillnaderna mellan 16S rDNA taxonomiska profiler genereras från totalt DNA och HL-härledda DNA antyder att hypotonisk lys och tvättstegen gynnas inte bara avlägsnande av DNA från människa härledd, men också mikrobiellt härledd extracellular-DNA som kan förvränga det faktiska mikrobiella profilerna.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Rena Oren: sekvense Metagenomes och Metatranscriptomes från Komplexa Animal-associerade Prover

Använda cystisk fibros luftväg som ett exempel, presenterar manuskriptet en omfattande arbetsflöde innefattar en kombination av metagenomic och metatranscriptomic tillvägagångssätt för att karakterisera den mikrobiella och virala samhällen i djurassocierade prover.

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Purifying Plasmid DNA från kolonier Använda Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

Gross Dissection i magen av Hummer, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

En lektin HPLC-metod för att berika selektivt glykosylerat peptider från komplexa biologiska prover

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Kemiskt blockerad antikropp Microarray för Multiplexade hög kapacitet profilering av specifik proteinglykosylering i komplexa prover

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Detektering av sällsynta genomiska varianter från poolad sekvensering med SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Riktade RNA Sequencing analys för att karaktärisera Gene Expression och Genomic Ändringar

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Dra membranet nanorör från Giant Unilamellar blåsor

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...