Name: assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Forskningen rapporteras i denna publikation stöddes av National Eye Institute of National Institutes of Health i tilldelningsnummer: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) och P30EY014104. Innehållet är ensamt ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health. Ytterligare stöd kom från Massachusetts Lions Eye Research Fund (KMC) och en särskild Scholar Award från Forskning till Prevent Blindness (till KMC).

Alla experiment på djur har hanterats i enlighet med Föreningen för forskning i Vision och Ögon Uttalande för användningen av djur i oftalmisk och Vision Research, samt de riktlinjer och regler som anges av Massachusetts öga och öra Infirmary Animal Care kommittén. Dagen före försöket: 1. Beredning av Slangar för Flow avdelningen <ol><li> För att förbereda halsvenen sidan, anslut en cm PE10 polyeten slang till 6 cm kisel slang följt av 5 cm slang polyeten. För carotis sidan, förbereda på liknande sätt som den jugulara sida med tillägg av ett T-rör inom 6 cm kisel slang ca 1,5 cm från en cm polyetenslang (Figur 1A, B). För att sätta in T-rör, bredda silikonröret genom att använda fin pincett om nödvändigt. </li><li> Anslut ena änden av 10 cm silikonslang till tryckgivaren sedan in T änden av hals sIDE-T-rör in i den andra änden. Se till att anslutningen platser är täta och inte läcker. Applicera en liten rektangulär bit parafilm över där slangen passar tillsammans, om nödvändigt, för att förhindra läckage (Figur 1C). </li></ol> 2. Beläggning kammaren <ol><li> Förbered endotelytan beläggningsprotein (t.ex. P selektin, intercellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1), vaskulär cellvidhäftningsprotein-1 (VCAM-1)) i 0,1% BSA. Som en riktlinje, i 200 ^ BSA är 1 mikrogram av protein nog att belägga 4-5 kamrar. Med användning av en 1 ml spruta ansluten till en 25 G nål, ingjuta varje kammare (0,04 x 0,4 x 50 mm) med endotelyta beläggningsprotein. Förvara de belagda kamrarna i en 15 ml rör vid 4 ° C över natten. </li></ol> Dagen för experimentet: 3. Förbereda kammaren <ol><li> Ta bort de belagda kamrarna från 4 ° C och anslut jugular och hals slang till varje sida. Täta connections genom att försiktigt sträcka en liten rektangulär bit parafilm över där slangen möter kammaren. Med hjälp av en spruta, fylla kammaren och slang med 0,1% BSA (kontroll av läckage). Inkubera under 45 min. </li><li> Bered en 35 mm petriskål för att hålla kammaren genom att skära skåror på vardera sidan av skålen. Stabilisera kammare i skårorna; sedan använda en liten droppe av silikon för att fästa kammaren till skålen vid det skårade området. Se till kammaren är nivån genom att titta i mikroskopet. Låt silikon torka i minst 15 minuter. </li><li> Fyll en 60 ml låsning spruta med heparin och ansluta till tryckgivaren. Anslut tryckgivaren till halsslangen i följande ordning: Givare, kisel slangar och T-rör. <ol><li> Använd en 1 cm PE50 mellan kisel slangen ansluten till givaren och T-rör för att säkra anslutningen. Passera halspulsådern silikonslangen genom tryckklämman (Figur 1D). Kör 100USP heparin through slangen och kammaren tills det inte finns några luftbubblor. </li></ol></li></ol> 4. Installera programvaran <ol><li> För att förbereda programvaran, slår på datorn, mikroskop, och öppen lab enhet. Dubbelklicka på Leica Application Suite (LAS) (eller motsvarande) och förbereda en mapp för att spara videon: bläddra → förvärva → film → definiera sekvens av klipp (klipp = 15, inspelningstid = 30 sek, och intervaller = 15 sek) klicka sedan på &quot;+&quot; tecknet för att bekräfta. </li><li> För att spela in flödestrycket öppna LabChart (eller motsvarande) fil och samordna filnamnet till mappen inspelningen i steg 4.1, ovan. </li></ol> 5. Kirurgisk Tillvägagångssätt <ol><li> Bedöva en 8-10 veckor gammal mus med användning av en kombination av ketamin (60 mg / kg) och xylazin (6 mg / kg) injiceras intra-peritonealt (IP). Kontrollera att djup sedering uppnås inom 5-10 min med förlust av pedaltillbakadragande reflex. Om det behövs, isofluranlevereras via ansiktsmask kan ges efter behov. </li><li> Medan under anestesi, placera en uppvärmning pad under buren och inställd på 37 ° C för att upprätthålla kroppstemperaturen. När korrekt anestesi bekräftas, placera musen i en ventral position och päls ögonen med bacitracin salva för att förhindra torra ögon. </li><li> Därefter raka håret på snittet platsen med ett rakblad och rengör platsen med alkohol. </li><li> När fullt sövda säkra djuret med tejp hålla musen i en ventral position. Exponera nacken med sax och ta bort sköldkörteln att exponera luftstrupen och fartyg (Figur 2A). </li><li> Rengör halspulsådern tills den är helt exponerad noga med att inte skada vagusnerven (Figur 2B). Vik en bit sutur och passera böjen under halspulsådern skärs sedan i böjen så finns det nu två stycken sutur nedanför halspulsådern. Loop varje sutur i knop (inte dra åtknop). </li><li> Upprepa samma procedur för att exponera den vänstra halsvenen (figur 2C), förbereder suturerna på samma sätt (figur 2D). </li><li> Anslut slangen till musen kärl. <ol><li> Heparinisera musen genom att injicera 1 ml heparin IP. </li><li> Dra den övre sutur på halspulsådern. Placera kärlet klämman så lågt som det kan gå på halspulsådern (Figur 3A). Använd pincett för att hålla artären av den övre suturen och gör ett litet snitt, ungefär 1/8 av omkretsen av artären, med användning av de microscissors (figur 3B). </li><li> Passera karotidartären slangen genom den andra knutpunkten i den övre suturen och in i snitt i artären. Knyt bort nedre suturen så att artären är förseglad runt slangen (flera knutar bör göras för att säkerställa en tät förslutning, figur 3C). </li><li> Upprepa samma procedur för att sätta in halsvenen slang (fartygetbehövs inte klämma för jugular sidan; figur 3D). </li><li> Testa flödet genom att släppa fartyget klämman. Om det inte finns några läckor flytta musen till mikroskop och anslut hals slangar och halsvenen till kammaren slang (se bifogad video för demonstration av kirurgiskt ingrepp). </li></ol></li></ol> 6. Inspelning Rolling Velocity <ol><li> Öppna karotid klämman för att fylla kammaren, vilket gör en krets med musen cirkulationssystemet. Låt blodet cirkulera under 3-5 minuter så att flödesförhållandena stabiliseras. Under väntetiden på 3-5 minuter, justera mikroskop scenen så att kammaren är nivån från ena änden till den andra med mikroskop målet och dess kant är parallell med fönstret videoinspelning på skärmen. </li><li> Fyll modifierade petriskål med glaskammare med vatten sänk sedan 10X nedsänkning i vatten mål i skålen så att cellerna strömmar genom kammaren är synliga.Ljusintensiteten kan behöva justeras för erforderlig överblick av cellerna. Generellt en lägre intensitet är bättre. </li><li> Justera klämman på slangen så att omvandlaren läser en stadig 30 mm Hg, korrelerande till ett medium fysiologiskt flödestryck, eller såsom önskas. </li><li> Tryck på &quot;start&quot; för att initiera inspelning både videon och trycket med den första gången förflutit nära våldsam attack änden och flytta mot strömmen mot hals änden tills klar. OBS: Flera beläggningsförhållanden med användning av olika adhesionsmolekyler kan studeras i samma mus genom att använda flera kamrar. Endast ett kammaren registreras i taget. <ol><li> När inspelningen är klar, stäng ventilen på ingången platsen, stoppa blodflödet. Ta kammaren och montera en ny kammare (belagd med en annan adhesionsmolekyl) till kretsen med fin pincett i ena handen och räfflade pincett i den andra handen. Återuppta inspelningen för den nya kammaren som beskrivs i stegen6,1-6,4. </li></ol></li><li> Euthanize alla möss genom CO 2 kvävning följt av en ryggmärgs dislokation vid slutet av experimentet. Förfarandet är terminalen därför mössen avlivades genom en ryggmärgs dislokation vid slutet av experimentet. </li></ol> 7. Tolkning av resultat <ol><li> För att analysera inspelade data använder &quot;M TrackJ&quot; plugin för ImageJ programvara 23. </li><li> Konvertera filen till gråskala, Select file → import → AVI → konvertera till gråskala. </li><li> Standardisera ramarna genom Select → bild → egendom → ange ramintervall (i) → globalt. Beräkna ramintervall genom att den totala videotiden (vanligen 30 sek) med antalet bildrutor i en video (visas i övre hörnet av bild J videofönstret). </li><li> Mät flödet av varje leukocyt Select plugin → M TrackJ → Lägg spår → välja leukocyt→ Spåra den med varje bildruta för 15 - 20 sek → Merge. </li><li> Upprepa steg 7,4 för alla leukocyter i vyn. </li><li> Bestäm medelvärdet rullande hastigheten av leukocyter Select mått → två kolumner visas → Kopiera alla M TrakJ: Spår i ett kalkylblad. Kolumnen märkt &quot;betyder V&quot; är den leukocytrullning mätt i pixlar / sekund. Konvertera till um / sek genom att dividera med 2/3. </li><li> För att analysera tryckuppgifter höjdpunkt och export i ett kalkylblad och utföra följande beräkning: AP (mm Hg) och t (dyn / cm 2) för en jämförelse mellan varje försöksgrupp. När beräknat, kopiera data till prisma programvara för graf. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

Processen för leukocytrekrytering är ett avgörande steg i det inflammatoriska svaret; det innebär migration av leukocyter från cirkulationssystemet mot målvävnader, där de har möjlighet att utöva sin effektorfunktionen. Leukocytrekrytering är integrerad i en mängd olika inflammatoriska tillstånd såsom aterosklerotiska plack, hjärtinfarkt, ischemi / reperfusion och transplantationskirurgi 1, liksom flera CNS relaterade neuroinflammatoriska förhållanden 10-12,20,24,25. Med tanke på mångfalden av sjukdomstillstånd som leukocytrekrytering spännvidder, ger den autoperfused mikroflödeskammaren ett oumbärligt verktyg som gör utredaren möjlighet att studera leukocytmigrering dynamik. Under de senaste decennierna har en rad olika analyser in vitro utvecklats för att studera dynamiken i leukocyt celladhesion 26. Tyvärr, alla dessa analyser kräver extraktion avleukocyterna från blodet, införa mekanisk aktivering. För att komma närmare in vivo miljö, har anpassningar gjorts för att samla hela blodprov och kontrollera hemodynamiska flödesförhållandena 16,17. Här, vi utvidga de tidigare framsteg inom området genom att länka ett belagt kammare till musen cirkulationssystemet. Vi har möjlighet att reglera flödet av blodet till en fysiologiskt intervall och studera dynamiken i leukocytrullning. Den belagda kammare ger oss möjlighet att studera leukocyt interaktioner med specifika adhesionsmolekyler. Eftersom systemet fungerar som en enhet som drivs av en levande mus, det närmare efterliknar den naturliga miljön, vilket tillåter oss att studera leukocyt-endotel interaktioner i en mängd olika immunologiska musmodeller. Dessutom möjliggör detta system att vi kan dra nytta av de flera modeller genetiska mus tillgängliga. Även om systemet inte fullständigt replikera in vivo miljö, ger det en plattform för att studera specific delar av leukocyter under fysiologiska förhållanden, en bedrift som inte tidigare varit möjligt. Trots detta tar oss ett steg närmare en mer fysiologisk miljö finns det begränsningar i systemet. Det är inte helt replikera komplexa 3D matris av kärl så vi kan bara bedöma vissa delar av leukocyter interaktioner som är begränsade till kammaren beläggningen. Dessutom bör stor försiktighet vidtas för att säkerställa ett slutet system till musen cirkulationen genom att följa alla steg som nämns i protokollet. Införandet av luftbubblor kommer att kraftigt påverka noggrannheten och reproducerbarhet av försöken. Medan vi beskriver användningen av Autoperfused mikroflödeskammare för bedömning leukocytrullning dynamik förfarandet har potential att anpassas med utredare för att studera en mängd olika sjukdomar. Till exempel, cancerceller metastasera genom att uttrycka många av de gemensamma integriner delas av leukocyter. Studying deras rullande dynamiken i en inställning som närmare efterliknar en in vivo miljö kan hjälpa i vår kunskap, och möjligen förutsägelsen, den invasiva karaktären hos vissa cancerceller. En möjlig strategi skulle kunna vara att kombinera en märkningsteknik för cancercellerna, såsom GFP 27, tillsammans med flödet kammaren analysen att spåra rullande dynamik cancercellerna uttrycker GFP. Med tanke på den flexibilitet belägga kammaren med en mängd olika ämnen och ansluta flera kamrar till samma mus blir det intressant att se hur detta förfarande modifieras för användning i andra labb i kombination med genetiskt modifierade möss och sjukdomsmodeller. Tekniken vi beskriver här bara berör en mycket bredare tillämpning potential som bara begränsas av kreativitet utredaren.

Inflammation är kroppens universella svar på skada och är ett avgörande steg i både medfödda och adaptiva immunsystemets funktion. Som svar på skada och / eller inflammatoriska stimuli, endotelceller uppreglera specifika adhesionsmolekyler; detta leder till leukocyt extravasering genom mikrokärlendotel, främst i postkapillära venoler. Denna process startar med uppbindning av de fritt strömmande leukocyter i blodet på endotelet. Stabil rullning och fast vidhäftning av leukocyter, vilket i sin tur leder till själa och utsöndringen av cytotoxiska medel, följ denna tjudra 1,2. Selektiner är kända för att förmedla de tidiga stegen av kaskaden 3-5; integriner är ansvariga för de senare stegen i starka adhesion och migration 1,6-8. En växande mängd bevis tyder leukocyter och endotelceller adhesionsmolekyler har viktiga roller i djurmodeller av ischemireperfusionsskada, Astma, psoriasis, multipel skleros, och åldersrelaterad makuladegeneration 9-12. Under dessa förhållanden är det inflammatoriska svaret missriktade att attackera den egna kroppen, vilket resulterar i nedbrytning av frisk vävnad. Befintliga antiinflammatoriska medel (såsom icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, kortikosteroider eller andra kemoterapeutiska medel) bär risken för allvarliga biverkningar med långvarig användning 13. Därför är det av stort intresse att ha lämpliga verktyg med förmåga att identifiera sjukdomsspecifika molekyler, vilket i slutändan kan riktas för att ha önskad anti-inflammatorisk effekt samtidigt som den är giftfri 14. Befintliga in vitro-metoder såsom statiska leukocytadhesionen analysen användes så tidigt som 1976 15. Parallellflödeskammare användes först in vitro 1987 för att studera leukocyt-endotel interaktioner enligt flödesförhållanden. I dessa experiment stimulerade human polymorfonukleära leukocyter (PMNs) från venöst blod perfunderades över ett monoskikt av primära humana navelvenendotelceller (HUVEC). För att kontrollera för hemodynamiska flödesförhållanden, var Harvard Apparatus sprutpumpen sysselsatta 16. Alternativt, för att undvika artificiella leukocyter isolering ades helblod användes i kombination med glaskammare belagda med immobiliserade adhesionsmolekyler 17. För att undvika leukocyt stimulans och att mekanistiskt studera deras samspel med adhesionsmolekylerna enligt ungefärliga fysiologiska förhållanden, en ex vivo autoperfused, extrakorporal, var arteriovenös kretsen utvecklades 16. I denna krets flyter blodet mellan den högra gemensamma halsartären och vänstra yttre jugularvenen hos en levande mus under anestesi, möjliggör interaktion av nativa PBL inom en glasmikroflödeskammare belagd med enkla eller samimmobiliserad adhesionsmolekyler. En stor fördel med detta systemam är förmågan att använda genetiskt manipulerade möss, i vilka inflammatoriska vägar är direkt eller indirekt manipulerade. Dessutom finns möjligheten att sätta fingret på den isolerade bidraget av leukocyt adhesionsmolekyler till inflammation, fria från extern aktivering, enligt flödesförhållanden. Tillämpningen av en flödesregulator vid ingångspunkten för flödeskammaren tillhandahåller ett brett spektrum av experimentella variationer av skjuvkrafter för att efterlikna antingen arteriellt eller venöst system 18-22. Här beskriver vi i detalj ett protokoll om förberedelser och genomförande av ex vivo autoperfused mikroflödeskammare analys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Leukocyt-endotel interaktioner är tidiga och kritiska händelser i akut och kronisk inflammation och kan, när de oreglerad, förmedlar vävnadsskada som leder till permanenta patologiska skador. Befintliga konventionella analyser tillåter analys av leukocyt adhesionsmolekyler endast efter utvinning av leukocyter från blodet. Detta kräver blodet att genomgå flera steg innan perifert blod leukocyter (PBL) kan vara redo för analys, vilket i sin tur kan stimulera PBL påverkar forskningsresultaten. Den autoperfused mikroflödeskammare analys, dock kan forskare studera tidiga leukocyter funktionell dysregulation använder system flödet av en levande mus samtidigt ha frihet att manipulera en belagd kammare. Genom en sjukdomsmodell, kan den funktionella uttryck för leukocyt adhesionsmolekyler bedömas och kvantifieras på mikroglaskammare belagd med immobiliserade endotel adhesionsmolekyler ex vivo. I denna modell, flödar blodetmellan den högra gemensamma halsartären och vänstra yttre jugularvenen hos en levande mus under anestesi, tillåter interaktion av nativa PBL i kammaren. Realtids experimentell analys uppnås med hjälp av en intravital mikroskop samt en Harvard Apparatus tryckenhet. Tillämpningen av en flödesregulator vid ingångspunkten för glaskammare tillåter jämförbara fysiologiska flödesvillkoren mellan experimenten. Leukocytrullning hastighet är den viktigaste resultatet och mäts med National Institutes of Health öppet tillträde programvara ImageJ. Sammanfattningsvis ger autoperfused mikroflödeskammare analysen en optimal fysiologisk miljö att studera leukocyter endothelial interaktion och ger forskare möjlighet att dra korrekta slutsatser när man studerar inflammation.

<html> Under varje inspelning endast samverkande leukocyter är uppenbara på kammaren. Resultat från ett representativt experiment kan ses i figur 4. De vita pilarna pekar till individuella leukocyter som fångades av adhesionsmolekylen av intresse och är rullande längs kammaren bland andra friflytande ettor inom blodflödet. En gemensam artefakt utanför kammaren kan ses med de stora mörka sfärer i alla bilder. De mörka sfärer hjälpa läsaren att uppskatta leukocyt rörelse i förhållande till en fast punkt. Leukocyter avancemang under en period av 22 sek kan ses i relation till de sfärer. Grafen i samma figur visar en slutlig plot av uppgifterna där Tx1 minskar rullhastigheten (en förskjutning till vänster) och Tx2 ökar hastigheten (en förskjutning till höger) jämfört med kontrollen. 0 &quot;/&gt; Figur 1: Framställning av rör för flödeskammaren. (A) Verktyg som behövs för slangar och kammarenhet (mikroglaskammaren 0,4 x 0,04 x 50 mm, polyetenrör PE10, polyetenrör PE60, kisel slang 002, Y tube, T rör, 35 mm petriskål, fin pincett, fina saxar, rörhållare, vaskulär klämma, 7-0 silkessutur. (B) Framställning av karotidartären och jugularvenen slangar för omledning musen blodflödet genom den belagda kammaren. (C) Anslut karotidartären slangen till tryckgivaren. (D) Pass slangen från givaren genom klämman att justera graden av blodflödet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Figur 2:. Exponera halspulsådern och halsvenen (A) Skär försiktigt nacken att exponera luftstrupen (B) Rengör högra halspulsådern så att en bit av sutur kan föras under fartyget (prickade gult. linje skisserar karotidartären). (C) Rengör vänstra jugularvenen, så att en bit av sutur kan passeras under kärlet (streckad gul linje skisserar halsvenen). (D) Ordna löst knutna suturer vid de övre och nedre områdena av halspulsådern och halsvenen (pilar indikerade de övre och nedre regionerna av fartygen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Figur 3: Anslutning av slangen till than halspulsådern och halsvenen. (A) Dra åt övre knut på halspulsådern och placera klämman under den nedre knuten. (B) Med hjälp av microscissors, gör ett litet snitt i hals, ca 1/8 omkretsen (prickade gul cirkel indikerar snittet). ( C) För in slangen i halspulsådern och säkra med minst två suturer (grön streckad linje visar slangen och den gula streckade linjen halspulsådern). (D) På samma sätt in slangen i halsvenen (grön streckad linje visar slangen och gula streckade linjen halsvenen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Figur 4: Representant tidsförloppet för leukocyter rullande genom flödes chamBER (Skalstreck = 100 | im) (vita pilspetsar påpeka rullande leukocyter). Diagrammet visar representativa resultat efter export in i en grafer program (Tx1 och Tx2 är experimentella behandlingsgrupper och CTR är kontrollgruppen). Tx1 representerar en behandling, vid vilken leukocyter bromsa leder till en minskning i leukocyter rullhastigheten och en vänsterförskjutning av grafen i jämförelse med den obehandlade gruppen (CTR), medan Tx2 leder till en högerskiftning återspeglar en ökning av leukocyter rullhastigheten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay (Video) | JoVE

Här presenterar vi ett protokoll som gör utredaren att bedöma leukocytrekrytering dynamik ex vivo genom att ansluta en kammare belagd med endotel-derived adhesionsmolekyler till cirkulationssystemet av en mus. Denna metod ger betydande fördelar, eftersom den möjliggör leukocyt bedömning enligt relativa biologiska förhållanden.

Bedöma leukocytbindande endotel interaktioner Under flödesförhållandena i ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused mikroflödes Chamber analys

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress (Video) | JoVE

Parallell-platta Flow avdelningen och kontinuerligt Circuit att utvärdera Endothelial stamceller i laminärt flöde Shear stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model (Video) | JoVE

Fastställande av transport Andel Xenobiotika och nanomaterial igenom moderkakan med<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusionen Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions (Video) | JoVE

A Novel Tredimensionell strömningskammare Device att studera Chemokine-riktad Extravasering av celler som cirkulerar under fysiologiska flödesförhållanden

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber (Video) | JoVE

Tissue Engineering av Intrinsic Vascularization i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Engineering avdelningen

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat (Video) | JoVE

En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry (Video) | JoVE

En automatiserad metod för att utföra Mikrokärnanalys in vitro med hjälp av Multispektral avbildning flödescytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy (Video) | JoVE

Karaktäriserande konformationsförändringar med en molekyl under skjuvningsflöde med fluorescensmikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions (Video) | JoVE

Guidad differentiering av mogna njurpodocyter från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller under kemiskt definierade förhållanden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow (Video) | JoVE

In Vitro 3D-cellkulturerade arteriella modeller för studier av vaskulär läkemedelsinriktning under flöde

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation (Video) | JoVE

Ett mikrofysiologiskt system för att studera leukocyt-endotelcellinteraktion under inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...