Name: generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9
Uploaded: 2015-01-03T14:00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.

1. CRISPR Design <ol><li> Design sgRNAs manuellt eller med hjälp av fritt tillgängliga onlineverktyg 7. Använd dessa verktyg för att hjälpa till att identifiera styrsekvenser som minimerar identiska iska tändstickor eller nära-matcher för att minska risken för klyvning ifrån målställen (ej åsyftade effekter). Kontrollera att styr sekvenser består av en 20-mer (&quot;protospacer sekvens&quot;) uppströms om en &quot;NGG&quot; sekvens (&quot;protospacer intilliggande motiv&quot; eller PAM) vid den genomiska igenkänningsstället. OBS: Figur 1 beskriver möjliga strategier radering för gener och icke-kodande element. För att skapa en gen knockout, kommer två sgRNA ligger inom exoner berikar ens monoallel deletionskloner för förlust av funktion. Detta beror på den höga frekvensen av InDels bildade av icke-raderade alleler 12, som sannolikt kommer att orsaka ramskiftningsmutationer leder till nonsens medierad sönderfall av mRNA-transkriptet (Figur 1B). </li><li> Användexempel guider för den avsedda stryka Pim1 i mus (Mus musculus, Tabell 1, Figur 2A). OBS: I det här exemplet, sgRNA-A: s protospacer sekvens och PAM råkar falla på botten (Crick) strängen medan sgRNA-B: s protospacer sekvens och PAM falla på toppen (Watson) strängen (Figur 2A). Dock kommer DSB ske oberoende av orientering protospacer sekvensen / PAM i förhållande till den övre eller nedre del. </li><li> Bestäm det omvända komplementet (rc) hos varje styrsekvens. Exempel omvänd komplementsekvenserna för Pim1 sgRNA från tabell 1 visas i tabell 2. </li><li> Skaffa 24- eller 25-mer oligonukleotider för varje guide och dess tillhörande omvända komplement inklusive ytterligare nukleotider för kloning och uttryck ändamål. OBS: Här diskuterar vi användningen av pSpCas9 (BB) plasmid (pX330) (Addgene plasmid-ID 42230). Denna plasmid medger samtidiguttryck av sgRNA och SpCas9, men innehåller inte markörer för val 7. Andra konstruktioner kan användas, såsom pX458 (Addgene plasmid-ID 48138) eller pX459 (Addgene plasmid-ID 48139), som omfattar GFP och puromycin som selekterbara markörer, respektive, eller konstruktioner i vilka multipla sgRNAs kan uttryckas från en enda plasmid. <ol><li> Lägg &quot;CACC&quot; före 20-mer-styrsekvens och &quot;AAAC&quot; innan guidens omvända komplementet för kloning in i pX330 vektorn genom användning Bbsl restriktionsenzym (tabell 3). </li><li> Lägg ett G nukleotid efter CACC sekvensen och före den 20-mer om den första positionen för 20-meren inte är G. sgRNA expression från U6 promotorn i pX330 vektorn förstärks genom inneslutning av en G-nukleotid efter CACC sekvensen . Lägg ett C vid 3&#39;-änden av det omvända komplementet oligo (t.ex. sgRNA-A i tabell 4). De resulte oligos skulle vara 25-mer oligos. </li><li> Hurnågonsin, om den första positionen för 20-mer (protospacer sekvens) är G, inte lägga till ytterligare G (t.ex. sgRNA-B i tabell 4) och inte lägga C till den slutliga positionen av den omvända komplement oligo. I detta fall skulle de resulterande oligona vara 24-mer oligos (tabell 4). </li></ol></li></ol> 2. Design Deletion Screening Primrar <ol><li> Design en uppsättning primrar interna till den sekvens som skall raderas (&quot;icke-deletion bandet&quot;) och en annan uppsättning primrar uppströms och nedströms av sgRNA klyvningsställena (&quot;radering band&quot;, fig 1 - 2). I avsaknad av radering, är &quot;raderband&quot; ofta för stora för att på ett effektivt sätt förstärka. Vanligtvis använder primers minst 100 bp från den förutsagda klyvningsstället för att säkerställa upptäckt inte skulle påverkas av en liten Indel på sgRNA målplatsen. <ol><li> Designa ytterligare primers att analysera för ärrbildning (små InDels produceras vid sgRNA cleavage webbplats utan den avsedda text utgår). Använd ett par framåt och bakåt primers flankerar varje sgRNA målplats (inom 150-350 bp) att förstärka sgRNA målplatsen att undersöka för ärrbildning. Detta kan vara användbart för att karaktärisera de icke-raderade allelen i monoallel deletionskloner. </li></ol></li><li> För små deletioner (som &quot;raderband&quot; kan fortfarande förstärka), lösa amplikoner på en agarosgel för att avgöra om storleken är förenlig med närvaron eller frånvaron av radering. För detta tillvägagångssätt, kan de interna primers som beskrivs i steg 2.1 utelämnas. </li></ol> 3. CRISPR Kloning <ol><li> Annelera och fosforylerar oligos. <ol><li> Resuspendera oligos vid en koncentration av 100 iM i DDH 2 O. </li><li> Förbered en 10 pl reaktionsblandning för varje guide och dess omvända komplement: 1,0 l sgRNA 24- eller 25-mer oligo (100 iM; se steg 1.4), 1,0 l sgRNA 24- eller 25-mer bakåt complement oligo (100 uM; se steg 1.4), 1,0 pl 10x T4 ligeringsbuffert, 6,5 pl DDH 2 O, och 0,5 ^ il T4-polynukleotidkinas (PNK) (10.000 U / ml). OBS: fosforyleras oligos kan beställas istället. För detta tillvägagångssätt, är användningen av T4 PNK utelämnas. </li><li> Anneal i en termocykler under användning av följande parametrar: 37 ° C under 30 min; 95 ° C under 5 min och sedan ramp ner till 25 ° C vid 5 ° C / min. </li><li> Späd oligos 1:10 i DDH 2 O (t.ex., 1,0 | il glödgade oligos + 9,0 | il ddHaO 2 O för att ge en koncentration av 1 | iM). </li></ol></li><li> Ligera glödgade oligos till pX330 med en Golden Gate monteringskloningsstrategi 26. <ol><li> Förbered en 50 pl reaktionsblandning: 100 ng cirkulär pX330 vektor, 1.0 l glödgade oligos (1 ^ M; se steg 3.1.4), 5,0 l restriktionsenzymbuffert (10x), 4,0 l (20 U) Bbsl restriktionsenzym (5,000 U / ml), 5,0 μl ATP (10 mM), 0,25 ^ il (5 pg) BSA (20 mg / ml), 0,375 | il (750 U) T4 DNA-ligas (2000000 U / ml) och H2O till en slutlig volym av 50 | il. Denna reaktion kan skalas ned till en mindre slutlig volym om nödvändigt. </li><li> Kör prover i en termocykler med användning av följande parametrar: Cykler 1-20 (37 ° C under 5 min, 20 ° C under 5 min); Cykel 21 (80 ° C under 20 min). Dessa cykelförhållandena tillåter för matsmältningen och ligering för att förekomma i en reaktion (se steg 3.2). </li><li> Omvandla 10 pl av DH5a E. coli celler med 1 l av reaktion (från 3.2.1 - 3.2.2). </li><li> Plate på en lysogeni buljong (LB) agarplatta med 100 ug / ml ampicillin och inkubera O / N vid 37 ° C. </li></ol></li><li> Plocka 2-3 kolonier och ympa in en mini-prep kulturen. <ol><li> Utför mini-prep för varje prov och sekvensera varje koloni med hjälp av en U6 promotor framåt primer: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Detta är arepresentative sekvenseringsprimer; andra flankerande primrar kan användas. </li></ol></li><li> Välj en sekvens-verifierad koloni och ympa in en maxi-prep kulturen. Prep storlek kan skalas utifrån önskad DNA avkastningen. </li><li> Utför maxi-prep för varje CRISPR / Cas9 konstruktion. </li></ol> 4. transfekterar CRISPRs i celler av intresse OBS: Detta protokoll omfattar leverans av CRISPR / Cas9 plasmider genom elektroporering 27. Detta protokoll beskrivs i detalj för murin erytroleukemi (MEL) celler, en suspension cellinje. Odlingsmediet i alla steg består av DMEM kompletterat med 2% penicillin / streptomycin och 1% L-glutamin, vilken används för MEL-celler. Emellertid kan övergående transfektion av CRISPR / Cas9 plasmider framgångsrikt anpassas till många celltyper använder föredragna odlingsbetingelser och transfektion strategier för varje celltyp. Medan MEL celler suspensionsceller, instruktioner för vidhäftande celler have också inkluderats. <ol><li> Se till att det finns 2 x 10 6 celler per CRISPR paret. Resuspendera 2 x 10 6 celler i 100 | il av elektroporation lösning och lägg till elektroporationskyvett. <ol><li> Lägg 5 mikrogram av varje CRISPR / Cas9 konstruktion (10 ug totalt). Lägg 0,5 ug av GFP-expressionskonstruktionen. </li></ol></li><li> Electroporate celler med 250 volt för 5 ms i en 2 mm kyvett med hjälp av ett elektrosystemet. OBS: Du kan använda en annan transfektion metod såsom katjonisk liposom baserad transfektion. Optimera transfektion villkor för varje cellinje med en reporter konstruktion för att säkerställa robust plasmid leverans innan genomet redigering. </li><li> Överför omedelbart lösningen från kyvetten i 1 ml odlingsmedia efter elektroporering. Minimera tiden mellan elektroporering och överföra lösningen i media för att öka cellernas livskraft. </li><li> Inkubera vid 30-37 ° C för 24 - 72 timmar. 30 ° C kan öka genometredigering effektivitet, men 37 ° C är godtagbar. </li></ol> 5. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) av transfekterade celler <ol><li> Förbered celler för FACS genom att filtrera dem genom ett 50 pm filter till en FACS rör. </li><li> FACS sorterar toppen ~ 3% av GFP-positiva celler i syfte att anrika celler som fick höga nivåer av CRISPR / Cas9 konstruktionerna. </li><li> Plate sorterade celler individuellt i 96-brunnars rundbottnade plattor med användning av sorterare eller genom att använda begränsande utspädning vid 30 celler per 96-brunnars rundbottnad platta. Optimera plätering den celltyp som används till att begränsa utspädning innan du utför detta steg för att på ett tillförlitligt sätt erhålla cirka 30 celler per 96-brunnar. </li><li> Inkludera 100 pl per brunn av cellodlingsmedia. </li><li> För de återstående sorterade cellerna (&quot;bulk&quot;) som inte har pläterade, frysa hälften av cellerna för framtida plätering. Plate den andra halvan för screening och primer validering (se steg 6). OBS: Denna protocol är för suspensionsceller. Vidhäftande celler kan antingen växa som enskilda celler i 96-brunnars flatbottnad platta eller i en 10 cm skål vid låg koncentration så att enskilda encelliga härledda kloner kan plockas och flyttas till en flatbottnad 96-brunnsplatta. </li><li> Tillåt bulk cellerna att inkubera vid 37 ° C under 3-7 dagar och låta klonerna att inkubera vid 37 ° C under 7 - 14 dagar. Vary dessa tider beroende på fördubblingstiden för den använda cellinjen. OBS: Denna inkubationstid möjliggör tillräcklig celltillväxt för screening iskt DNA (gDNA) för den avsedda raderingen genom PCR (se steg 6.1 och 7.1). De bulk cellerna har tillräckligt proliferated när koncentrationen överstiger ~ 100.000 celler / ml eller för vidhäftande celler har cellerna nått ~ 80% konfluens. Klonerna har tillräckligt frodats gång makroskopiskt synliga med ~ 2 mm diameter. </li></ol> 6. Primer Validering och Screening för CRISPR / Cas9-medierad radering <ol><li> Isolera gDNA från föräldra och bulk sorterade celler genom återsuspendering paren och bulk cellpelletar i 50 | il DNA-extraktionslösningen. OBS: I allmänhet ~ 100.000 celler används för DNA-extraktion, även om ett brett spektrum av cellantal är acceptabelt. Bulk sorterade cellerna består av en polyklonal population utsätts för sgRNA-A och sgRNA-B (se steg 5). Syftet med följande PCR är att validera primrar och verifiera förekomsten av avsedd genomisk deletion. </li><li> Kör provet i termocykler och kör följande program: 65 ° C under 6 min, 98 ° C under 2 min för att extrahera gDNA. Mät DNA-koncentrationen. OBS: Medan stegen 6,1 och 6,2 rekommenderar en effektiv metod för DNA-extraktion, kan vilken metod som helst för genomisk DNA-isolering utnyttjas för att kunna utföra PCR i steg 6,3. </li><li> Montera en 20 pl PCR med följande komponenter: 10 pl 2x PCR-blandning, 0,5 pl framåt primer (10 _6; M), 0,5 | il omvänd primer (10 | iM), 50 till 100 ng gDNA, och H 2 O upp till 20 | il. Använd primrar utformade i steg 2 ovan. Genomföra PCR för &quot;icke-raderband&quot; och &quot;radering band&quot; i separata reaktioner. OBS: Många polymeraser kan användas för steg 6.3. <ol><li> Kör prover i en termocykler med användning av följande parametrar: 95 ° C under 15 min, 35 cykler av (95 ° C under 30 sek, 60 ° C under 1 min, 72 ° C under 1 min) och 72 ° C under 10 min . Optimera PCR förutsättningar för varje primerpar utformad utifrån testa bulk sorterade cellerna. </li></ol></li><li> Kör prov på 2% agarosgel vid 10 V / cm med användning av 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert. </li><li> Undersök prover för närvaro / frånvaro av icke-deletion och borttagning band (Figur 2). Betrakta multiplexering den &quot;radering&quot; och &quot;icke-radering&quot; PCR-primerpar i en enda reaktion. Optimera multiplexeringi en polyklonal population (dvs, bulk sorterade celler) innan screening individuella kloner. Det är viktigt att de radering och icke-radering amplikoner lösas enkelt på en agarosgel för multiplexering. </li></ol> 7. Screening CRISPR / Cas9 kloner för Strykningar och Clone Selection <ol><li> För suspensionsceller, överföra alla kloner till en enda 96-brunnsplatta som redan innehåller 50 | il cellodlingsmedia per brunn för en slutlig volym av 150 | il. Detta underlättar screening genom att tillåta en flerkanalspipett som skall användas för återstoden av stegen i steg 7. <ol><li> Överför 50 ul från varje brunn (vilket lämnar 100 pl i varje brunn) till en 96-brunnars PCR-platta med användning av en flerkanalspipett. </li><li> Centrifugera PCR-platta vid 400 xg under 5 min och avlägsna supernatanten genom att ställa PCR-plattan över en vask. Lägg 50 pl DNA extraktionslösning per brunn och resuspendera. Fortsätt till steg 7,3 för suspensionsceller. </li&gt; </ol></li><li> För anhängare celler, aspirera media. Lägg 20 pl av 0,05% trypsin-EDTA till varje brunn med en klon närvarande. <ol><li> Resuspendera cellerna i 200 | il medium. Pipett blanda för att lösgöra celler. </li><li> Plate 100 il vardera i två separata 96-brunnars flatbottnade plattor. Håll en platta för att möjliggöra kloner att växa och använda den andra plattan för att screena varje klon för strykningar. </li><li> Tillsätt ytterligare 100 | il till varje brunn för en total volym av 200 | il. Vänta 24-72 tim för att låta cellerna växa. </li><li> Aspirera media. Lägg 50 pl DNA extraktionslösning per brunn, resuspendera och transfer till 96-håls PCR-platta. Fortsätt till steg 7.3. </li></ol></li><li> Extrahera gDNA från kloner. Kör provet i termocykler: 65 ° C under 6 min och 98 ° C under 2 min för att extrahera gDNA. </li><li> Screen varje klon med användning av samma PCR-primrar och reaktionsbetingelser som är optimerade på bulk- celler (se steg 6). </li><li> Välj kloner idenfierades med önskad radering och flytta till större platta eller kolv för tillväxt. </li></ol> 8. Validering av biallelisk deletionskloner <ol><li> För att karakterisera erhållna kloner och validera en framgångsrik knockout, utvärdera kloner på DNA samt RNA och / eller proteinnivåer. <ol><li> För att utvärdera DNA amplifiera radering band från bialleliska deletionskloner med en korrekturläsning polymeras och klona amplikonema (t.ex., med en PCR-kloningskit) i en plasmidvektor. Omvandla plasmiden i DH5a E. coli-celler och platta på LB-agarplattor med det relevanta antibiotikumet. Markera flera kolonier, mini-prep var och en, och låta varje klon till Sanger-sekvense att karaktärisera varje radering allel 28-30. Upprepning PCR-testet för radering efter den inledande skärmen säkerställer att rätt klonen valdes och reproducerbarhet av resultaten. </li><li> För att utvärdera RNA, utföra RT-qPCR för gene uttryck av den relevanta genen 30,31. </li><li> För att utvärdera proteinet, utför en immunoblot med användning av en antikropp mot det relevanta proteinet 33. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. Z. F. N., TALEN, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+(CRISPRi)+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2180-2196 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Genomic+Deletion+Efficiency+Mediated+by+CRISPR/Cas9+in+Mammalian+Cells.">Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by CRISPR/Cas9 in Mammalian Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li><li>Xiao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+deletions+and+inversions+mediated+by+TALENs+and+CRISPR/Cas+in+zebrafish.">Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENs and CRISPR/Cas in zebrafish.</a> Nucleic Acids Research. 41 (14), e141 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR/Cas9+mediated+mouse+genome+targeting.">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9 mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. , (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li><li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells.">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Gene-Modified+Cynomolgus+Monkey+via+Cas9/RNA-Mediated+Gene+Targeting+in+One-Cell+Embryos.">Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Xie, K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genome+editing+in+plants+using+a+CRISPR-Cas+system.">RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system.</a> Molecular Plant. 6 (6), 1975-1983 (2013).</li><li>Waaijers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-targeted+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 195 (3), 1187-1191 (2013).</li><li>Bassett, A. R., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+and+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila.</a> Journal of Genetics and Genomics. 41 (1), 7-19 (2014).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+Intestinal+Stem+Cell+Organoids+of+Cystic+Fibrosis+Patients.">Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+a+Genetic+Disease+in+Mouse+via+Use+of+CRISPR-Cas9.">Correction of a Genetic Disease in Mouse via Use of CRISPR-Cas9.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 659-662 (2013).</li><li>Lappalainen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+genome+sequencing+uncovers+functional+variation+in+humans.">Transcriptome and genome sequencing uncovers functional variation in humans.</a> Nature. 501 (7468), 506-511 (2013).</li><li>Bauer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Erythroid+Enhancer+of+BCL11A+Subject+to+Genetic+Variation+Determines+Fetal+Hemoglobin+Level.">An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level.</a> Science. 342 (6155), 253-257 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3, e3647 (2008).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177, 437-447 (2003).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit.">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Finney, M., Nisson, P. E., Rashtchian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+PCR+products.">Molecular cloning of PCR products.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 15. (Unit 15.4), (2001).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Detection+in+Prostate+Tumors+by+Quantitative+Real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR).</a> J. Vis. Exp. (63), e3874 (2012).</li><li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Culture+of+Human+Vestibular+Schwannomas.">Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas.</a> J. Vis. Exp. (89), e51093 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).</li><li>McVey, M., Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMEJ+repair+of+double-strand+breaks+(director&#8217;s+cut):+deleted+sequences+and+alternative+endings.">MMEJ repair of double-strand breaks (director&#8217;s cut): deleted sequences and alternative endings.</a> Trends in Genetics. 24 (11), 529-538 (2008).</li><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice.">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+binding+of+the+CRISPR+endonuclease+Cas9+in+mammalian+cells.">Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. , (2014).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs.">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32, 279-284 (2014).</li><li>Alem&#225;n, L. M., Doench, J., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Comparison+of+siRNA-induced+off-target+RNA+and+protein+effects.">a Comparison of siRNA-induced off-target RNA and protein effects.</a> RNA. 13 (3), 385-395 (2007).</li><li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity+Experimental+validation+of+the+importance+of+seed+complement+frequency+to+siRNA+specificity.">Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificity.</a> RNA. 14, 853-861 (2008).</li><li>Marine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+seed+analysis+to+identify+off-target+effects+in+siRNA+screens.">Common seed analysis to identify off-target effects in siRNA screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (3), 370-378 (2012).</li></ol>

We have no conflicts of interest related to this report.

Den CRISPR / Cas9 system kan användas för att generera iska deletioner av olika storlekar. Även om vi har observerat att frekvensen av radering varierar omvänt med avseende på avsedd radering storlek, har vi kunnat återhämta strykningar på upp till 1 Mb, och strykningar upp till 100 kb rutinmässigt ger flera bialleliska bort kloner. Vi har observerat någon förlust i effektivitet sekventiellt införande deletioner i en cellinje. Denna strategi kan användas för skapande av kombinato deletion av ett stort antal gener och element. Processen för att erhålla bialleliska deletionskloner kan påskyndas genom att uppskatta det minsta antalet kloner behövde screenas utifrån radering storlek för att få önskat antal kloner med biallelisk radering 12. Förmågan att få monoallel radering med frånvaron av biallelisk radering på sannolikhetsfördelning kan tyda cell dödlighet i samband med total förlust av funktion. Låg FRequency eller frånvarande deletioner kan återspegla ett antal scenarier inklusive dålig transfektion, ineffektiva sgRNAs eller ineffektiva PCR screening primers (pga brist på en positiv kontroll för att validera PCR-primers till skärmen för radering). GFP + celler kan användas som ett surrogat för transfektionseffektivitet (se steg 5.2), så en minskning av GFP + celler återspeglar sannolikt dålig transfektion och en resulterande minskad deletion effektivitet. Med hjälp av två olika sgRNA par med oberoende screening primers kan hjälpa till att kontrollera för ineffektiv sgRNA och screening PCR-primers och maximera chanserna att få bialleliska deletionskloner. Cellsortering för GFP + celler berikar för radering alleler. Även detta steg kan utelämnas, kommer utelämnande sannolikt nödvändiggör screening fler kloner för att identifiera dem med monoallel eller bialleliska strykningar. Till den grad att transfektionseffektiviteten kan optimeras, skulle vi förvänta oss genomet redigering effektiviteten förbättras. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; The NHEJ händelser som ligger bakom deletioner och lokal reparation resultat i en serie av alleler med en mängd olika InDels vid målställena. Den dominerande utfallet är små ~ 1-10 bp insertioner eller mer allmänt deletioner vid platsen för sgRNA riktad klyvning (figur 2B). Ofta är dessa alleler verkar vara resultatet av microhomology baserade reparations 34,35. Det bör noteras att PCR-baserad detektionsstrategi beskriver vi inte kommer att identifiera större eller mer komplicerade insertioner, deletioner, inversioner eller omlagringar. Även om dessa händelser är mindre vanliga, har vi observerat kloner där varken deletion eller non-radering amplikoner kunde detekteras, och vid ytterligare undersökning återspeglar dessa mer komplexa utfall. Vi har observerat omfattande CRISPR / Cas9-förmedlad &quot;ärrbildning&quot; av icke-deletion alleler från monoallel och icke-deletionskloner (se figur 2B). Dessa &quot;ärr&quot; består avsmå InDels produceras vid sgRNA klyvningsstället utan det avsedda radering (dvs, strykning av den mellanliggande segmentet mellan sgRNAs A och B). Dessa ärr avbryter ofta måligenkännande av sgRNA. Vi vill därför uppmana försiktighet retargeting alleler i celler som tidigare exponerats för sgRNAs med samma sgRNAs. En mer framgångsrik retargeting strategi skulle utnyttja unika sgRNA sekvenser skiljer sig från tidigare &quot;ärrade&quot; igenkänningsställen. I de fall när ett par sgRNAs erkänner exonic sekvenser (Figur 1B, botten), kan frame alleler produceras även i avsaknad av radering. Därför kan monoallel deletionskloner anrikas för förlorad funktion på grund av den höga frekvensen av ramskiftningsmutationer på den icke-raderade allel 12. Ett bekymmer med CRISPR / Cas9 systemet är off-target effekter, dvs genomisk modifiering vid oavsiktliga platser 36-38. Recent rapporter har antytt att kortare styr RNA med 17-19 nukleotider kan minska frekvensen av CRISPR / Cas9-baserade ej åsyftade effekter 39. Dessutom kan en dubbel nicking strategi med två guider per målplatsen med en nickase användas för att skapa DSBs samtidigt minimera ej åsyftade effekter 7. Alternativt analogt med strategier som används för RNAi, föreslår vi att olika par av sgRNAs med icke-överlappande protospacer sekvenser användas för att visa att den observerade fenotypen är ett resultat av den on-målet CRISPR / Cas9 modifiering i motsats till en potential off-target effekt. En praktisk lösning skulle vara att utforma minst två närliggande men icke överlappande sgRNA paren så att en enda uppsättning av screening primers (se steg 2) kan användas för flera sgRNA par (Figur 1A). Dessutom kan komplettera en strykning cellinje genom att återinföra den saknade sekvensen och / eller störd gen bygga ett orsakssamband mellanen given genomisk deletion och fenotyp. För biologer som arbetar med cellulära modellsystem har RNAi representerat ett kraftfullt verktyg för funktionsgenomik. Dock har begränsningar av denna strategi ingår ofullständig minskning målet mRNA-transkript nivåer, heterogenitet effekten av oberoende reagenser riktar samma gen, och kända ej åsyftade effekter inklusive utsäde baserade och icke-utsäde effekter 40-42. Genome redigering strategier lovar att ta itu med många av dessa problem och utgör en spännande, kompletterande strategi för blivande genetisk störning 8,36,37. Dessutom möjliggör genomet redigering för studier av icke-kodande genetiska element på ett sätt som inte är möjligt med RNAi och utmanande med konventionell inriktning närmar 25. Vi uppmuntrar generation iska strykningar med CRISPR / Cas9 som en robust och specifik metod för att producera och karakterisera förlust-of-funktionen alleler.

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1&#8211;3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate &#8220;nicking&#8221; or transcriptional regulation respectively7&#8211;9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12&#8211;14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17&#8211;21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:388px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pSpCas9(BB) (pX330)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BTX Solution and 2mm Cuvettes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pmaxGFP Plasmid</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuickExtract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>QE09050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq PCR Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zero Blunt PCR Cloning Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2700-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genomic deletions in mammalian cell lines via crispr/cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Målet med detta experiment var att stryka Pim1 i MEL celler. Användning av flera icke-överlapp sgRNA paren (dvs oberoende protospacer sekvenser) kan hjälpa till att kontrollera för off-mål effekter (Figur 1A). En konsekvent fenotyp skulle vara mer sannolikt att resultera från en on-target effekt i motsats till en gemensam off-target effekt som delas av flera oberoende protospacer sekvenser. Varje par skulle leda till produktion av en unik radering brytpunkt. Om nära tillsammans (dvs., n mindre än ~ 150 bp), kan samma screenings primrar användas för att detektera deletioner som produceras av varje uppsättning av sgRNAs. Genomiska deletioner kan störa gener genom användning sgRNA par på olika platser i förhållande till genen (Figur 1B). Till exempel kan den sgRNA paret flankera en gen för deletion av hela genen kroppen; paret kunde lokaliseras inom två exoner, med potential att skapa frame InDels även om en eller båda allelenes inte bort; eller paret kan flankera en specifik exon att tillåta avbrott i en viss isoform. Strykningen strategi som används för Pim1 var att designa flankerar sgRNAs att radera hela genen kroppen, en 8 kb deletion (Figur 2). Denna strategi valdes delvis på grund av den relativt lilla storlek Pim1 genen. Detta exempel visar en PAM (grön) på ovansidan (Watson) strängen och en PAM på botten (Crick) strängen; dock DSB oberoende av PAM sekvens lokalisering till toppen eller botten strängen. sgRNA paren kan ha båda PAM sekvenser på toppsträngen, både på den undre strängen, eller en av varje. Med användning av ovan beskrivna protokollet, har två sgRNA utformade, klonad in i pX330 expressionsvektom, och levereras till MEL-celler genom elektroporering tillsammans med en GFP reporter (Figur 2A). Toppen 3% av GFP + celler sorterades två dagar efter elektroporation och ströks klonalt vid begränsande utspädning. Screening primrar utformades såsom beskrivs i steg 2 och såsom visas i figur 2. PCR-betingelser optimerades med användning gDNA isolerats från paren MEL-celler och från &quot;bulk&quot; sorterade celler. 10 dagar efter plätering, var gDNA isolerad från alla kloner och screenas för radering via PCR, som identifierade icke-radering, monoallel och bialleliska deletionskloner enligt mönster av icke-deletion (ND) och radering (D) amplikoner (Figur 3) . Icke-deletionskloner identifierades som har närvaron av den icke-deletionen amplikon och frånvaron av deletionen amplicon. Monoallel kloner identifierades som att ha närvaro av både den icke-deletion och radering amplikoner. Bialleliska kloner identifierades som att ha frånvaro av den icke-deletionen amplikon och närvaron av deletionen amplicon. För denna strykning, ades 400 kloner screen som identifierades 126 monoallel deletionskloner och 32 biallelisk Delet<html> ion kloner (det är viktigt att notera att radering frekvens varierar med radering storlek 12). Bialleliska deletionskloner valdes ut och flyttade till kolvar med 8 ml av media. Efter att ha låtit fem dagar för expansion genomfördes varje klon testas på nytt med PCR av gDNA att bekräfta bialleliska radering och radering amplikoner utsattes för Sanger-sekvense att identifiera den exakta deletionen (Figur 2B). Heterogenitet inom radering amplikonema speglar ofullkomliga Indel bildande NHEJ reparation. Sekvensering av den icke-deletionsallel i monoallelelic deletionskloner avslöjats InDels i de flesta fall, vilket visar att även den icke-raderade allel ofta redigerad av CRISPR / Cas9, vilket kan vara viktigt för tillämpningar där det krävs både monoallel och bialleliska deletionskloner . RNA isolerades från bialleliska deletionskloner och analyserades med RT-qPCR att bekräfta förlust av Pim1 expression (Figur 4). sätt &quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig1highres.jpg" /> Figur 1. Schematisk bild av tänkbara strategier radering. (A) Två exempel sgRNA par för iska deletioner (visas i svart och orange, respektive). De blå pilarna visar primers för att upptäcka icke-rader amplicon och röda pilarna visar primers att upptäcka rader amplicon. sgRNA positionerna 17 och 18 är markerade i rött och blått på sgRNA-webbplatser-A 1 / A 2 och är markerade med lila och orange vid 1 / B 2 B sgRNA-webbplatser-med en röd linje som indikerar det förutspådda Cas9 klyvningen mellan positionerna 17 och 18. (B) CRISPR styrd klyvningar visas som vertikala svarta linjer. De blå pilarna visar primers för att upptäcka icke-rader amplicon och röda pilarna visar primers att upptäcka rader amplicon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se</a>en större version av denna siffra. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig2highres.jpg" /> Figur 2. Strategi för att producera och upptäcka radering av Pim1, inklusive sekvense radering och icke-radering alleler. (A) Schematisk av PCR baserad screening strategi att identifiera Pim1 deletionskloner. Ett primerpar ligger internt till radering (blå pilar) och ett primerpar är lokaliserad utanför rader (röda pilar). sgRNA sekvenser (protospacer sekvenser) visas i lila. De vertikala röda linjerna indikerar den förutsagda Cas9 klyvning mellan positionerna 17 och 18 av den sgRNA sekvensen. (B) Sånger sekvense avslöjar Indel bildning vid sgRNA igenkänningsstället. sgRNA sekvenser visas i lila och PAM sekvenser i grönt. Borttagande händelser är shegen genom ett motsvarande antal streck märken och infogningar är markerade med blått. Vertikala röda linjer indikerar förutspått klyvningsställe, mellan positionerna 17 och 18 i sgRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52118/52118fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig3highres.jpg" /> Figur 3. Representant gel identifiera icke-radering, monoallel och bialleliska kloner. För varje klon, representerar det vänstra körfältet den icke-rader amplikon (&quot;ND&quot; i blått) och den högra körfältet representerar rader amplikonen (&quot;D&quot; i rött ). Individuella kloner separeras genom streckade linjer. De tre monoallel deletionskloner är kloner 5, 6, och 2. De tre bialleliska deletionskloner är kloner 15, 17, och 13. Såsom framgår av sekvensdata, strykningen bandet för c<html> lone 13 har en mindre storlek på grund av större strykningar vid radering korsningen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52118/52118fig4highres.jpg" /> Figur 4. Förlust av Pim1 uttryck i bialleliska deletionskloner. Pim1 uttryck beräknades för två bialleliska deletionskloner av RT-qPCR. Data normaliserades till GAPDH använder 2 - ΔCt-metoden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Protospacer Sequence </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabell 1. 20-mer protospacer sekvenser för två sgRNA för att stryka Pim1. 543 &quot;&gt; <tbody><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:101px;"></td><td style="width:443px;"> Omvända komplementet Protospacer Sekvens </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;"> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabell 2. omvända komplementet till de protospacer sekvenserna för två sgRNA från tabell 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Sekvenser </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Protospacer sekvenser och deras omvända kompletterar med &quot;CACC&quot; och &quot;AAAC&quot; tillade för kloning i pX330 vektorn med hjälp Bbsl restriktionsenzym. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Sekvenser </td></tr><tr><td> sgRNA-A </td><td> 5&#39;- CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-A-rc </td><td> 5&#39;- AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B </td><td> 5&#39;- CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> sgRNA-B-rc </td><td> 5&#39;- AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> Tabell 4. sgRNA expression från U6 promotorn i pX330 vektorn förstärks genom tillsats av en G-nukleotid efter CACC sekvensen och före20-mer. Tillsatsen av en extra G nukleotid kräver tillsats av en C-nukleotid vid 3&#39;-änden av den omvända komplementet oligo (t.ex. sgRNA-A). Men om den första positionen för 20-mer (protospacer sekvens) är redan en G nukleotid, finns det ingen anledning att lägga till ytterligare G (t.ex. sgRNA-B) och inget behov av att lägga C till den slutliga positionen av den omvända komplementet oligo.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generation av genomiska Strykningar i däggdjurscellinjer via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

generation-of-genomic-deletions-in-mammalian-cell-lines-via-crisprcas9

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Analyzing Gene Expression and Function

SCIENTISTS IN ACTION

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

UPPDRAG esiRNA för RNAi screening i däggdjursceller

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generering av RNA / DNA-hybrider i Genomiskt DNA genom omvandling med hjälp av RNA-innehållande oligonukleotider

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

Den gröna monster Process för generering av jäststammar Redovisat flera Gene Strykningar

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Generering av stabila humana cellinjer med tetracyklin-inducerbar (Tet-on) shRNA eller cDNA-uttryck

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

Anaerob tillväxt och underhåll av däggdjursceller linjer

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

Genomteknik för primära mänskliga B-celler med CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&amp;#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

TGF-β-medierad endotel till mesenkymal övergång (EndMT) och funktionell bedömning av endmt-effektorer med CRISPR / Cas9 Genredigering

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Konstruktion av homozygota mutanter av flyttgräshoppa med CRISPR/Cas9-teknik

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.