Name: generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9
Uploaded: 2015-01-03T14:00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+(CRISPRi)+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Genomic+Deletion+Efficiency+Mediated+by+CRISPR/Cas9+in+Mammalian+Cells.">Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li><li>Xiao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+deletions+and+inversions+mediated+by+TALENs+and+CRISPR/Cas+in+zebrafish.">Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9+mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. , (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Gene-Modified+Cynomolgus+Monkey+via+Cas9/RNA-Mediated+Gene+Targeting+in+One-Cell+Embryos.">Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Xie, K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR-Cas+system.">RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system.</a> Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).</li><li>Waaijers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).</li><li>Bassett, A. R., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+and+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila.</a> Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+Intestinal+Stem+Cell+Organoids+of+Cystic+Fibrosis+Patients.">Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+Genetic+Disease+in+Mouse+via+Use+of+CRISPR-Cas9.">Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).</li><li>Lappalainen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+genome+sequencing+uncovers+functional+variation+in+humans.">Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans.</a> Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).</li><li>Bauer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Erythroid+Enhancer+of+BCL11A+Subject+to+Genetic+Variation+Determines+Fetal+Hemoglobin+Level.">An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level.</a> Science. 342 (6155), 253-257 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3, e3647 (2008).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+PCR+products.">Molecular cloning of PCR products.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Detection+in+Prostate+Tumors+by+Quantitative+Real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR).</a> J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).</li><li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Human+Vestibular+Schwannomas.">Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas.</a> J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>McVey, M., Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMEJ+repair+of+double-strand+breaks+(director&#8217;s+cut):+deleted+sequences+and+alternative+endings.">MMEJ repair of double-strand breaks (director&#8217;s cut): deleted sequences and alternative endings.</a> Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. , (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).</li><li>Alem&#225;n, L. M., Doench, J., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Comparison+of+siRNA-induced+off-target+RNA+and+protein+effects.">a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects.</a> RNA. 13 (3), 385-395 (2007).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity+Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity.">Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity.</a> RNA. 14, 853-861 (2008).</li><li>Marine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+seed+analysis+to+identify+off-target+effects+in+siRNA+screens.">Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).</li></ol>

We have no conflicts of interest related to this report.

وكريسبر / نظام Cas9 يمكن استخدامها لتوليد الحذف الجينومية من مجموعة واسعة من الأحجام. على الرغم من أننا لاحظنا أن وتيرة حذف يختلف عكسيا فيما يتعلق يقصد حجم الحذف، وكنا قادرين على استعادة الحذف تصل إلى 1 ميغابايت، والحذف تصل إلى 100 كيلو بايت تسفر بشكل روتيني متعددة biallelic حذف الحيوانات المستنسخة. وقد لاحظنا أي خسارة في كفاءة الحذف إدخال بالتتابع في خط الخلية. هذه الاستراتيجية يمكن استخدامها لإنشاء حذف اندماجي العديد من الجينات والعناصر. يمكن المعجل عملية الحصول على استنساخ حذف biallelic عن طريق تقدير الحد الأدنى لعدد من الحيوانات المستنسخة اللازمة ليتم عرضه على أساس حجم الحذف للحصول على العدد المطلوب من الحيوانات المستنسخة مع حذف biallelic 12. القدرة على الحصول على حذف monoallelic مع غياب حذف biallelic في توزيع احتمالي يمكن أن تشير إلى الفتك الخلية المرتبطة خسارة كاملة وظيفة. منخفض الاب<html> equency أو الحذف غائبة يمكن أن يعكس عددا من السيناريوهات بما في ذلك الفقراء ترنسفكأيشن، sgRNAs غير فعالة أو غير فعالة الاشعال فحص PCR (بسبب عدم وجود مراقبة إيجابية للتحقق من صحة الاشعال PCR للكشف عن الحذف). خلايا GFP + يمكن استخدام كبديل للكفاءة ترنسفكأيشن (راجع الخطوة 5.2)، لذلك من المرجح يعكس انخفاضا في GFP + الخلايا الفقراء ترنسفكأيشن وانخفض والناتجة كفاءة الحذف. باستخدام اثنين من أزواج sgRNA مختلفة مع الاشعال فحص مستقلة يمكن أن تساعد في السيطرة على sgRNA غير فعال وفحص PCR الاشعال وتعظيم فرص الحصول على استنساخ حذف biallelic. خلية الفرز لGFP + الخلايا يثري للالأليلات الحذف. بينما هذه الخطوة قد يتم حذف أو إغفال من المرجح أن تستلزم فحص أكثر الحيوانات المستنسخة لتحديد تلك مع الحذف monoallelic أو biallelic. إلى درجة أن كفاءة ترنسفكأيشن قد يكون الأمثل، فإننا نتوقع كفاءة تحرير الجينوم ليتم تعزيزه. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; الأحداث NHEJ التي تكمن وراء الحذف ونتيجة إصلاح المحلية في سلسلة من الأليلات مع مجموعة متنوعة من indels في المواقع المستهدفة. نتائج السائدة هي ~ 1 صغيرة - 10 بي بي الإدراج أو الحذف أكثر شيوعا في موقع انشقاق sgRNA الموجهة (الشكل 2B). وغالبا ما تظهر هذه الأليلات أن تكون نتيجة القائم على microhomology إصلاح 34،35. وتجدر الإشارة إلى أن الاستراتيجية القائمة على الكشف PCR-وصفنا لن يحدد الإدراج أكبر أو أكثر تعقيدا، والحذف، العكس، أو إعادة ترتيب. على الرغم من أن هذه الأحداث هي أقل شيوعا، لاحظنا الحيوانات المستنسخة التي يمكن من خلالها الكشف عن لا حذف ولا amplicons غير الحذف، وعند إجراء مزيد من التحقيق تعكس هذه النتائج أكثر تعقيدا. وقد لاحظنا كريسبر واسعة / Cas9 بوساطة &quot;تندب&quot; من الأليلات غير الحذف من monoallelic وعدم الحذف استنساخ (انظر الشكل 2B). هذه &quot;ندوب&quot; تتكون منindels صغيرة تنتج في موقع sgRNA الانقسام دون حذف المقصود (أي حذف الجزء التدخل بين sgRNAs ألف وباء). هذه الندوب في كثير من الأحيان يقطع الاعتراف المستهدفة من قبل sgRNA. ولذا فإننا نحث الحذر في إعادة توجيه الأليلات في الخلايا التي سبق تعرضها للsgRNAs باستخدام نفس sgRNAs. استراتيجية إعادة توجيه أكثر نجاحا من شأنه الاستفادة sgRNA فريدة من نوعها تتابعات متميزة من قبل &quot;ندوب&quot; المواقع الاعتراف. في الحالات عندما يتعرف على زوج من sgRNAs تسلسل exonic (الشكل 1B، أسفل)، التي يمكن أن تنتج الأليلات انزياح الإطار حتى في حالة عدم وجود الحذف. ولذلك، استنساخ حذف monoallelic يمكن المخصب لالخسارة من وظيفة بسبب وتيرة عالية من الطفرات انزياح الإطار على غير حذف-أليل 12. واحد قلق مع كريسبر / نظام Cas9 هو خارج الهدف آثار، أي تعديل الجيني في مواقع غير مقصودة 36-38. Rوأشارت تقارير ecent أن الرنا دليل أقصر مع 17-19 النيوكليوتيدات يمكن أن تقلل من تكرار كريسبر / خارج الهدف آثار 39 Cas9 المستندة. بالإضافة إلى ذلك، استراتيجية مزدوجة تخصر باستخدام اثنين من أدلة في الموقع المستهدف مع nickase يمكن استخدامها لإنشاء DSBs مع التقليل من خارج الهدف آثار 7. بدلا من ذلك، مماثلة لالاستراتيجيات المستخدمة لرني، نقترح أن أزواج مختلفة من sgRNAs مع غير متداخلة متواليات protospacer أن تستخدم لإظهار أن النمط الظاهري لوحظ هو نتيجة للكريسبر / Cas9 تعديل على هدف مقابل لإمكانات بعيدا عن الهدف تأثير. ومن شأن اتباع نهج مناسب يكون لتصميم اثنين على الأقل المجاورة ولكن غير متداخلة أزواج sgRNA بحيث مجموعة واحدة من الاشعال الفرز (راجع الخطوة 2) يمكن أن تستخدم للأزواج sgRNA متعددة (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك، واستكمال خط الخلية حذف من إعادة تقديم تسلسل في عداد المفقودين و / أو الجينات تعطلت يمكن إثبات وجود علاقة سببية بينحذف الجينومية معين، والنمط الظاهري. لعلماء الأحياء العمل مع أنظمة نموذج الخلوي، ورني يمثل أداة قوية لعلم الجينوم وظيفية. ومع ذلك، وشملت القيود المفروضة على هذا النهج غير مكتمل تخفيض في مستويات النص مرنا الهدف، عدم تجانس تأثير الكواشف مستقلة تستهدف نفس الجين، والمعروف خارج الهدف آثار بما في ذلك الآثار القائمة على البذور وغير المصنفة 40-42. استراتيجيات تحرير الجينوم وعد لمعالجة العديد من هذه الشواغل وتمثل توجها مثيرا، مكملة لاضطراب وراثي المحتملين 8،36،37. وعلاوة على ذلك، والتحرير الجينوم يسمح لدراسة غير الترميز العناصر الجينية بطريقة غير ممكن بواسطة رني والتي تمثل تحديا استهداف التقليدية نهج 25. ونحن نشجع الجيل الحذف الجينومية من قبل كريسبر / Cas9 كوسيلة من وسائل قوية ومحددة لإنتاج وتوصيف الخسارة من وظيفة الأليلات.

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1&#8211;3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate &#8220;nicking&#8221; or transcriptional regulation respectively7&#8211;9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12&#8211;14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17&#8211;21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:388px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pSpCas9(BB) (pX330)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX Solution and 2mm Cuvettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP Plasmid</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq PCR Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zero Blunt PCR Cloning Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2700-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

وكان الهدف من هذه التجربة حذف Pim1 في الخلايا MEL. استخدام عدة أزواج غير متداخلة sgRNA (أي تسلسل protospacer المستقلة) قد يساعد في السيطرة على الآثار خارج الهدف (الشكل 1A). ومن شأن النمط الظاهري يتفق أن يكون أكثر من المرجح أن تنتج عن تأثير على الهدف بدلا من تأثير المشترك بعيدا عن الهدف تتقاسمها عدة سلاسل protospacer مستقلة. أن كل زوج أن يؤدي إلى إنتاج حذف نقطة فريدة من نوعها. إذا قريبة من بعضها البعض (أي، ن أقل من 150 ~ بي بي)، ويمكن استخدام نفس الاشعال فحص للكشف عن عمليات الحذف التي تنتجها كل مجموعة من sgRNAs. الحذف الجينومية قد يعطل الجينات باستخدام أزواج sgRNA في مواقع مختلفة فيما يتعلق الجين (الشكل 1B). على سبيل المثال، فإن الزوج قد sgRNA الجناح جين للحذف من الجسم الجين بأكمله؛ يمكن أن يكون موجودا الزوج خلال يومين الإكسونات، مع القدرة على خلق indels انزياح الإطار حتى لو واحد أو كلا علاللم يتم حذف العناوين. أو هذا الزوج قد تكتنف اكسون محدد للسماح تعطل لشكل الإسوي معين. كانت استراتيجية الحذف تستخدم لPim1 لتصميم المرافقة sgRNAs لحذف الجسم الجين بأكمله، وهو حذف 8 كيلو بايت (الشكل 2). وقد تم اختيار هذه الاستراتيجية ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الصغير نسبيا من الجين Pim1. يوضح هذا المثال PAM واحد (الأخضر) على رأس (واتسون) حبلا وPAM واحد على الجزء السفلي (كريك) حبلا. ومع ذلك، DSB مستقلة للتوطين تسلسل PAM إلى حبلا العلوي أو السفلي. يمكن أزواج sgRNA على حد سواء متواليات PAM على حبلا العلوي، سواء على حبلا أسفل، أو واحدة من كل. باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، وقد صممت اثنين sgRNA، المستنسخة في pX330 التعبير ناقلات، وتسليمها إلى خلايا MEL التي كتبها Electroporation للجنبا إلى جنب مع مراسل GFP (الشكل 2A). تم فرز أعلى 3٪ من الخلايا GFP + يومين بعد electroporation ومطلي clonally في الحد من التخفيف. شاشةوقد صممت الاشعال جي كما هو موضح في الخطوة 2 وكما هو مبين في الشكل (2). وقد الأمثل الظروف PCR باستخدام gDNA معزولة من خلايا MEL الأبوية ومن &quot;الأكبر&quot; خلايا فرزها. بعد 10 أيام والطلاء، وتم عزل gDNA من جميع الحيوانات المستنسخة وفرزهم للحذف عن طريق PCR، والتي حددت عدم الحذف، monoallelic واستنساخ حذف biallelic وفقا لأنماط من غير حذف (ND) وحذف (D) amplicons (الشكل 3) . وتم تحديد الحيوانات المستنسخة غير الحذف وجود وجود amplicon غير الحذف وغياب amplicon الحذف. تم تحديد استنساخ Monoallelic وجود وجود كل من غير حذف وamplicons الحذف. تم تحديد استنساخ Biallelic وجود غياب amplicon غير الحذف وبحضور amplicon الحذف. لهذا الحذف، تم فحص 400 الحيوانات المستنسخة والتي حددت 126 استنساخ حذف monoallelic و 32 DELET biallelic<html> استنساخ أيون (من المهم أن نلاحظ أن التردد الحذف يختلف مع حجم حذف 12). تم اختيار الحيوانات المستنسخة حذف Biallelic وانتقل الى قوارير مع 8 مل من وسائل الإعلام. بعد السماح 5 أيام للتوسع، تم اختبارها من قبل كل استنساخ PCR من gDNA لتأكيد تعرضوا biallelic الحذف وحذف amplicons لسانجر تسلسل لتحديد حذف الدقيق (الشكل 2B). عدم التجانس داخل amplicons الحذف يعكس ناقص تشكيل INDEL NHEJ إصلاح. تسلسل أليل غير الحذف في استنساخ حذف monoallelelic كشف indels في معظم الحالات، مما يدل على أنه حتى أليل غير حذف وكثيرا ما تم بواسطة كريسبر / Cas9، والتي قد تكون مهمة للتطبيقات حيث كلاهما مطلوب monoallelic وbiallelic استنساخ الحذف . تم عزل الحمض النووي الريبي من استنساخ حذف biallelic وتحليلها بواسطة RT-QPCR لتأكيد فقدان Pim1 التعبير (الشكل 4). طرق &quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig1highres.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي لاستراتيجيات الحذف ممكنة. (A) اثنين من أزواج سبيل المثال sgRNA لحذف الجينومية (كما هو موضح باللون الأسود والبرتقالي، على التوالي). الأسهم الزرقاء تشير الاشعال للكشف عن amplicon غير الحذف والسهام الحمراء تشير الاشعال للكشف عن amplicon الحذف. sgRNA المواقف 17 و 18 ويسلط الضوء باللون الأحمر والأزرق في sgRNA-مواقع-A 1 / A 2 ثم يتم تمييز في اللون الأرجواني والبرتقالي في sgRNA-مواقع-B 1 / B 2 مع خط أحمر يشير إلى انشقاق Cas9 توقع بين المواقف 17 وترد 18. (B) الانشقاقات الموجهة كريسبر كخطوط سوداء العمودية. الأسهم الزرقاء تشير الاشعال للكشف عن amplicon غير الحذف والسهام الحمراء تشير الاشعال للكشف عن amplicon الحذف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض</a>نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig2highres.jpg" /> الشكل 2. استراتيجية لإنتاج وكشف عن حذف Pim1، بما في ذلك حذف التسلسل والأليلات غير الحذف. (A) تخطيطي للاستراتيجية فحص PCR القائم على تحديد Pim1 استنساخ الحذف. يقع زوج واحد التمهيدي الداخلية لحذف (الأسهم الزرقاء) وزوج التمهيدي واحد المترجمة خارجي لحذف (الأسهم الحمراء). وتظهر تسلسل sgRNA (تسلسل protospacer) باللون الأرجواني. الخطوط الحمراء العمودية تشير إلى انشقاق Cas9 توقع بين المواقف 17 و 18 من تسلسل sgRNA. (B) سانجر تسلسل يكشف تشكيل INDEL في موقع الاعتراف sgRNA. وتظهر تسلسل sgRNA في تسلسل الأرجواني وPAM باللون الأخضر. أحداث الحذف هي SHالخاصة من قبل عدد مساو من علامات اندفاعة والإدراج ويسلط الضوء في الزرقاء. خطوط حمراء عمودية تشير إلى توقع الموقع الانقسام، بين المواقف 17 و 18 من sgRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig3highres.jpg" /> الشكل (3). هلام الممثل تحديد عدم الحذف، monoallelic، واستنساخ biallelic للحصول على كل استنساخ، الممر الأيسر يمثل عدم الحذف-amplicon (&quot;ND&quot; باللون الأزرق) والممر الأيمن يمثل amplicon حذف (&quot;D&quot; في الحمراء ). يتم فصل الحيوانات المستنسخة الفردية عن طريق الخطوط المنقطة. استنساخ حذف monoallelic الثلاثة هي استنساخ 5 و 6 و 2. استنساخ حذف biallelic الثلاثة هي استنساخ 15، 17، و 13. كما رأينا في تسلسل البيانات، والفرقة الحذف لج<html> وحيد 13 لديها حجم أصغر من المقرر أن الحذف أكبر عند تقاطع الحذف. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig4highres.jpg" /> تم احتساب الرقم 4. فقدان Pim1 التعبير في استنساخ حذف biallelic. Pim1 التعبير عن اثنين من الحيوانات المستنسخة حذف biallelic التي كتبها RT-QPCR. تم تطبيع البيانات لGAPDH باستخدام 2 - طريقة ΔCt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> Protospacer تسلسل </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &quot; </td></tr></tbody></table> الجدول 1. 20 مير تسلسل protospacer لمدة sgRNA لحذف Pim1. 543 &quot;&gt; <tbody><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:101px;"></td><td style="width:443px;"> تكملة العكسية للProtospacer تسلسل </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-A-RC </td><td> 5&#39;-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &quot; </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-B-RC </td><td> 5&#39;-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &quot; </td></tr></tbody></table> الجدول 2. تكملة عكسي من متواليات protospacer لsgRNA اثنين من الجدول 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> متواليات </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-RC </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-RC </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &quot; </td></tr></tbody></table> الجدول 3. تسلسل Protospacer والعكس بهم يكمل مع &quot;CACC&quot; و &quot;AAAC&quot; وأضافت للاستنساخ في ناقلات pX330 باستخدام BBSI انزيم قيود. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> متواليات </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-RC </td><td> 5&#39;- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &quot; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-RC </td><td> 5&#39;- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &quot; </td></tr></tbody></table> ومما يعزز الجدول التعبير 4. sgRNA من المروج U6 من متجه pX330 من خلال إضافة النوكليوتيدات G بعد تسلسل CACC وقبل20-مير. إضافة إلى G النوكليوتيدات إضافية يتطلب إضافة النوكليوتيدات C في نهاية 3 &#39;من تكملة بنسبة ضئيلة العكسي (على سبيل المثال، sgRNA-A). ومع ذلك، إذا كان المركز الأول من بين 20 مير (تسلسل protospacer) هو بالفعل النوكليوتيدات G، ليست هناك حاجة لإضافة G آخر (على سبيل المثال، sgRNA-B)، وهناك حاجة لإضافة C إلى الموقف النهائي للمكملا عكسي بنسبة ضئيلة.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

جيل من الجينوم الحذف في خطوط خلايا الثدييات عبر كريسبر / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

جيل من خطوط الخلايا البشرية مستقرة مع shRNA (تيت-on) التتراسيكلين أو محرض التعبير [كدنا]

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

نمو اللاهوائية وصيانة خطوط خلايا الثدييات

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β بوساطة البطانية إلى الانتقال المتوسط (EndMT) والتقييم الوظيفي لمؤثري EndMT باستخدام CRISPR/Cas9 تحرير الجينات

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

كريسبر / كاس 9 التحرير الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية لتطبيقات العلاج الجيني

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...