Name: assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

В исследовании, опубликованном в данной публикации, была поддержана Национальным институтом глаз Национальных Институтов Здоровья под номерами Награда: R01EY022084 / S1 (КИК), T32EY007145 (ГС) и P30EY014104. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья. Дополнительная поддержка была предоставлена ​​Lions исследовательского фонда Массачусетского глаз (КИК) и Специального ученого награду от исследований в области профилактики слепоты (КМК).

Все эксперименты на животных были обработаны в соответствии с Ассоциацией по исследованиям в области зрения и офтальмологии и убытках за использования животных в офтальмологических и Vision Research, и руководящие принципы и правилами, установленными в Массачусетском глаз и ушей лазарет комитета по уходу за животными. День до эксперимента: 1. Подготовка труб для проточной камеры <ol><li> Для приготовления яремной сторону, подключите 1 см PE10 полиэтиленовых труб до 6 см трубки кремния, а затем 5 см полиэтиленовой трубы. Для сонной стороны, готовить так же, как яремной стороне с добавлением Т-образной трубки внутри кремниевой трубки 6 см около 1,5 см от 1 см полиэтиленовой трубкой (фиг.1А, Б). Для того, чтобы вставить Т-трубки, расширить силиконовой трубки с помощью тонких щипцов, если это необходимо. </li><li> Подключите один конец 10 см силиконовой трубки для датчика давления затем вставьте конец T сонной сIDE Т-трубки в другой конец. Убедитесь, что соединение сайты затянуты и герметичны бесплатно. Нанесите небольшое прямоугольную часть парафином над местом, где трубка соответствует вместе, если это необходимо, чтобы не допустить утечки (1в). </li></ol> 2. Покрытие палату <ol><li> Подготовка белок эндотелиальных покрытия поверхности (например, Р селектина, молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), сосудистые адгезии клеток белок-1 (VCAM-1)) в 0,1% BSA. В качестве ориентира, 1 мкг белка в 200 мкл BSA достаточно, чтобы покрыть 4-5 камер. Использование 1 мл шприц, соединенный с иглой 25 G, влить каждую камеру (0,04 х 0,4 х 50 мм) с белком эндотелия поверхностного покрытия. Хранить покрытием камеры в 15 мл пробирке при 4 ° С в течение ночи. </li></ol> День эксперимента: 3. Подготовка палату <ol><li> Удалить покрытых камеры от 4 ° С и соединить яремной и сонную трубки с каждой стороны. Печать на connectiДополнения тщательно растяжения небольшой прямоугольный кусок парафильмом над тем, где трубка соответствует в камеру. С помощью шприца заполнить камеру и трубку с 0,1% BSA (проверка на утечки). Инкубируют в течение 45 мин. </li><li> Подготовка 35 мм чашки Петри удерживать камеру за счет сокращения выемки на каждой стороне тарелки. Стабилизация камеры в пазы; затем с помощью небольшой капли силикона, чтобы прикрепить камеру к чашке на зубчатым сайта. Убедитесь, что камера уровень, глядя под микроскопом. Разрешить силиконовые высохнуть в течение не менее 15 мин. </li><li> Заполните 60 мл блокировки шприц с гепарином и подключить к датчику давления. Подключите датчик давления с трубкой сонной в следующем порядке: Датчики, кремния трубки и Т-образной трубки. <ol><li> Используйте 1 см PE50 между трубой кремния, подключенного к преобразователю и Т-трубки, чтобы обеспечить соединение. Пропустите кремния трубки сонной артерии через зажим давления (рис 1D). Запустите 100USP гепарин беспересадочныйтьфу трубы и камерного пока нет пузырьков воздуха. </li></ol></li></ol> 4. Настройка программного обеспечения <ol><li> Чтобы подготовить программу, включите компьютер, микроскоп и открытой лаборатории устройства. Дважды щелкните на набора приложений Leica (LAS) (или эквивалент) и подготовить папку для сохранения видео: Обзор → приобретают → Фильм → последовательность клипов определить (клипы = 15, время записи = 30 сек, а интервалы = 15 сек) затем нажмите кнопку &quot;+&quot; знак подтверждения. </li><li> Для записи давления потока открыть LabChart (или эквивалент) файл и координировать имя файла в папке для записи в шаге 4.1, выше. </li></ol> 5. Хирургические процедуры <ol><li> Обезболить 8-10-недельных мыши, используя комбинацию кетамина (60 мг / кг) и ксилазина (6 мг / кг) вводили внутрибрюшинно (IP). Убедитесь, что глубокой седации достигается в течение 5-10 мин при потере педаль отмены рефлекса. Если необходимо, изофлураномдоставлены с помощью маски может быть предоставлена ​​в случае необходимости. </li><li> В то время как под наркозом, место потепления площадку под клетки и установлен на 37 ° C для поддержания температуры тела. После того, как собственно анестезия подтвердил, поместите курсор в брюшной позиции и пальто глаза бацитрацинового мази, чтобы предотвратить глазные сухость. </li><li> После этого, брить волосы на месте разреза с помощью лезвия бритвы и тщательно очистить сайт с алкоголем. </li><li> После полной анестезии обеспечить животное с лентой держать мышь в брюшной положении. Подвергать области шеи с помощью ножниц и удалить щитовидную железу, чтобы разоблачить трахеи и сосудов (рис 2а). </li><li> Очистите сонную артерию, пока не в полной мере подвержена стараясь не повредить блуждающего нерва (рис 2б). Сложите кусок шва и передать изгиб под сонной артерии затем разрезают на повороте так что есть 2 части шва расположенные под сонной артерии. Loop каждый шов в узлы (не затягивайтеузлов). </li><li> Повторите ту же процедуру, чтобы выставить левую яремную вену (фиг.2С), подготовке швов таким же образом (фиг 2D). </li><li> Подключите трубку к сосудистой мыши. <ol><li> Heparinize мыши путем введения 1 мл гепарина IP. </li><li> Затяните верхнюю нить на сонной артерии. Поместите зажим сосуда в виде низкой, как это может пойти на сонной артерии (рис 3а). Использование щипцов для удержания артерии верхней нити и сделать небольшой разрез, около 1/8 длины окружности артерии, используя microscissors (фиг.3В). </li><li> Пропустите трубку сонной артерии через второй узел в верхней шва и в разрез, сделанный в артерии. Галстук нижнюю нить, так что артерии запечатан вокруг трубы (несколько узлов должны быть сделаны, чтобы гарантировать герметичное уплотнение; 3в). </li><li> Повторите ту же процедуру для вставки яремной трубки вен (суднозажим не требуется для яремной стороны, рисунок 3D). </li><li> Проверьте поток, освободив зажим сосудов. Если нет никаких утечек переместите мышь, чтобы микроскопа и подсоедините трубку сонной и яремную вену с трубкой камеры (прилагается видео для демонстрации хирургической процедуры). </li></ol></li></ol> 6. Запись скорости качения <ol><li> Откройте сонной зажим, чтобы заполнить камеру, что делает схему с системой мышь кровообращения. Разрешить кровь циркулировать в течение 3-5 мин, так что условия потока стабилизации. За время ожидания 3-5 мин, отрегулируйте столик микроскопа так, чтобы камера уровень от одного конца до другого с объектива микроскопа и его край параллельно с окном видео записи на экране. </li><li> Заполните модифицированный чашку Петри, содержащую стеклянную камеру с водой, а затем опустить 10X погружением в воду цели в чашку таким образом, что клетки, проходящие через камеру видны.Интенсивность света, возможно, придется быть приспособлены для адекватного просмотра клеток. Вообще снижение интенсивности лучше. </li><li> Регулировка зажима на трубке таким образом, что преобразователь считывает устойчивый 30 мм рт.ст., коррелируют с среднего давления физиологического потока, или по желанию. </li><li> Нажмите &quot;Start&quot;, чтобы начать запись и видео и давление с первого промежутка времени, близкой к яремной конца и движущейся против течения к концу сонной, пока не завершена. Примечание: Несколько Условия нанесения покрытия с использованием различных молекул адгезии могут быть изучены в той же мыши с помощью нескольких камер. Только одна камера будет записано за один раз. <ol><li> Когда запись закончена, закройте клапан на входе сайте, останавливая поток крови. Удалить камеру и вставить новый камеру (с покрытием с другой молекулой адгезии) к цепи с использованием тонких щипцов в одной руке и рифленых щипцов, с другой стороны. Резюме записи для нового камеру, как описано в шагах6.1-6.4. </li></ol></li><li> Эвтаназии все мышей СО 2 удушья с последующим спинного мозга дислокации в конце эксперимента. Процедура терминала, таким образом, мышей умерщвляли с помощью спинного мозга дислокации в конце эксперимента. </li></ol> 7. Интерпретация результатов <ol><li> Для анализа записанные данные использовать &quot;M TrackJ&quot; плагин для ImageJ программного обеспечения 23. </li><li> Конвертировать файл в оттенках серого, выберите Файл → Импорт → AVI → преобразовании в оттенки серого. </li><li> Стандартизация кадры от Выберите → изображение → собственности → введите интервалы кадров (I) → глобальный характер. Рассчитать интервалы кадров путем деления общей длительности видео (как правило, 30 сек) по количеству кадров в одном видео (показано в верхнем правом углу изображения J окне видео). </li><li> Измерьте расход каждого лейкоцитов по Выбрать плагина → M TrackJ → Добавить дорожки → выберите лейкоцитов→ отслеживать его с каждым кадром в течение 15 - 20 сек → Merge. </li><li> Повторите шаг 7,4 для всех лейкоцитов в поле зрения. </li><li> Определить среднюю скорость качения лейкоцитов по Выбрать мере → две колонки появиться → Скопируйте все М TrakJ: Треки в электронную таблицу. Колонка под названием &quot;означают V&quot; является лейкоцитов прокатки измеряется в пикселях / секунду. Преобразование в мкм / сек путем деления на 2/3. </li><li> Для анализа выделения данных давления и экспорт в электронную таблицу и выполните следующий расчет: P (мм рт.ст.) и Т (дин / см 2) для сравнения каждой экспериментальной группы. После расчета скопировать данные в призме программного обеспечения для построения графиков. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

Процесс вербовки лейкоцитов является важным шагом в воспалительной реакции; она включает в себя миграцию лейкоцитов из сосудистой системы к тканям-мишеням, где они способны оказывать свою функцию эффекторной. Подбор лейкоцитов является неотъемлемой частью в различных воспалительных заболеваний, таких как атеросклеротических бляшек, инфаркт миокарда, ишемии / реперфузии, а также пересадки 1, а также нескольких связанных ЦНС нервно-воспалительных состояний 10-12,20,24,25. Учитывая разнообразие условий заболевания по вербовке лейкоцитов пролеты, autoperfused микропотока камера обеспечивает незаменимую инструмент, позволяющий следователю возможность изучать динамику миграции лейкоцитов. За последние несколько десятилетий, ряд анализов в пробирке были разработаны для изучения динамики адгезии лейкоцитов клеток 26. К сожалению, все эти анализы требуют извлечениелейкоцитов из крови, введение механической активации. Чтобы приблизиться к окружающей среде в естественных условиях, адаптации были сделаны, чтобы собрать образцы цельной крови и контролировать условия гемодинамики потока 16,17. Здесь мы расширяем предыдущие достижения в области связывая камеру с покрытием к системе мыши кровообращения. Мы способны регулировать поток крови к физиологическим диапазона и изучать динамику лейкоцитов прокатки. Камера покрытием дает нам возможность изучить лейкоцитов взаимодействия с особыми молекулами адгезии. Поскольку система функционирует как единое целое управляется живой мыши, что более точно имитирует природную среду, что позволяет изучать лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в различных иммунологических мышах. Кроме того, эта система позволяет использовать преимущества нескольких генетических мышиных моделях, доступных. В то время как система не полностью воспроизвести среду в естественных условиях, он предоставляет платформу для изучения УдельныйС элементами лейкоцитов в физиологических условиях, подвиг, который ранее не удалось. Даже если это ведет нас на шаг ближе к более физиологической среде существуют ограничения в системе. Это не полностью воспроизвести сложную 3D матрицу сосудистой поэтому мы только смогли оценить некоторые элементы лейкоцитов взаимодействий, которые ограничены в камеру покрытия. Кроме того, большое внимание должно быть принято, чтобы обеспечить замкнутую систему для циркуляции мыши, с соблюдением всех мер, упомянутых в протоколе. Введение пузырьков воздуха значительно повлиять на точность и воспроизводимость экспериментов. В то время как мы описываем использование камеры Autoperfused MicroFlow для оценки динамики качения лейкоцитов процедура имеет потенциал, чтобы персонализировать следователями для изучения различных заболеваний. Например, раковые клетки метастазируют выразить многие из общих интегринов лейкоцитов, разделяемых. Studyinг их динамика качения в условиях, более точно имитирует среду, в естественных условиях может помочь в наших знаниях, и, возможно, прогнозирования, насильственного характера некоторых раковых клеток. Одним из возможных подходов может быть объединить технологии маркировки для раковых клеток, таких как GFP 27, вместе с проточную камеру анализа отслеживать динамику прокатки раковых клеток, экспрессирующих GFP. Принимая во внимание гибкость покрытия камеры с помощью различных веществ и подключении нескольких камер к той же мыши, будет интересно посмотреть, как эта процедура модифицирована для использования в других лабораториях, в сочетании с генетически модифицированных мышей и модели заболеваний. Методика, которую мы описываем здесь только затрагивает гораздо более широкий потенциал применения, которая ограничивается только творчеством следователя.

Воспаление является универсальной реакцией организма на повреждение и важный шаг в обоих врожденного и адаптивного иммунного функции системы. В ответ на повреждение и / или воспалительные стимулы, эндотелиальные клетки активируют специфические молекулы адгезии; это приводит к лейкоцитов через эндотелий микрососудов, прежде всего, в почтовых венул. Этот процесс начинается с модема из сыпучих лейкоцитов в крови на эндотелий. Стабильный прокатки и фирма адгезию лейкоцитов, которые, в свою очередь, приводит к переселению и секреции цитотоксических агентов, следовать этому привязывать 1,2. Селектины, как известно, посредником ранние этапы каскада 3-5; Интегрины несут ответственность за последующие шаги фирмы адгезии и переселения 1,6-8. Все больше данных свидетельствует о том лейкоцитов и эндотелиальных молекул адгезии играют жизненно важную роль в животных моделях ишемии реперфузии, Астма, псориаз, рассеянный склероз, и возрастной макулярной дегенерации 9-12. В этих условиях, воспалительная реакция засланный атаковать собственное тело, в результате пробоя здоровой ткани. Существующие противовоспалительные средства (такие как нестероидные противовоспалительные препараты, кортикостероиды, или других химиотерапевтических агентов) несут риск серьезных побочных эффектов при длительном применении 13. Таким образом, представляет большой интерес иметь соответствующие инструменты с возможностью выявления конкретных заболеваний молекулы, которые в конечном счете могут быть направлены, чтобы иметь желаемый противовоспалительное действие, оставаясь при этом нетоксичный 14. Существующие в методах лабораторных, таких как статической адгезии лейкоцитов анализа были использованы уже в 1976 15. Камера параллельный поток был впервые использован в пробирке в 1987 году для изучения лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в условиях потока. В этих экспериментах стимулировали Humăп полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯ) из венозной крови были перфузии над монослоем первичных человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs). Для контроля условий гемодинамики потока, Гарвардский Аппарат шприцевой насос был использован 16. Кроме того, чтобы избежать изоляции искусственного лейкоцитов, цельной крови использовали в комбинации со стеклянной камере, покрытой иммобилизованными молекулы адгезии 17. Чтобы избежать лейкоцитов стимуляции и механистически изучить их взаимодействие с молекулами адгезии при приближенных физиологических условиях, экс естественных autoperfused, экстракорпоральное, артериовенозная схема была разработана 16. В этой схеме, кровь течет между правой общей сонной артерии и левой наружной яремной вены живой мыши под анестезией, что позволяет взаимодействие нативных ЛПК в стекла микропотока камере, покрытой одним или совместно иммобилизованных молекул адгезии. Основным преимуществом этого противовирусныем является возможность использовать генно-инженерных мышей, в которых воспалительные процессы, прямо или косвенно манипулировать. Кроме того, существует возможность точно определить изолированную вклад молекул адгезии лейкоцитов к воспалению, свободных от внешнего активации, в условиях потока. Применение регулятора расхода на входе точке проточной камеры обеспечивает широкий спектр экспериментальных вариаций силы сдвига, чтобы имитировать либо артериальной или венозной системы 18-22. Здесь мы опишем в деталях протокол о подготовке и выполнению экс естественных условиях autoperfused микропотока камеры анализа.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия ранние и критические события в остром и хроническом воспалении и может, когда Нарушение регуляции, посредником повреждение тканей, ведущих к постоянному патологических повреждений. Существующие традиционные анализы позволяют анализ молекул адгезии лейкоцитов только после извлечения лейкоцитов из крови. Это требует кровь пройти несколько шагов, прежде чем лейкоциты периферической крови (ЛПК) может быть готов для анализа, который в свою очередь может стимулировать ЛПК, влияющие на результаты исследований. Autoperfused микро проточная камера анализа, однако, позволяет ученым изучать ранние лейкоциты функционально нарушение регуляции с помощью системного потока живой мыши, имея свободу манипулирования камеру с покрытием. Через модели болезни, функциональной экспрессии молекул адгезии лейкоцитов может быть оценена количественно и в микро-стекла, покрытого камеры с иммобилизованными молекулы адгезии эндотелиальных исключая виво. В этой модели, кровь течетмежду правой общей сонной артерии и левой наружной яремной вены живой мыши под анестезией, что позволяет взаимодействие нативных ЛПК в камере. В режиме реального времени экспериментальный анализ осуществляется с помощью качестве прижизненной микроскопом, а также реле давления Аппарат Гарварде. Применение регулятора расхода на входе точки стеклянной камере позволяет сопоставимые физиологических условий потока среди экспериментов. Скорость лейкоцитов прокатки Главным итогом и измеряется с помощью Национальных Институтов Здоровья открытого доступа программного обеспечения ImageJ. Таким образом, autoperfused микро камера поток анализ обеспечивает оптимальную физиологическую среду для изучения лейкоцитов эндотелия взаимодействия и позволяет исследователям сделать точные выводы при изучении воспаления.

<html> В каждой записи только взаимодействующих лейкоцитов проявляются на камеру. Результаты из типичного эксперимента можно видеть на фиг.4. Белые стрелки указывают на отдельных лейкоцитов, которые были захвачены адгезии интерес молекулы и прокатных вдоль камеры среди других сыпучих них в потоке крови. Общий артефакт снаружи камеры можно увидеть с большими темными сферах во всех изображениях. Темные сферы помочь читателю оценить движение лейкоцитов по отношению к неподвижной точке. Лейкоциты улучшение в течение 22 сек можно видеть в отношении сфер. График на том же рисунке показана окончательный график данных, где Tx1 снижает скорость качения (сдвиг влево) и Tx2 увеличивает скорость (сдвиг вправо) по сравнению с контролем. 0 &quot;/&gt; Рисунок 1: Получение труб для проточной камеры. (A) Необходимые инструменты для труб и узла камеры (микро стекло камеры 0,4 х 0,04 х 50 мм, полиэтилен PE10 трубы, PE60 полиэтиленовых труб, кремния трубки 002, Y трубки, T труб, 35 мм чашки Петри, декоративные щипцы, тонкие ножницы, Держатель трубки, сосудистый зажим, 7-0 шов шелковой нитью. (Б) Получение сонной артерии и яремной вены трубки для повторного направления потока крови мыши с помощью камеры с покрытием. (С) Соединение трубки сонной артерии к датчику давления. (D) Пропустите трубку от датчика через зажим для регулировки скорости кровотока. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /><bг /&gt; Рисунок 2:. Воздействие на сонную артерию и яремную вену (А) Осторожно разрезать области шеи подвергать трахеи (В) Очистить правую сонную артерию, так, что кусок шва могут быть переданы под судна (пунктирная желтого цвета. линия очерчивает сонной артерии). (С) Очистить левую яремную вену так, чтобы часть нити могут быть переданы в соответствии с судна (пунктирная линия желтого описывает яремную вену). (D) обеспечивает слабо связаны швов в верхней и нижней областей сонной артерии и яремной вены (стрелки указаны верхние и нижние регионах сосудов). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Рисунок 3: Подключение трубки Тон сонной артерии и яремной вены. (А) Затянуть верхний узел на сонной артерии и поместите зажим ниже нижнего узла. (B) Использование microscissors, чтобы небольшой разрез в сонной артерии, приблизительно 1/8 окружности (пунктирная желтый круг указывает на разрез). ( C) Вставьте трубки в сонной артерии и обеспечить, по крайней мере двух швов (зеленая пунктирная линия показывает труб и желтый пунктир сонной артерии). (D) Аналогично вставьте трубку в яремную вену (зеленая пунктирная линия показывает труб и желтый пунктир яремной вены). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Рисунок 4: представитель временной ход лейкоцитов прокатки через Чам потокаBER (Масштаб бар = 100 мкм) (белые стрелки указывают подвижного лейкоциты). График показывает репрезентативные результаты после экспорта в программу графический (Tx1 и Tx2 экспериментальные группы по лечению и CTR является контрольная группа). Tx1 представляет собой обработку, в которой лейкоциты замедляют приводит к уменьшению скорости лейкоцитов и сдвиг влево на графике по сравнению с необработанной группой (CTR) прокатных, а Тх2 приводит к сдвигу правой отражающей увеличение лейкоцитов скорость прокатки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Здесь мы приводим протокол, который позволяет исследователю оценить динамику набора лейкоцитов Экс Vivo, подключив камеру с покрытием эндотелиальных полученных молекул адгезии к кровеносной системе мыши. Этот метод дает значительные преимущества, поскольку она позволяет оценивать лейкоцитов при относительной биологической условиях.

Оценка лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействий в условиях протекают в<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow палата Анализ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Определение транспортных Оценить ксенобиотиков и наноматериалы через плаценту помощью<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Плацентарной перфузии модели

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Роман трехмерного течения палаты по изучению устройства хемокинами направлены Экстравазация клеток, циркулирующих в физиологических условиях потока

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Тканевая инженерия по искробезопасности васкуляризации<em&gt; В Vivo</em&gt; Tissue Engineering палата

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Роман хирургической техники как основы для в естественных условиях частичной печени инженерии в крыса

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Автоматизированный метод для выполнения в пробирке Micronucleus Анализ с помощью многоспектральных изображений потока цитометрии

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Характеристика одномолекулярных конформационных изменений под стрижкой потока с флуоресценционной микроскопией

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D клеточные модели артерий для изучения сосудистых препаратов, нацеленных на поток

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Микрофизиологическая система для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток при воспалении

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...