Name: assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) ve P30EY014104: Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numaraları altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü tarafından desteklendi. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Ek destek Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu (KMC) ve (KMC için) önleyin Körlük için Research Özel Scholar Ödülü tarafından sağlanmıştır.

Hayvanlar üzerinde deneyler tüm Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği uyarınca ele alındı ​​ve kurallar ve yönetmelikler Massachusetts Eye and Ear Revir Hayvan Bakım Komitesi tarafından belirlenen. deneyden önce gün: Akış Odası için Boru 1. Hazırlık <ol><li> Boyun yan hazırlamak için, 5 cm polietilen boru ardından 6 cm silikon tüp 1 cm PI10 polietilen boru bağlayın. Karotid tarafı için, yaklaşık 1.5 cm uzakta 1 cm polietilen boru ile 6 cm arasında, silikon boru içinde, bir T-boru ilavesi ile boyun tarafına Benzer hazırlanması (Şekil 1A, B). T-tüp yerleştirmek için, gerekirse ince forseps kullanarak silikon tüp genişletmek. </li><li> Basınç dönüştürücü silikon tüp 10 cm bir ucunu sonra karotis s T ucunudiğer ucunu ide T-tüp. Siteler sıkı bağlantı sağlamak ve ücretsiz kaçak. Gerekirse boru, birlikte neresinde üzerinde parafilm küçük bir dikdörtgen parça uygulayın, kaçak (Şekil 1C) önlemek için. </li></ol> 2. Odası Kaplama <ol><li> Endotel yüzey kaplama proteini hazırlanması (yani, P selektin, hücreler arası yapışma molekülü-1 (ICAM-1), vasküler hücre yapışma proteini-1 (VCAM-1)),% 0.1 BSA içinde. Yol gösterici olarak, protein 1 mg, 200 ul BSA 4-5 odalar kaplamak için yeterlidir. Endotel yüzey kaplama proteini ile her bir bölme (0.04 x 0.4 x 50 mm) enjekte bir 25 G iğne bağlı 1 ml&#39;lik şırınga kullanarak. Gece boyunca 4 ° C de, 15 ml bir tüp içinde kaplanmış bölmeleri saklayın. </li></ol> Deney günü: 3. Odası Hazırlama <ol><li> 4 ° C kaplı odaları çıkarın ve her tarafa boyun ve karotid boru bağlayın. Bağlant Sealdikkatle boru odasını buluştuğu üzerinde parafilm küçük bir dikdörtgen parça gererek ons. Bir şırınga kullanarak,% 0.1 BSA (sızıntı olup olmadığını kontrol edin) ile odasını ve tüp doldurun. 45 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Çanak her iki tarafındaki çentik açılarak bölmeyi tutmak için bir 35 mm Petri kabı hazırlanır. Çentikler odacığı stabilize; Daha sonra çentikli yerinde çanak odasına tutturmak için silikon küçük bir damla kullanın. Kamara mikroskop altında bakarak düzeyi olduğundan emin olun. Silikon en az 15 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Heparin ile 60 ml&#39;lik kilitleme şırınga doldurun ve basınç dönüştürücü bağlanın. Transducer, silikon tüp, ve T-tüp: karotid aşağıdaki sırayla boruya basınç sensörü bağlayın. <ol><li> Dönüştürücü ve bağlantıyı sabitlemek T-tüp bağlı silikon tüp arasında 1 cm PE50 kullanın. Basınçlı bilezikte (Şekil 1D) ile karotid arter silikon boru geçirin. 100USP heparin uçtan bir uca koşöf hava kabarcığı boru ve bölme vardır kadar. </li></ol></li></ol> 4. Yazılım kurma <ol><li> Yazılımı hazırlamak için, bilgisayar, mikroskop, ve açık laboratuar aygıtı açın. Çift Leica uygulama paketi (LAS) (veya eşdeğeri) üzerine tıklayın ve video kaydetmek için bir klasör hazırlamak: göz → edinmekte → Film → kliplerinin dizisi tanımlamak (klipleri = 15, kayıt süresi = 30 sn ve aralıkları = 15 sn) sonra onaylamak için &quot;+&quot; işaretine tıklayın. </li><li> Akış basıncı yukarıda adım 4.1 kayıt klasörüne dosya adını LabChart (veya eşdeğeri) dosyasını açmak ve koordinat kaydetmek için. </li></ol> 5. Cerrahi Prosedür <ol><li> Ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin (6 mg / kg) bir kombinasyonu kullanılarak 8-10 haftalık fare anestezisi intraperitoneal (İP) enjekte edildi. Derin sedasyon pedalı geri çekme refleksi kaybı ile 5-10 dakika içinde ulaşılır doğrulayın. Gerekli izofluran isegerektiği gibi yüz maskesi yoluyla teslim verilebilir. </li><li> Anestezi altında iken, kafesin altındaki bir ısıtma pedi yerleştirmek ve vücut ısısını korumak için 37 ° C olarak ayarlanır. Uygun anestezi onaylandıktan sonra, göz kuruluğu önlemek için bacitracin merhem ile ventral pozisyonda ve kat gözleri fare koyun. </li><li> Bundan sonra, bir jilet kullanarak insizyon yerinde saç tıraş ve iyice alkol ile siteyi temizleyin. </li><li> Tam anestezi kez bant ventral pozisyonda fareyi tutarak hayvan sabitleyin. Makasla boyun alanı Açığa ve trakea ve gemiler (Şekil 2A) maruz tiroid bezi çıkarın. </li><li> Tam vagus siniri (Şekil 2B) zarar vermemeye dikkat ederek ortaya çıkıncaya kadar karotid arteri temizleyin. Sütür bir parça katlayın ve sonra karotis altında sütür 2 adet şimdi yani viraj kesilmiş karotid arter altında viraj geçmek. Döngü knot içine her sütür (sıkmayınknot). </li><li> Aynı şekilde (Şekil 2B) sütür hazırlamak, sol juguler ven (Şekil 2C) maruz aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Fare damar boru bağlayın. <ol><li> Heparin IP 1 ml enjekte edilerek fare Heparinize. </li><li> Karotis arter üst dikiş sıkın. Karotis arter (Şekil 3A) gitmek ahlaka damar kelepçesini yerleştirin. Microscissors (Şekil 3B) kullanarak, küçük bir kesi, arter çevresi yaklaşık 1/8 üst dikişle arteri tutun ve yapmak için forseps kullanın. </li><li> Üst dikiş ve arterde yapılan kesi içine ikinci düğüm ile karotis arter boru geçirin. Arter (Şekil 3C birkaç knot sıkı bir mühür sağlamak için yapılmalıdır) boru etrafına sızdırmaz şekilde alt dikiş kapalı kravat. </li><li> (Şah damarı tüp sokulması için gemi aynı işlemi tekrarlayınKelepçe boyun tarafı için gerekli değildir, Şekil 3B). </li><li> Damar kelepçesini bırakarak akışını sınayın. Hiçbir sızıntı yoksa mikroskop fareyi ve oda tüp (cerrahi işlemin gösteri için ekli video) karotis boru ve şah damarını bağlamak. </li></ol></li></ol> 6. Kayıt Rolling Hız <ol><li> Fare dolaşım sistemi ile bir devre yaparak, odasını doldurmak için karotis kelepçesini açın. Akış koşulları stabilize böylece kan 3-5 dakika dolaşmaya izin verin. Odacık mikroskop amacı ile bir ucundan diğerine düzeyi ve kenar ekranındaki video kayıt penceresi ile paralel olacak şekilde 3-5 dakika bekliyor döneminde, mikroskop sahne ayarlayın. </li><li> Odasından akan hücreler görülebilir böylece daha sonra yemeğin içine 10X suya daldırma hedefi düşük su ile cam haznesi içeren modifiye Petri kabı doldurun.ışık yoğunluğu hücrelerinin yeterli görüntüleme için ayarlanması gerekebilir. Genel olarak daha düşük bir yoğunluk daha iyidir. </li><li> Transdüser orta fizyolojik akış basıncı ilişkilendirerek, sürekli bir 30 mm Hg okur ya da arzu edilen boru kelepçeyi ayarlayın. </li><li> Basın video ve juguler ucuna yakın ve tamamlanana kadar karotis sonuna doğru akışına karşı hareket ilk kez sukut ile basınç hem de kayıt başlatmak için &quot;start&quot;. Not: Farklı yapışma molekülleri ile çeşitli kaplama koşullarının çok bölme ile aynı fare incelenebilir. Sadece bir bölme, bir zaman kaydedilmektedir. <ol><li> Kayıt tamamlandığında, kan akışını durdurarak, giriş yerinde vanasını kapatın. Odasına çıkarın ve diğer yandan bir yandan ince forseps ve yivli forseps kullanarak devre (farklı yapışma molekülü ile kaplı) yeni bir odasını uygun. Adımlarda belirtildiği gibi yeni odası için kayıt Özgeçmiş6,1-6,4. </li></ol></li><li> CO deney sonunda bir omurilik dislokasyon 2 boğulmaya tüm fareler öldürülür. Böylece işlem fareler deney sonunda bir omurilik çıkık terminal ötenazi edilir. </li></ol> 7. Sonuçları yorumlama <ol><li> Kaydedilen veriler ImageJ yazılım 23 &quot;M TrackJ&quot; eklenti kullanmak analiz etmek. </li><li> Dosya seç → ithalat → AVI → gri tonlama dönüştürmek tarafından gri tonlama dosyayı dönüştürün. </li><li> Küresel → çerçeve aralıkları (i) girin mülkiyet → → → seçeneğini görüntü ile kareleri standart hale. (Resim J video penceresinin üst köşesinde gösterilir) bir video kare sayısına göre toplam video süresi (genellikle 30 sn) bölünmesiyle çerçeve aralıklarını hesaplayın. </li><li> M TrackJ → bir lökosit seçin parçaları ekleyin → → Seç eklenti tarafından her lökosit akışını ölçmek→ 15 her çerçeve ile Takip - 20 sn → Merge. </li><li> Görünümünde tüm lökositler için yineleyin 7.4. </li><li> İki sütun Kopyala → M TrakJ tüm görünür → Seç tedbir lökositlerin ortalama haddeleme hızı belirleyin: Bir elektronik tabloya izler. &quot;V demek&quot; etiketli sütun piksel / saniye olarak ölçülen lökosit haddeleme olduğunu. 2/3 bölerek mikron / sn dönüştürmek. </li><li> Bir elektronik tabloya basınç veri vurgulamak ve ihracat analiz ve aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek için: Ap (mm Hg) ve t (din / cm 2) Her bir deney grubu arasında bir karşılaştırma için. Hesaplanan kez, grafik için prizma yazılımına veri kopyalama. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

lökosit işe süreci inflamatuvar yanıt çok önemli bir adımdır; Bu onların efektör işlevini yerine getirmesini mümkün hedef dokulara doğru dolaşım sistemi için lökositlerin migrasyonunu içerir. Lökositin görevlendirilmesi, aterosklerotik istilanın, miyokardiyal enfarktüs, iskemi / reperfüzyon ve transplant ameliyatını 1, hem de birden çok merkezi sinir sistemi ile ilgili nöro-enflamatuar durumların 10-12,20,24,25 gibi inflamatuar olaylardaki çeşitli ayrılmaz bir parçasıdır. Lökosit işe açıklıklı, autoperfused Mikrosirkülasyon odası araştırmacı lökosit göç dinamiklerini incelemek için yeteneği sağlayan vazgeçilmez bir aracı sağlar hastalık koşulları çeşitliliğini göz önüne alındığında. Son birkaç on yıl boyunca, in vitro tahlillerin çeşitli lökosit hücre yapışmasının 26 dinamikleri üzerinde çalışmak üzere geliştirilmiştir. Ne yazık ki, bu tahlillerin tümüne çıkarılmasını gerektirirkandan lökositler, mekanik aktivasyon tanıtan. In vivo ortamda yakın olsun, uyarlamalar tam kan örnekleri toplamak ve hemodinamik akış koşulları 16,17 kontrol yapılmıştır. Burada, biz fare dolaşım sistemine kaplanmış odayı bağlayarak alanında önceki avans. Biz bir fizyolojik aralık kan akışını düzenleyen ve lökosit haddeleme dinamiklerini incelemek mümkün. kaplanmış odası bize belirli yapışma molekülleri ile lökosit etkileşimleri çalışmak için yeteneği verir. Sistem, canlı fare tarafından işletilen bir birim olarak görev olduğu için, daha yakından bize immünolojik fare modellerinde çeşitli lökosit-endoteliyal etkileşimler üzerinde çalışmak için izin doğal çevreye taklit eder. Ayrıca, bu sistem bize mevcut çoklu genetik fare modellerinin yararlanmak için izin verir. Sistem tamamen in vivo ortamda çoğaltma değil iken, specifi incelemek için bir platform sağlarfizyolojik koşullar altında lökositlerin c elemanları, daha önce mümkün olmayan bir başarı. Bu bir adım daha yakın, daha fizyolojik bir ortamda bizi alır olsa sisteme sınırlamalar vardır. Biz odası kaplama sınırlıdır lökosit etkileşimlerinin bazı unsurları değerlendirmek için sadece edebiliyoruz, böylece tamamen damar karmaşık 3D matrisi çoğaltma değil. Buna ek olarak, büyük bir dikkatle protokolde belirtilen tüm adımları fare dolaşımı için bir kapalı sistem sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Hava kabarcıklarının giriş ölçüde deney doğruluğunu ve tekrarlanabilirlik etkileyecektir. Biz lökosit haddeleme dinamikleri değerlendirmek için Autoperfused Microflow odanın kullanımını tarif ederken prosedür çeşitli hastalıkları çalışma araştırmacılar tarafından kişiselleştirilmiş bir potansiyele sahiptir. Örneğin, kanser hücreleri, lökositler tarafından paylaşılan ortak integrinler çok ifade metastaza. Studying daha yakından bilgi yardımcı olabilecek bir in vivo ortamı taklit eden bir ortamda, ve bazı kanser hücrelerinin invaziv doğası muhtemelen tahmin, onların haddeleme dinamiği. Olası metotlardan biri, GFP ifade eden kanser hücrelerinin haddeleme dinamikleri parça akış odası deneyi ile birlikte böyle bir GFP 27 kanser hücreleri için bir etiketleme tekniği birleştirmek olabilir. Bu prosedür, genetiği değiştirilmiş fareler ve hastalık modelleri ile birlikte diğer laboratuarlarda kullanılmak üzere modifiye nasıl görmek ilginç olacak maddelerin çeşitli odasına kaplanması ve aynı fare birden odaları bağlayan esnekliği göz önüne alındığında. Biz burada açıklamak tekniği sadece sadece araştırmacı yaratıcılığı ile sınırlıdır çok daha geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.

Enflamasyon yaralanma vücudun evrensel bir yanıttır ve hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi fonksiyonu çok önemli bir adımdır. Yaralanma ve / veya iltihap uyarıcıya tepki olarak endotelial hücreler, belirli bir yapışma moleküllerini arttırdığı; Bu öncelikle sonrası kılcal venüllerdeki, mikrovasküler endotel ile ekstravazasyon lökosit yol açar. Bu süreç endotel üzerindeki kan dolaşımında serbest akan lökositlerin tethering ile başlar. Kararlı haddeleme ve sırayla tenasühe ve sitotoksik ajanların salgılanmasına yol açar lökositlerin, firma yapışma, bu 1,2 tethering izleyin. Selektinler kademeli 3-5 erken aşamaları neden olduğu bilinmektedir; integrinlerinin firması yapışması ve göçü 1,6-8 sonraki adımlar için sorumludur. Kanıt artan vücut iskemi reperfüzyon hasarı hayvan modellerinde lökosit ve endotel adezyon molekülleri sahip hayati rolleri önerir, Astım, psöryazi, multipl skleroz, ve yaşla ilişkili maküler dejenerasyon 9-12. Bu koşullar altında, inflamatuvar yanıt sağlıklı doku yıkımında ortaya çıkan, kişinin kendi bedenini saldırmaya yanlış yönlendirilmiş olduğunu. (Örneğin, non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar, kortikosteroidler ya da diğer kemoterapötik maddeler olarak) mevcut anti-enflamatuar maddeler, uzun süreli kullanım 13 ile ciddi yan etki riskini taşırlar. Bu nedenle, bu toksik olmayan 14 kalarak sonuçta istenen anti-inflamatuar etkiye sahip hedeflenebilir hastalığa özgü molekülleri tespit yeteneği, uygun araçlara sahip büyük ilgi olduğunu. Statik lökosit yapışma deneyi olarak in vitro yöntemler mevcut erken 1976 15 olarak kullanıldı. Paralel akış bölmesi, birinci akış şartları altında, lökosit-endotel etkileşimlerini incelemek için 1987, in vitro olarak kullanılmıştır. Bu deneylerde, Huma uyarılmışn, toplardamar kanından polimorfonükleer lökositler (PMNler), primer insan göbek damar endotelial hücrelerinde (HUVECler) bir tek tabaka içinde perfüze edildi. Hemodinamik akış koşulları kontrol etmek için, Harvard Apparatus şırınga pompası 16 kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yapay lökosit izolasyonu önlemek için, tam kan, immobilize edilmiş yapışma moleküllerinin 17 ile kaplanmış cam bölme ile bir arada kullanılmıştır. Lökosit stimülasyonu önlemek ve mekanistik yaklaşık fizyolojik koşullar altında yapışma molekülleri ile etkileşimi incelemek için, bir ex vivo autoperfused, ekstrakorporel, arteriyovenöz devre 16 geliştirilmiştir. Bu devrede, kan tek ya da birlikte immobilize yapışma molekülleri ile kaplanmış bir cam Mikrosirkülasyon bölme içinde doğal BBL&#39;lerin etkileşimi sağlayan, anestezi altında canlı bir farenin sağ ortak karotid arter ve sol dış boyun toplardamarı arasına akar. Bu Sistemli için önemli bir avantajm, enflamatuar yollar doğrudan ya da dolaylı olarak manipüle edildiği genetik olarak fareler kullanmak yeteneğidir. Ayrıca, akış koşulları altında, dış aktivasyon serbest inflamasyon lökosit adezyon molekülleri, izole katkı saptamak için yeteneği var. Akış odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama arteriyel veya venöz sistemleri 18-22 ya taklit etmek kesme kuvvetlerinin deneysel varyasyonları geniş bir yelpazede sunmaktadır. Burada detaylı olarak ex vivo autoperfused Mikrosirkülasyon odası testinin hazırlanması ve performansı ile ilgili bir protokol açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Lökosit-Endotelyal etkileşimler, akut ve kronik iltihap erken ve kritik olaylar ve bozulmuş zaman, daimi patolojik hasarına yol açan doku hasarı aracılık edebilir. Mevcut konvansiyonel testler sadece kan lökosit çıkarma sonra lökosit adezyon moleküllerinin analiz izin. Bu periferik kan lökosit (PBL&#39;ler) da araştırma bulgularını etkileyen PBLs teşvik, hangi analiz için hazır olabilir önce birkaç adım geçmesi kan gerektirir. autoperfused mikro akış odası deneyi, ancak, bilim adamları bir kaplanmış odasını manipüle özgürlüğü yerken canlı fare sistemik akışını kullanarak fonksiyonel düzensizliği erken lökosit çalışma sağlar. Bir hastalık modeli sayesinde, lökosit adezyon moleküllerinin fonksiyonel ifadesi değerlendirilebilir ve immobilize endotel adezyon molekülleri ex vivo ile kaplanmış bir mikro-cam odasında sayısal. Bu modelde, kan akarodasında yerli BBL&#39;lerin etkileşimini sağlayan sağ karotis arter ve anestezi altında canlı farenin sol eksternal juguler ven arasında. Gerçek zamanlı deneysel analiz intravital mikroskop yardımı olarak bir Harvard Apparatus basınç aracı ile birlikte sağlanır. Cam odasının giriş noktasında bir akış regülatörü uygulama deneyleri arasında karşılaştırılabilir fizyolojik akış koşulları izin verir. Lökosit haddeleme hızı, ana sonuçtur ve Sağlık açık erişim yazılımı ImageJ Ulusal Enstitüleri ile ölçülür. Özetle, autoperfused mikro akış odası tahlil Lökositler endotel etkileşimi incelemek için optimal fizyolojik bir ortam sağlar ve inflamasyonu okuyan zaman araştırmacılar doğru sonuçlara varmak için izin verir.

<html> Her kayıt, sadece etkileşim lökositler sırasında odasının üzerine belirgindir. Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar, Şekil 4&#39;te görülebilir. Beyaz oklar ilgi yapışma molekülü tarafından yakalanan ve kan akışı içerisinde diğer akıcı olanlar arasında bölme boyunca yuvarlanan bireysel lökositlerin işaret etmektedir. Odasının dışında ortak bir eserdir tüm görüntüleri büyük karanlık alanlarda görülebilir. Karanlık küre okuyucu sabit bir noktaya göre lökosit hareketini takdir yardımcı. 22 saniyelik bir süre boyunca lökositler ilerleme küreler ile ilgili olarak görülebilir. Aynı şekilde grafik Tx1 haddeleme hızı (solda bir vardiya) azalır ve Tx2 kontrole göre hızı (sağa kaydırma) artar verilerin son grafiğini göstermektedir. 0 &quot;/&gt; Şekil 1: akış bölmesi için boru hazırlanması. (A) Araçlar silikon 002, Y tüpü, T tüp, 35 mm Petri, ince forseps, ince makas tüp, boru ve hazne montajı (mikro cam haznesi 0,4 x 0.04 x 50 mm, polietilen boru PI10, polietilen boru PE60 için gerekli, tüp tutucu, vasküler kelepçe, 7-0 ipek dikiş. kaplı bölmesi boyunca fare kan akışını yeniden yönlendirmek için karotis arteri ve jugular damar boru (B) hazırlanışı. (C) basınç transdüktörüne karotid arter boru bağlama. (D) kan akış hızını ayarlamak için kelepçenin içinden transdüktörden boru geçirin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> Şekil 2:.. karotid arter ve juguler ven maruz (A) dikkatlice sarı noktalı ((B) trakea maruz boyun alanını kesip dikiş bir parça geminin altında geçti böylece sağ karotis arter temizleyin hat) karotis arter özetliyor. sütür bir parça (noktalı sarı hat juguler ven özetliyor) geminin altında geçti böylece (C) sol juguler ven temizleyin. (D) gevşek üst ve alt bölgelerinde dikişlerle bağlı Yerleştir karotis arter ve juguler ven (oklar gemilerin üst ve alt bölgeleri belirtilen) olarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> Şekil 3: tüp bağlanması tO arter ve juguler ven karotid. (A) karotis üst düğüm sıkın ve alt düğüm altında kelepçeyi yerleştirin. (B) Microscissors kullanarak, karotis küçük bir kesi yapmak, yaklaşık 1/8 çevresi (noktalı sarı daire kesi gösterir). ( C) karotis içine tüp yerleştirin ve en az iki sütür (yeşil noktalı çizgi boru ve sarı noktalı çizgi karotis arter gösterir) ile sabitleyin. (D) Benzer yeşil noktalı çizgi boru ve gösterir (juguler hortumu takın sarı noktalı çizgi juguler ven). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> Şekil 4: akış cham aracılığıyla haddeleme lökositlerin Temsilcisi zaman dersber (Ölçek çubuğu = 100 mikron) (beyaz ok başları haddeleme lökositler işaret). Grafik bir grafik programına ihraç sonrası temsili sonuçlar göstermektedir (Tx1 ve Tx2 deneysel tedavi grupları ve TO kontrol grubu). Tx2 hız haddeleme lökositlerde artış yansıtan doğru kaymasına neden olurken Tx1 hızı ve tedavi edilmeyen gruba (TO) kıyasla grafik bir sol kaymasını haddeleme lökositlerin bir azalmaya yol açan yavaş lökositleri olan bir işlemi göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Sıçan Vivo içinde kısmi karaciğer Dairesi'nde için bir temel olarak yeni bir cerrahi teknik

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...