Name: assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door National Eye Institute van de National Institutes of Health onder award nummers: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) en P30EY014104. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health. Aanvullende steun werd verleend door het Fonds Massachusetts Lions Eye Research (KMC) en een speciale Scholar Award van Onderzoek ter voorkoming van Blindheid (tot KMC).

Alle experimenten op dieren werden behandeld in overeenstemming met de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research, en de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Massachusetts Eye en Ear Infirmary Animal Care Committee. De dag voor het experiment: 1. Voorbereiding van Tubing voor Flow Kamer <ol><li> Om de halsader kant te bereiden, sluit 1 cm PE10 polyethyleen buis tot 6 cm siliconenslang gevolgd door 5 cm polyethyleen buis. Voor de halsslagader kant bereid vergelijkbaar met de jugulaire kant met de toevoeging van een T-buis binnen de 6 cm siliconenslang ongeveer 1,5 cm van de 1 cm polyethyleen buis (figuur 1A, B). Om de T-buis op te nemen, verbreden de siliconenslang met fijne pincet indien nodig. </li><li> Sluit het ene uiteinde van 10 cm van de silicone slang aan op de druksensor steek dan de T einde van de carotis side T-buis in het andere uiteinde. Zorg ervoor dat de aansluiting sites zijn strak en lekvrij. Breng een klein rechthoekig stuk parafilm boven de plaats waar de slang in elkaar past, indien nodig, om lekkage te voorkomen (figuur 1C). </li></ol> 2. Coating de Kamer <ol><li> Bereid de endotheliale oppervlaktelaag eiwit (bijvoorbeeld, P selectine, intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1), vasculair cel-adhesie eiwit-1 (VCAM-1)) in 0,1% BSA. Als richtlijn, 1 ug eiwit in 200 ul BSA is voldoende om de vacht van 4-5 kamers. Met behulp van een 1 ml spuit verbonden met een 25 G naald trekken elke kamer (0,04 x 0,4 x 50 mm) met endotheliale coating proteïne. Bewaar de gecoate kamers in een 15 ml buis bij 4 ° C overnacht. </li></ol> De dag van het experiment: 3. Voorbereiden van de Kamer <ol><li> Verwijder de beklede kamers bij 4 ° C en sluit de halsader en halsslagader slang aan elke zijde. Dicht de verbons door voorzichtig rekken een klein rechthoekig stuk parafilm boven de plaats waar de slang voldoet aan de kamer. Met behulp van een injectiespuit, vult de kamer en slangen met 0,1% BSA (controleren op lekkage). Incubeer gedurende 45 min. </li><li> Bereid een 35 mm petrischaal de kamer houden door te snijden inkepingen aan weerszijden van de schotel. Stabiliseren van de kamer in de inkepingen; gebruik dan een kleine druppel van siliconen aan de kamer om de schotel vast te zetten op de getande website. Zorg ervoor dat de kamer is niveau door te kijken onder de microscoop. Laat de silicone drogen gedurende ten minste 15 min. </li><li> Vul een 60 ml spuit vergrendeling met heparine en verbinding met de drukomvormer. Sluit de drukomvormer aan de halsslagader slangen in de volgende volgorde: Transducer, siliconenslang, en T-buis. <ol><li> Een 1 cm PE50 tussen de siliconenslang verbonden met de transducer en de T-buis om de verbinding te beveiligen. Passeer de halsslagader silicium slang door de druk klem (figuur 1D). Run 100USP heparine doorgaandugh de slang en de kamer totdat er geen luchtbellen. </li></ol></li></ol> 4. Instellen van de software <ol><li> Om de software te bereiden, zet de computer aan, microscoop, en een open lab apparaat. Dubbelklik op de Leica Application Suite (LAS) (of gelijkwaardig) en voor te bereiden op een map om de video op te slaan: bladeren → verwerven → Film → opeenvolging van clips te definiëren (clips = 15, opnametijd = 30 sec, en intervallen = 15 sec) klik vervolgens op de &quot;+&quot; teken te bevestigen. </li><li> Om op te nemen van de stroom druk opent de LabChart (of gelijkwaardig) bestand en coördineren van de naam van het bestand naar de map opname in stap 4.1, hierboven. </li></ol> 5. chirurgische ingreep <ol><li> Verdoven een 8-10 weken oude muizen met een combinatie van ketamine (60 mg / kg) en xylazine (6 mg / kg) geïnjecteerd intraperitoneaal (IP). Bevestigen dat diepe sedatie wordt bereikt binnen 5-10 min door het verlies van pedaal terugtrekking reflex. Eventueel isofluraangeleverd via gezichtsmasker kunnen worden gegeven indien nodig. </li><li> Terwijl onder verdoving plaats een verwarmingskussen onder de kooi en op 37 ° C tot lichaamstemperatuur. Zodra de juiste verdoving wordt bevestigd, plaatst u de muis in een ventrale positie en de vacht van de ogen met bacitracin zalf om oculaire uitdroging te voorkomen. </li><li> Daarna scheer het haar op de incisie site met behulp van een scheermesje en de site met alcohol grondig te reinigen. </li><li> Eenmaal volledig onder narcose te beveiligen het dier met tape houden van de muis in een ventrale positie. Expose de nek met een schaar en verwijder de schildklier aan de luchtpijp en de bloedvaten (Figuur 2A) bloot. </li><li> Reinig de halsslagader totdat deze volledig is blootgesteld het verzorgen van de nervus vagus (Figuur 2B) niet te beschadigen. Vouw een stukje hechtdraad en voorbij de bocht onder de halsslagader en snijd in de bocht dus er zijn nu 2 stukjes hechtdraad onder de halsslagader. Loop elke hechtdraad in knopen (niet draai deknopen). </li><li> Herhaal deze procedure voor de linker halsader (figuur 2C) bloot bereiden van de hechtingen op dezelfde wijze (Figuur 2D). </li><li> Sluit de slang aan op de muis vaatstelsel. <ol><li> Heparinize de muis door het injecteren van 1 ml heparine IP. </li><li> Draai de bovenste hechting op de halsslagader. Leg het schip klem zo laag als het kan gaan op de halsslagader (Figuur 3A). Tang om de slagader door het bovenste hechtdraad bezit en een kleine incisie, ongeveer 1/8 van de omtrek van de slagader via de microscissors (Figuur 3B). </li><li> Leid de halsslagader slang door de tweede knoop in de bovenste hechtdraad en in de incisie in de slagader. Bind de onderste hechtdraad, zodat de slagader wordt afgesloten rond de buis (meerdere knopen moeten worden gemaakt om een goede afdichting te waarborgen; Figuur 3C). </li><li> Herhaal dezelfde procedure voor het plaatsen van de halsader buis (het vatklem is niet noodzakelijk voor de jugulaire zijkant Figuur 3D). </li><li> Test de stroom door het vrijgeven van het schip klem. Als er geen lekken beweeg de muis om de microscoop en sluit de carotis buizen en halsader aan de kamer buis (zie bijgevoegde video voor de demonstratie van de chirurgische ingreep). </li></ol></li></ol> 6. Opnemen Rolling Velocity <ol><li> Open de halsslagader klem om de kamer te vullen, waardoor een circuit met de muis bloedsomloop. Laat het bloed circuleren gedurende 3-5 min zodat de stroom te stabiliseren. Gedurende de wachttijd van 3-5 minuten, stel de microscooptafel zodat de kamer waterpas van de ene naar de andere met het microscoopobjectief en de rand evenwijdig is aan het video-opname venster op het scherm. </li><li> Vul het gemodificeerde petrischaal met de glazen kamer met water dan de 10X water immersie objectief zakken in de schaal, zodat de cellen stroomt door de kamer zichtbaar.De lichtintensiteit kan moeten worden aangepast adequate weergave van de cellen. Over het algemeen een lagere intensiteit beter. </li><li> Stel de slangklem zodat de transducer leest een constante 30 mm Hg, correleert een medium fysiologische stromingsdruk, of zoals gewenst. </li><li> Druk op &quot;start&quot; om de opname van zowel de video en de druk bij de eerste time lapse dicht bij de halsader einde en bewegen tegen de stroom in de richting van de carotis einde totdat voltooid initiëren. OPMERKING: Verschillende coating omstandigheden en met verschillende adhesie moleculen kunnen worden bestudeerd in dezelfde muis met meerdere kamers. Slechts één meetkamer wordt tegelijk. <ol><li> Wanneer de opname is voltooid, sluit de klep aan de ingang site, het stoppen van de bloedstroom. Verwijder de kamer en breng een nieuwe kamer (gecoat met een ander adhesiemolecuul) om het circuit met fijne tang in de ene hand en groef tang in de andere hand. Opnieuw zal opnemen voor de nieuwe kamer zoals beschreven in de stappen6,1-6,4. </li></ol></li><li> Euthanaseren alle muizen door CO 2 stikken gevolgd door een ruggenmerg dislocatie na afloop van het experiment. De procedure terminal derhalve de muizen geëuthanaseerd door een ruggenmerg dislocatie na afloop van het experiment. </li></ol> 7. interpretatie van de resultaten <ol><li> Het analyseren van de geregistreerde gegevens gebruik maken van de &quot;M TrackJ&quot; plugin voor ImageJ software 23. </li><li> Het bestand converteren naar grijswaarden met Select file → Importeren → AVI → zetten naar grijswaarden. </li><li> Standaardiseren van de frames Selecteer → afbeelding → eigendom → door te voeren van het frame-intervallen (i) → mondiaal. Bereken het frame intervallen door de totale videoduur (meestal 30 seconden) van het aantal frames in een video (in de bovenhoek van het Image J videovenster). </li><li> Meet de stroom van elke leukocyten door Select plugin → M TrackJ → tracks toevoegen → selecteer een leukocyten→ Volg het met elk frame voor 15 - 20 sec → Samenvoegen. </li><li> Herhaal stap 7.4 van alle leukocyten gezien. </li><li> Bepaal de gemiddelde rollen snelheid van de leukocyten door Select maatregel → twee kolommen verschijnen → Kopieer alle M TrakJ: Sporen in een spreadsheet. De kolom &quot;betekenen V&quot; is de leukocyten rollen gemeten in pixels / seconde. Omzetten in um / sec door te delen door 2/3. </li><li> Om de druk gegevens hoogtepunt en export te analyseren in een spreadsheet en het uitvoeren van de volgende berekening: AP (mm Hg) en t (dyne / cm 2) voor een vergelijking tussen de experimentele groep. Eenmaal berekend, kopieert u de gegevens in prisma software voor grafieken. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

Het proces van rekrutering van leukocyten is een cruciale stap bij de ontstekingsreactie; het gaat om de migratie van leukocyten uit het vaatstelsel naar doelweefsels, waar zij kunnen hun effectorfunctie uitoefenen. Leukocyt rekrutering integraal in een verscheidenheid van inflammatoire aandoeningen zoals atherosclerose, myocard infarct, ischemie / reperfusie, en transplantatie chirurgie 1, evenals meerdere CZS gerelateerde neuro-inflammatoire condities 10-12,20,24,25. Gezien de diversiteit van de ziekte voorwaarden die leukocytaantrekking overspanningen, de autoperfused microflow kamer kan een onmisbaar instrument waarmee de onderzoeker de mogelijkheid om leukocytenmigratie dynamiek te bestuderen. In de afgelopen decennia zijn verschillende in vitro assays ontwikkeld om de dynamiek van leukocyt celadhesie 26 bestuderen. Helaas, al deze assays vereisen de winning vande leukocyten uit het bloed, de invoering mechanische activatie. Dichter bij de in vivo omgeving komen, zijn aanpassingen van volbloedmonsters verzamelen en besturen de hemodynamische stromingsomstandigheden 16,17. Hier breiden wij de voorgaande ontwikkelingen op het gebied van het koppelen van een beklede kamer naar de muis bloedsomloop. We kunnen de stroom van het bloed naar een fysiologische bereik te regelen en de dynamiek van leukocyten rollen. De gecoate kamer geeft ons de mogelijkheid om leukocyten interacties met specifieke adhesiemoleculen bestuderen. Omdat het systeem functioneert als een eenheid die door een levende muis, het beter bootst de natuurlijke omgeving, waardoor we leukocyt-endotheel interacties te bestuderen in diverse immunologische muismodellen. Bovendien, dit systeem stelt ons in staat om te profiteren van de vele genetische muismodellen beschikbaar. Hoewel het systeem de in vivo omgeving niet geheel repliceren biedt een platform specifi bestuderenc elementen van de leukocyten onder fysiologische omstandigheden, een prestatie die voorheen niet mogelijk was. Hoewel dit brengt ons een stap dichter bij een fysiologische omgeving zijn er beperkingen aan het systeem. Het maakt niet volledig zijn gerepliceerd de complexe 3D-matrix van het vaatstelsel, dus we zijn alleen in staat om bepaalde elementen van leukocyt interacties die zijn beperkt tot de kamer coating beoordelen. Daarnaast moet grote zorg worden genomen om een ​​gesloten systeem de muis circuleren door na de in het protocol genoemde stappen. De introductie van luchtbellen grote invloed op de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de experimenten. Terwijl we beschrijven het gebruik van de Autoperfused microflow kamer voor de beoordeling leukocyten rollen dynamiek procedure heeft het potentieel kunnen worden aangepast door onderzoekers van verschillende ziekten te bestuderen. Bijvoorbeeld kankercellen uitzaaien door expressie kunnen de meest integrinen gedeeld door leukocyten. Studying hun rollen dynamiek in een omgeving die beter nabootst een in vivo omgeving kan helpen in onze kennis en eventueel de voorspelling van het invasieve karakter van bepaalde kankercellen. Een mogelijke benadering zou kunnen zijn om een labeling techniek combineren de kankercellen, zoals GFP 27, samen met de stroom kamer assay rollen dynamiek van de kankercellen tot expressie GFP te volgen. Gezien de flexibiliteit van de coating kamer met een verscheidenheid van stoffen en aansluiten van meerdere kamers dezelfde muis zal interessant zijn om te zien hoe deze procedure wordt aangepast voor gebruik in andere laboratoria in combinatie met genetisch gemodificeerde muizen en ziektemodellen. De techniek die hier beschreven net raakt op een veel bredere toepassing potentieel dat alleen beperkt door de creativiteit van de onderzoeker.

Ontsteking is het lichaam van de universele reactie op letsel en is een cruciale stap in zowel aangeboren en adaptieve immuunsysteem. In reactie op letsel en / of inflammatoire stimuli, endotheelcellen upregulate specifieke adhesiemoleculen; dit leidt tot extravasatie leukocyten door het microvasculaire endotheel, vooral in post capillaire venulen. Dit proces begint met aanbinden van vrij stromende leukocyten in de bloedbaan van het endotheel. Stabiele walsen en stevige adhesie van leukocyten, wat leidt tot transmigratie en de uitscheiding van cytotoxische middelen, volg deze tethering 1,2. Selectinen zijn bekend bij de eerste stappen van de cascade 3-5 bemiddelen; integrines zijn verantwoordelijk voor de latere stappen van stevige adhesie en transmigratie 1,6-8. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert leukocyten en endotheelcellen adhesie moleculen hebben een belangrijke rol bij diermodellen van ischemie-reperfusie schade, Astma, psoriasis, multiple sclerose, en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie 9-12. Onder deze omstandigheden wordt de ontstekingsreactie verkeerd gericht op het eigen lichaam aanvallen, wat resulteert in de afbraak van gezond weefsel. Bestaande anti-ontstekingsmiddelen (zoals niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen, corticosteroïden of andere chemotherapeutische middelen) dragen het risico op ernstige bijwerkingen van langdurig gebruik 13. Daarom is het van groot belang de juiste instrumenten hebben het vermogen om ziekte-specifieke moleculen identificeren die uiteindelijk kan worden gericht op de gewenste anti-inflammatoire werking, terwijl de resterende niet-toxisch 14. Bestaande in vitro methoden zoals de statische leukocyt adhesie assay werden reeds in 1976 15 gebruikt. De parallel flow chamber werd eerst gebruikt in vitro in 1987 tot leukocyt-endotheel interacties te bestuderen onder stromingscondities. In deze experimenten gestimuleerd human polymorfonucleaire leukocyten (PMN&#39;s) van veneus bloed werden geperfuseerd over een monolaag van primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Om te controleren voor de hemodynamische stromingscondities, werd de Harvard Apparatus injectiepomp werkzaam 16. Ook kunstmatige leukocyten isolatie voorkomen werd volbloed gebruikt in combinatie met de glazen kamer bekleed met geïmmobiliseerd adhesiemoleculen 17. Leukocyten stimulatie te voorkomen en mechanistisch studeren hun interactie met de adhesie moleculen onder benaderende fysiologische omstandigheden, een ex vivo autoperfused, extracorporale, arterioveneuze circuit werd ontwikkeld 16. In dit circuit, het bloed stroomt tussen de rechter halsslagader en de linker uitwendige halsader van een levende muis onder verdoving, zodat interactie van natief PBL in een glazen microflow kamer bekleed met één of co geïmmobiliseerde adhesiemoleculen. Een groot voordeel van deze system is het vermogen om genetisch gemanipuleerde muizen, waarbij ontstekingsreacties rechtstreeks gemanipuleerd gebruiken. Daarnaast is er de mogelijkheid om de geïsoleerde bijdrage van leukocyt adhesiemoleculen ontsteking, aan externe activering lokaliseren, onder stromingscondities. De toepassing van een debietregelaar in de invoerpositie van de stroming kamer kan een groot aantal experimentele variaties van afschuifkrachten ofwel arteriële of veneuze systemen 18-22 nabootsen. Hier beschrijven we in detail een protocol met betrekking tot de voorbereiding en uitvoering van de ex vivo autoperfused microflow kamer assay.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Leukocyten-endotheel interacties zijn vroege en kritieke gebeurtenissen in acute en chronische ontsteking en kan, wanneer ontregeld, bemiddelen weefselschade leiden tot permanente pathologische beschadiging. Bestaande conventionele testen kan de analyse van leukocyt adhesiemoleculen na de winning van leukocyten uit het bloed. Dit vereist het bloed verschillende stappen ondergaan voordat perifeer bloed leukocyten (PBL) klaar voor analyse, waardoor PBL beïnvloeden van de onderzoeksresultaten kunnen stimuleren kan worden. De autoperfused micro stromingskamer assay echter kunnen wetenschappers vroeg leukocyten bestuderen functionele ontregeling via de systemische stroom van een levende muis terwijl de vrijheid van manipulatie van een beklede kamer. Door middel van een ziekte-model, kan de functionele expressie van leukocyt adhesie moleculen worden beoordeeld en gekwantificeerd in een micro-glazen kamer gecoat met geïmmobiliseerde endotheliale adhesiemoleculen ex vivo. In dit model, het bloed stroomttussen de rechter halsslagader en de linker uitwendige halsader van een levende muis onder verdoving, waardoor de interactie van natieve PBL in de kamer. Real-time experimentele analyse wordt bereikt met de hulp van een intravitale microscoop evenals een Harvard Apparatus druk apparaat. De toepassing van een debietregelaar in de invoerpositie van de glazen kamer laat vergelijkbare fysiologische stroomomstandigheden bij de experimenten. Leukocyten rollen snelheid is de belangrijkste uitkomst en wordt gemeten met behulp van de National Institutes of Health open access-software ImageJ. Samengevat, de autoperfused micro stromingskamer test geeft een optimale fysiologische omgeving om leukocyten studeren endotheliale interactie en stelt onderzoekers in staat om nauwkeurige conclusies bij het bestuderen van de ontsteking te trekken.

<html> Tijdens elke opname alleen interactie leukocyten zijn duidelijk op de kamer. Resultaten van een representatief experiment is te zien in figuur 4. De witte pijlen wijzen naar individuele leukocyten die werden gevangen adhesie molecuul van belang en rollen langs de kamer onder andere vrijvloeiend die binnen de bloedstroom. Een gemeenschappelijke artefact buiten de kamer kan worden gezien met de grote donkere sferen in alle beelden. De duistere sferen te helpen de lezer genieten van de leukocyten beweging ten opzichte van een vast punt. Leukocyten vooruitgang gedurende een periode van 22 seconden kan worden gerelateerd aan de bollen. De grafiek in dezelfde figuur toont een laatste grafiek van de gegevens waarbij Tx1 vermindert de rolsnelheid (een verschuiving naar links) en Tx2 verhoogt de snelheid (een verschuiving naar rechts) vergeleken met de controle. 0 &quot;/&gt; Figuur 1: Bereiding van buisleidingen voor de stromingskamer. (A) Benodigd gereedschap voor slangen en kamermuziek assemblage (micro glazen kamer 0,4 x 0,04 x 50 mm, polyethyleen buis PE10, polyethyleen buis PE60, siliconenslang 002, Y buis, T buis, 35 mm petrischaal, fijne tang, fijne schaar, buishouder, vasculaire klem 7-0 zijde hechtdraad. (B) Bereiding van de halsslagader en de halsader buizen voor het opnieuw richten van de muis bloedstroom door de beklede ruimte. (C) Met de halsslagader slang aan de drukomvormer. (D) Leid de slang van de transducer door de klem om de snelheid van de bloedstroom te passen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figuur 2:. ontmaskeren de halsslagader en de halsader (A) afgesneden voorzichtig de nek naar de luchtpijp bloot (B) Maak de rechter halsslagader zodat een stuk hechtdraad kan worden gevoerd onder het vat (gestippeld geel. lijn schetst de halsslagader). (C) Maak de linker halsader zodat een stuk hechtdraad kan worden gedaan onder het vat (gestippelde gele lijn schetst de halsader). (d) regelt losjes hechtingen aan de bovenste en onderste gebieden van de halsslagader en de halsader (pijlen aangegeven de bovenste en onderste delen van de schepen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figuur 3: Het aansluiten van de slangen aan tHij halsslagader en halsader. (A) Draai de bovenste knoop op de carotis en plaats de klem onder de onderste knoop. (B) Met behulp van de microscissors, maken een kleine incisie in de halsslagader, ongeveer 1/8 van de omtrek (gestippelde gele cirkel geeft de incisie). ( C) Plaats de slang in de halsslagader en veilig met ten minste twee hechtingen (groene stippellijn geeft de slang en de gele gestippelde lijn de halsslagader). (D) Ook plaatst slangen in de halsader (groene stippellijn geeft de slang en de gele gestippelde lijn de halsader). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figuur 4: Vertegenwoordiger tijdsverloop van leukocyten rollen door de stroom chamber (Schaal bar = 100 micrometer) (witte pijlen wijzen rollen leukocyten). Grafiek toont representatieve resultaten na het exporteren in een grafische programma (Tx1 en Tx2 zijn experimentele behandeling groepen en CTR is de controlegroep). TX1 is een behandeling waarbij leukocyten vertragen leidt tot een afname van leukocyten rollen snelheid en een linker verschuiving van de grafiek in vergelijking met de onbehandelde groep (CTR), terwijl Tx2 leidt tot een verschuiving naar rechts voor de toegenomen leukocyten rolsnelheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Hier presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker leukocytaantrekking dynamiek ex vivo evaluatie door er een kamer bekleed met endotheliaalverkregen adhesiemoleculen aan het circulatiesysteem van een muis. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen, omdat het zorgt voor leukocyten beoordeling op grond van de relatieve biologische omstandigheden.

Het beoordelen Leukocyte-endotheliale Interacties Onder stroomtoestanden in een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused microflow Kamer Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering door Intrinsic Vascularisatie in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In vitro 3D-celgekweekte arteriële modellen voor het bestuderen van vasculaire drugtargeting onder stroom

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...