Name: assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Eye Institute of National Institutes of Health under tildeling numre: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) og P30EY014104. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. Yderligere støtte blev leveret af Massachusetts Lions Eye Research Fund (KMC) og en særlig Scholar Award fra forskning til at forhindre Blindness (til KMC).

Alle dyreforsøg blev håndteret i overensstemmelse med Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring om anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research, og de retningslinjer og regler angivet af Massachusetts øjet og øret Ambulatorium Animal Care udvalget. Dagen før forsøget: 1. Fremstilling af rør til Flow Afdeling <ol><li> For at forberede den jugulare side, tilslut 1 cm PE10 slange polyethylen til 6 cm silicium slange efterfulgt af 5 cm polyethylen slange. For carotis side forberede samme måde jugularis side med tilsætningen af en T-rør i 6 cm silicium slange omkring 1,5 cm fra 1 cm polyethylenrør (figur 1A, B). For at indsætte T-røret, udvider silicium røret ved hjælp af fine tænger, hvis nødvendigt. </li><li> Tilslut den ene ende af 10 cm silikone slange til tryktransducer derefter indsætte T ende af carotis sIDE T-rør ind i den anden ende. Sørg forbindelsen sites er stramme og lække gratis. Påfør et lille rektangulært stykke parafilm over, hvor slangen passer sammen, hvis det er nødvendigt, for at forhindre lækage (figur 1C). </li></ol> 2. Belægning mødesalen <ol><li> Forbered endoteloverfladen coating protein (fx P selectin, intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1), vaskulær celleadhæsion-protein-1 (VCAM-1)) i 0,1% BSA. Som en retningslinje, 1 ug protein i 200 pi BSA er nok til at belægge 4-5 kamre. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte forbundet til en 25 G nål, tilføre hvert kammer (0,04 x 0,4 x 50 mm) med endotel overfladebelægning protein. Opbevar overtrukne kamre i et 15 ml rør ved 4 ° C natten over. </li></ol> Dagen for forsøget: 3. Forberedelse af mødesalen <ol><li> Fjern de coatede kamre fra 4 ° C, og fastgøres jugularis og carotis slange til hver side. Forsegl connections ved omhyggeligt at strække en lille rektangulært stykke parafilm over, hvor slangen opfylder kammeret. Ved hjælp af en sprøjte, fylde kammeret og slanger med 0,1% BSA (kontrol for lækage). Inkuber i 45 minutter. </li><li> Forbered en 35 mm petriskål til at holde kammeret ved at skære hak på hver side af skålen. Stabiliser kammeret i indhakkene; derefter bruge en lille dråbe silikone på anbringelse af kammeret i skålen på det takkede site. Sørg for, at kammeret er niveauet ved at se under mikroskop. Lad silikone tørre i mindst 15 min. </li><li> Fyld en 60 ml låse sprøjte med heparin og oprette forbindelse til tryktransducer. Tryktransduceren til carotis slangen i følgende rækkefølge: Transducer, silicium slanger og T-rør. <ol><li> Brug en 1 cm PE50 mellem silicium slange forbundet til transduceren og T-røret for at sikre forbindelsen. Pass halspulsåren silicium slange gennem tryk klemmen (figur 1D). Kør 100USP heparin throUH slangen og kammeret, indtil der ikke er nogen luftbobler. </li></ol></li></ol> 4. Opsætning af softwaren <ol><li> For at forberede software, tænder computeren, mikroskop, og åben lab enhed. Dobbeltklik på Leica ansøgning suite (LAS) (eller tilsvarende) og forberede en mappe for at gemme videoen: browse → erhverve → film → definere sekvens af klip (klip = 15, optagetid = 30 sek, og intervaller = 15 sek) klik derefter på &quot;+&quot; tegnet for at bekræfte. </li><li> For at optage strømningstrykket åbne LabChart (eller tilsvarende) fil og koordinere filnavnet til optagemappen i trin 4.1, ovenfor. </li></ol> 5. Kirurgisk Procedure <ol><li> Bedøver en 8-10 uger gamle mus med en kombination af ketamin (60 mg / kg) og xylazin (6 mg / kg) injiceret intraperitonealt (IP). Bekræft, at dyb sedation opnås inden 5-10 min ved tab af tilbagetrækning pedal refleks. Hvis det er nødvendigt, isofluranleveret via ansigtsmaske kan gives efter behov. </li><li> Mens under anæstesi, placere en varmepude under buret og sat til 37 ° C for at opretholde legemstemperatur. Når korrekt anæstesi er bekræftet, skal du placere musen i en ventral stilling og pels øjnene med bacitracin salve for at forhindre tørhed okulær. </li><li> Derefter barbere håret på incisionssted hjælp et barberblad og rengør grundigt sitet med alkohol. </li><li> Når fuldt bedøvede sikre dyret med tape holde musen i en ventral stilling. Frilægges halsområdet med en saks og fjerne skjoldbruskkirtlen at blotlægge trachea og fartøjer (figur 2A). </li><li> Rengør halspulsåren, indtil den er fuldt eksponeret pas på ikke at beskadige vagus nerve (figur 2B). Fold et stykke sutur og videregive bøjningen under halspulsåren skæres derefter ved bøjningen, så der nu 2 stykker af sutur nedenunder carotis. Loop hver sutur i knob (ikke strammeknob). </li><li> Gentag den samme procedure for at blotlægge den venstre halsvene (figur 2C), fremstilling af suturerne på samme måde (figur 2D). </li><li> Slut slangen til musen vaskulatur. <ol><li> Heparinize musen ved at injicere 1 ml heparin IP. </li><li> Spænd øvre sutur på halspulsåren. Anbring beholderen klemme så lavt, som det kan gå på halspulsåren (figur 3A). Brug pincet til at holde arterien af den øvre sutur og lave et lille snit, ca. 1/8 af omkredsen af arterien ved hjælp af microscissors (figur 3B). </li><li> Pass halspulsåren slangen gennem den anden knude i den øvre sutur og i snit i arterien. Bind off nedre sutur så arterien er forseglet omkring slangen (flere knuder skal foretages for at sikre en tæt forsegling; figur 3C). </li><li> Gentag den samme procedure for indsættelse halsvenen slangen (fartøjetklemme er ikke nødvendigt for jugular side, figur 3D). </li><li> Test strømmen ved at frigive fartøjet klemme. Hvis der ikke er utætheder flytte musen til mikroskopet og tilslut carotis slanger og halsvene til kammeret slangen (se vedlagte video for demonstration af kirurgisk procedure). </li></ol></li></ol> 6. Optagelse Rolling Velocity <ol><li> Åbn carotis klemmen til at fylde kammeret, hvilket gør et kredsløb med musen kredsløbssygdomme. Lad blodet cirkulere i 3-5 min, således at strømningsforholdene stabilisere sig. I ventetiden på 3-5 min, justere mikroskopbordet således at kammeret er plan fra den ene ende til den anden med mikroskopobjektivet, og dens kant er parallel med videooptagelse vindue på skærmen. </li><li> Fyld den modificerede petriskål indeholdende glas kammer med vand og derefter sænke 10X vand immersionsobjektiv i skålen, således at cellerne, der strømmer gennem kammeret er synlige.Lysstyrken kan justeres til passende visning af cellerne. Generelt en lavere intensitet er bedre. </li><li> Juster klemmen på slangen, således at transduceren læser en konstant 30 mm Hg, korrelerer til et medium fysiologisk vandtryk, eller som ønsket. </li><li> Tryk på &quot;start&quot; for at indlede optagelsen både video og trykket med den første tid bortfalder tæt på jugular ende og bevæger sig mod strømmen mod carotis ende indtil afsluttet. BEMÆRK: Flere coating betingelser under anvendelse af forskellige adhæsionsmolekyler kan studeres i den samme mus ved hjælp af flere kamre. Kun én prøvelokalet måles i gangen. <ol><li> Når optagelsen er færdig, lukkes ventilen ved indgangen sted, stoppe blodgennemstrømningen. Fjern kammeret og montere en ny kammer (overtrukket med et andet adhæsionsmolekyle) til kredsløb ved hjælp af fine tænger i den ene hånd og rillede pincet i den anden hånd. Genoptage optagelsen til det nye kammer som skitseret i de faser,6,1-6,4. </li></ol></li><li> Aflive alle mus af CO 2 kvælning efterfulgt af en rygmarv dislokation ved slutningen af eksperimentet. Proceduren terminal derfor musene aflivet ved en rygmarv dislokation ved slutningen af ​​eksperimentet. </li></ol> 7. fortolkning af resultaterne <ol><li> For at analysere de registrerede data bruge &quot;M TrackJ&quot; plugin til ImageJ software 23. </li><li> Konvertere filen til gråtoner efter Vælg Filer → import → AVI → konvertere til gråtoner. </li><li> Standardisering rammerne ved Select → billede → ejendom → indtaste rammen intervaller (i) → global. Beregn rammen intervaller ved at dividere den samlede video varighed (normalt 30 sek) med antallet af frames i en video (vist i det øverste hjørne af J video vindue). </li><li> Mål strømmen af ​​hver leukocyt efter Vælg plugin → M TrackJ → Tilføj spor → vælg et leukocyt→ Spor det med hver ramme til 15-20 sek → Flet. </li><li> Gentag trin 7.4 for alle leukocytter i udsigt. </li><li> Bestem den gennemsnitlige rullende hastighed af leukocytterne, Select foranstaltning → to kolonner vises → Kopiér alle M TrakJ: Sange i et regneark. Kolonnen mærket &quot;betyder V&quot; er leukocyt rullende målt i pixels / sekund. Konvertere til gm / sek ved at dividere med 2/3. </li><li> For at analysere trykket data højdepunkt og eksport i et regneark og udfører følgende beregning: AP (mm Hg) og t (dyn / cm 2) for en sammenligning mellem hver forsøgsgruppe. Når beregnet, kopiere dataene i prisme software til tegning. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

Processen med leukocytrekruttering er et afgørende skridt i den inflammatoriske respons; det indebærer migration af leukocytter fra kredsløbet mod målvæv, hvor de er i stand til at udøve deres effektorfunktion. Leukocytrekruttering er integreret i en række inflammatoriske tilstande, såsom atherosklerotiske plaques, myokardieinfarkt, iskæmi / reperfusion og transplantation surgery 1, samt flere CNS-relaterede neuro-inflammatoriske tilstande 10-12,20,24,25. Baggrund af de forskelligartede betingelser sygdom, leukocytrekruttering spænd, den autoperfused Microflow kammer yder et uundværligt redskab, der giver undersøgeren mulighed for at studere leukocytmigration dynamik. I løbet af de sidste mange årtier har en række forskellige in vitro assays er udviklet til at studere dynamikken i leukocyt celleadhæsion 26. Desværre alle disse assays kræver udvinding afleukocytterne fra blodet, indføre mekanisk aktivering. For at komme tættere på in vivo miljø blev tilpasninger foretaget for at indsamle fuldblodsprøver og kontrollere hæmodynamisk strømningsforhold 16,17. Her vi udvider de tidligere fremskridt inden for området ved at koble et overtrukket kammer til musen kredsløbssygdomme. Vi er i stand til at regulere strømmen af ​​blod til en fysiologisk interval og studere dynamikken i leukocytrulning. Den coatede kammer giver os mulighed for at studere leukocyt interaktioner med specifikke adhæsionsmolekyler. Da systemet fungerer som en enhed, der drives af en levende mus, det mere nøje efterligner det naturlige miljø, tillader os at studere leukocyt-endotel-interaktioner i en række immunologiske musemodeller. Derudover dette system giver os mulighed for at drage fordel af de mange genetiske musemodeller rådighed. Mens systemet ikke helt replikere in vivo miljø, det giver en platform til at studere specific elementer af leukocytterne under fysiologiske betingelser, en præstation, der ikke tidligere har været muligt. Selvom det tager os et skridt tættere på en mere fysiologisk miljø der er begrænsninger for systemet. Det er ikke helt kopiere den komplekse 3D-matrix af karrene, så vi er kun i stand til at vurdere visse elementer af leukocyt interaktioner, der er begrænset til kammeret belægning. Desuden bør man være meget omhyggelig med at sikre et lukket system til musen cirkulation ved at følge alle trinene nævnt i protokollen. Indførelsen af ​​luftbobler i høj grad vil påvirke nøjagtigheden og reproducerbarheden af ​​forsøgene. Mens vi beskriver anvendelsen af ​​Autoperfused Microflow kammer til vurdering leukocytrulning dynamik proceduren har potentialet til at være personlig af forskere til at studere en række sygdomme. For eksempel kræftceller metastaserer ved at udtrykke mange af de almindelige integrinerne deles af leukocytter. Studying deres rullende dynamik i en indstilling, der i højere grad efterligner et in vivo miljø kunne bidrage til vores viden, og eventuelt forudsigelsen af den invasive art af visse kræftceller. En mulig fremgangsmåde kunne være at kombinere en mærkning teknik til cancerceller, såsom GFP 27, sammen med strømningskammeret assay til at spore rullende dynamik cancercellerne udtrykker GFP. I lyset af fleksibiliteten belægge kammeret med en række stoffer og forbinde flere kamre til den samme mus, vil det være interessant at se, hvordan denne procedure er modificeret til brug i andre laboratorier i kombination med genetisk modificerede mus og sygdomsmodeller. Teknikken vi beskriver her blot berører et meget bredere potentiale, er kun begrænset af kreativitet investigator ansøgningen.

Inflammation er kroppens universelle reaktion på skade og er et afgørende skridt i både medfødte og adaptive immunsystem funktion. Som reaktion på skade og / eller inflammatoriske stimuli, endotelceller opregulere specifikke adhæsionsmolekyler; dette fører til leukocyt ekstravasation gennem det mikrovaskulære endotel, primært i post-kapillære venuler. Denne proces begynder med tethering af fritflydende leukocytter i blodet på endotel. Stabil rullende og fast vedhæftning af leukocytter, hvilket igen fører til sjælevandring og udskillelsen af cytostatika, følge denne tethering 1,2. Selectiner er kendt for at mediere de tidlige trin i kaskaden 3-5; integriner er ansvarlige for de senere trin i fast adhæsion og transmigration 1,6-8. Stadig flere beviser tyder leukocytter og endotel adhæsionsmolekyler har afgørende roller i dyremodeller af iskæmisk reperfusionsbeskadigelse, Astma, psoriasis, dissemineret sklerose, og aldersrelateret makuladegeneration 9-12. Under disse betingelser er den inflammatoriske reaktion misdirected at angribe ens egen krop, hvilket resulterer i nedbrydning af sundt væv. Eksisterende antiinflammatoriske midler (såsom ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler, kortikosteroider eller andre kemoterapeutiske midler) bærer risikoen for alvorlige bivirkninger med langvarig brug 13. Det er derfor af stor interesse at have de nødvendige værktøjer med evnen til at identificere sygdomsspecifikke molekyler, som i sidste ende kan målrettes til at have den ønskede anti-inflammatorisk virkning, mens de resterende ikke-toksisk 14. Eksisterende in vitro-metoder, såsom den statiske leukocytadhæsion assay blev anvendt så tidligt som 1976 15. Den parallelle strømning Kammeret blev først anvendes in vitro i 1987 for at studere leukocyt-endotel-interaktioner under strømningsforhold. I disse forsøg stimulerede human polymorfkernede leukocytter (PMN&#39;er) fra veneblod blev perfunderet i et monolag af primære humane navleveneendotelceller (HUVEC&#39;er). For at kontrollere for de hæmodynamiske strømningsforhold blev Harvard Apparatus sprøjtepumpen ansat 16. Alternativt, for at undgå kunstig leukocytter isolation blev fuldblod anvendes i kombination med glasset kammer overtrukket med immobiliserede adhæsionsmolekyler 17. For at undgå leukocyt stimulation og mekanistisk studere deres interaktion med adhæsionsmolekylerne under omtrentlige fysiologiske betingelser, en ex vivo autoperfused, ekstrakorporal, arteriovenøs kredsløb blev udviklet 16. I dette kredsløb, blodet strømmer mellem den højre, fælles carotidarterie og venstre ydre halsvene af en levende mus under anæstesi, så interaktion native PBL&#39;er inden et glas Microflow kammer overtrukket med enkelt eller co-immobiliserede adhæsionsmolekyler. En stor fordel for denne system er evnen til at anvende genetisk manipulerede mus, hvor inflammatoriske veje er direkte eller indirekte manipuleret. Derudover er der mulighed for at lokalisere den isolerede bidrag leukocytadhæsion molekyler til inflammation, fri for ekstern aktivering under strømningsforhold. Anvendelsen af en flowregulator på input punkt strømningskammeret giver en bred vifte af eksperimentelle variationer af forskydningskræfter til at efterligne enten arteriel eller venøs systemer 18-22. Her beskriver vi i detaljer en protokol om forberedelse og udførelse af ex vivo autoperfused Microflow kammer assay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Leukocyt-endotel interaktioner er tidlige og kritiske hændelser i akut og kronisk inflammation og kan, når dysreguleret, mægle vævsskade, der fører til varig patologisk skade. Eksisterende konventionelle assays tillader analyse af leukocytadhæsion molekyler efter udvinding af leukocytter fra blodet. Dette kræver blodet underkastes flere trin før perifere blodleukocytter (PBL&#39;er) kan være klar til analyse, hvilket kan stimulere PBL&#39;er der påvirker forskningsresultater. Den autoperfused micro flow kammer assay, tillader imidlertid forskerne at studere tidlige leukocytter funktionelle dysregulering ved hjælp af den systemiske strøm af en levende mus samtidig have frihed manipulere en belagt kammer. Gennem en sygdom model kan den funktionelle ekspression af leukocytadhæsion molekyler vurderes og kvantificeres i en mikro-glas kammer overtrukket med immobiliserede endotel adhæsionsmolekyler ex vivo. I denne model, strømmer blodetmellem den højre, fælles carotidarterie og venstre ydre halsvene af en levende mus under anæstesi, så interaktionen af ​​native PBL&#39;er i kammeret. Real-time eksperimentel analyse opnås med hjælp fra en intravital mikroskop samt en Harvard Apparatus tryk enhed. Anvendelsen af ​​en flowregulator på input punkt i glaskammer giver sammenlignelige fysiologiske strømningsforhold blandt forsøgene. Leukocyt rullende hastighed er det vigtigste resultat, og måles ved anvendelse af National Institutes of Health åben adgang software ImageJ. Sammenfattende autoperfused micro strømningskammer analysen giver et optimalt fysiologisk miljø at studere leukocytter endotel interaktion og giver forskerne til at drage præcise konklusioner, når man studerer inflammation.

<html> Under hver optagelse kun interagerende leukocytter er tydeligt på kammeret. Resultater fra et repræsentativt eksperiment kan ses i figur 4. De hvide pile peger på de enkelte leukocytter, som blev opfanget af adhæsionsmolekyle af interesse og ruller langs kammeret blandt andet fritflydende dem i blodstrømmen. En fælles artefakt udenfor kammeret kan ses med de store mørke kugler i alle billederne. De mørke områder hjælpe læseren værdsætte leukocyt bevægelse i forhold til et fast punkt. Leukocytter fremføring over en periode på 22 sek kan ses i forhold til kuglerne. Grafen i samme figur viser en sidste plot af data hvor Tx1 nedsætter rullende hastighed (et skift til venstre) og Tx2 øger hastigheden (et skift til højre) sammenlignet med kontrollen. 0 &quot;/&gt; Figur 1: Fremstilling af rør til strømningskammeret. (A) Nødvendigt værktøj til slanger og kammer samling (micro glas kammer 0,4 x 0,04 x 50 mm, polyethylen rør PE10, polyethylen slange PE60, silicium rør 002, Y rør, T rør, 35 mm petriskål, fine tang, fine sakse, rørholder, vaskulær klemme 7-0 silkesutur. (B) Fremstilling af halspulsåren og halsvenen rør til omdirigering af musen blodstrømmen gennem den belagte kammer. (C), der forbinder halspulsåren slangen til tryktransduceren. (D) Før slangen fra transduceren gennem klemmen for at justere hastigheden af blodgennemstrømningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større udgave af dette tal.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figur 2:. udsættes halspulsåren og halsvenen (A) skåret forsigtigt halsområdet for at blotlægge trachea (B) Rengør højre carotidarterie således at et stykke af sutur kan føres under beholderen (punkteret gul. linje skitserer halspulsåren). (C) Rengør venstre halsvene således at et stykke af sutur kan føres under beholderen (stiplede gule linje skitserer halsvenen). (D) sørge løst bundet suturer ved de øvre og nedre regioner af halspulsåren og halsvenen (pile angivet de øvre og nedre områder af fartøjer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større udgave af dette tal.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figur 3: Tilslutning af slangen til than halspulsåren og halsvenen. (A) Spænd den øverste knude på carotis og placere klemmen under den nedre knude. (B) ved hjælp af microscissors, lave et lille snit i carotid, omkring 1/8 omkredsen (punkteret gul cirkel angiver snittet). ( C) Sæt slangen i carotis og sikres med mindst to suturer (grøn stiplede linje viser slangen og den gule stiplede linje halspulsåren). (D) Tilsvarende indsætte slangen i halsvenen (grøn stiplede linje viser slangen og gule stiplede linje halsvenen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større udgave af dette tal.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figur 4: Repræsentativ tidsforløb af leukocytter rullende gennem flow chamber (Scale bar = 100 pm) (hvide pilespidser påpege rullende leukocytter). Graph afbilder repræsentative resultater efter eksporten i en graftegning program (Tx1 og Tx2 er eksperimentelle behandlingsgrupper og CTR er kontrolgruppen). Tx1 betegner en behandling, ved hvilken leukocytter bremse fører til et fald i leukocytter rullende hastighed og en venstre forskydning af grafen i forhold til den ubehandlede gruppe (CTR), mens Tx2 fører til en højre skift afspejler en stigning i leukocytter rullende hastighed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Klik her for et større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Her præsenterer vi en protokol, der tillader investigator at vurdere leukocytrekruttering dynamik ex vivo ved at forbinde et kammer belagt med endotel-afledt adhæsionsmolekyler til kredsløbssystemet på en mus. Denne metode giver betydelige fordele, da det giver mulighed for leukocyt vurdering efter relative biologiske forhold.

Vurdering Leukocyt--endotel interaktioner Under strømningsforholdene i en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-plade Flow Afdeling og Continuous Flow Circuit at evaluere endoteliale stamceller under Laminar Flow forskydningsspænding

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bestemmelse af transport Rate af Xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjælp af<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelige placentaperfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Tre-dimensionel Flow Chamber Device at studere Chemokin-rettet Ekstravasation Celler Cirkulerende under fysiologiske strømning

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em&gt; In vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

En automatiseret metode til udførelse af in vitro-Mikronukleusanalysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidet differentiering af modne nyre podocytter fra menneskeskabte pluripotente stamceller under kemisk definerede forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Celle-kulturperlede arterielle modeller til at studere vaskulære Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Et mikrofysiologisk system til undersøgelse af leukocyt-endotelcelleinteraktion under betændelse

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...