Name: fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo at JoVE.com

We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the &#8220;priority programmes&#8221; SPP1316 and SPP1617.

1. عالية الإنتاجية التحضير RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي وهناك حاجة إلى تركيزات عالية من الحمض النووي الريبي مجموع للتفاعل تمديد التمهيدي: ملاحظة. مجموعات عمود الدوران عادة لا تسفر عن كمية من الحمض النووي الريبي الحا?...

<ol>
	<li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+extension+assay.">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li><li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension:+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension.">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li><li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum.">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li><li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems.">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li><li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea.">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li><li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate.">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li><li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems.">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li><li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+interferases,+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems.">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li><li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+MazF-bs+(EndoA)+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase.">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence,+UACAU,+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP.">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA+interferases,+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA.">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li><li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+MazFSa,+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus.">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li><li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms.">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li><li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ompA+5'+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency.">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li><li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli.">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li><li>Schleifer, K. H., Kilpper-B&#228;lz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.,+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.:+Three+New+Coagulase-Negative,+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals.">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .</li><li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates.">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li><li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA.">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li></ol>

تمديد التمهيدي الفلورسنت هو طريقة بسيطة وسريعة لتحديد الغايات 5 &#39;من الرنا، إما لTSP- أو تحديد معالجة RNA الثانوي. بسبب استخدام بادئات الفلورسنت، ويمكن ضبط ردود الفعل صعودا وتشغيل دون احتياطات أمنية إضافية (على عكس في حالة الاشعال المسمى بالإشعاع). كما تم الكشف عن عينات...

تمديد التمهيدي 1 هي طريقة الجزيئية لتحديد الغايات 5 &#39;من جزيئات RNA محددة تصل إلى قرار قاعدة واحدة. ميزة لأساليب أخرى مثل 5&#39;-RACE (التضخيم السريع ل[كدنا ينتهي) هي الفترة الزمنية السريعة والقدرة على تحليل بسهولة مزيج من أطوال مختلفة من جزيئات الحمض النووي الريبي. يعمل هذا الأسلوب بإخضاع جزيئات الحمض النووي الريبي لعكس ردود الفعل النسخ باستخدام بادئات محددة الفلورسنت، وتوليد شظايا [كدنا بعض الأطوال. وتدار هذه الجزيئات [كدنا] جنبا إلى جنب مع سانجر تسلسل ردود الفعل التقليدية 2 على تغيير طبيعة المواد الهلامية بولي أكريلاميد ويمكن الكشف عنها بواسطة مضان من جراء استخدام بادئات fluorescently المسمى. ثم يتم تقييم أطوال شظايا [كدنا] من خلال المقارنة لسلم التسلسل، والسماح للرسم الخرائط من &#39;بنتيجة 5 RNA. تقليديا، يتم استخدام ردود الفعل تمديد التمهيدي بالاشتراكمع النظائر المشعة للكشف عن جزيئات [كدنا على أفلام الأشعة السينية. بسبب المخاطر الصحية، وقضايا التخلص من النفايات وسهولة التعامل معها والبروتوكولات تستخدم أحدث مضان للكشف عن تمديد التمهيدي مع التعاقب الآلي، وإن كان حساسيتها أقل قليلا. باستخدام بادئات fluorescently المسمى، ويمكن حذف تكرار الإجراء الإذاعة وضع العلامات، والاشعال الفلورسنت مستقرة لفترة طويلة (أكثر من سنة في أيدينا). طريقة وصفنا هنا يستخدم هلام المنظم الآلي، ولكن مع تعديلات طفيفة، التعاقب الشعرية يمكن أن تستخدم أيضا لفصل [كدنا] والكشف عن 3. طبيعة موازية لتحليل هلام تجعل من الممكن للكشف حتى كمية صغيرة من الانقسام RNA أو المعالجة. ميزة أخرى هي عالية الدقة لهذه الطريقة، والانقسام الطرفي أو تجهيز قاعدة واحدة حتى يمكن الكشف عنها. في ما يتعلق بالكشف عن انشقاق RNA أو المعالجة، رypically نوعين مختلفين من ملحقات التمهيدي متميزة. في حالة واحدة، ويتم علاج الأنزيمية في المختبر باستخدام انزيم RNA المنقى والمنقى، بينما في الحالة الأخرى، ويتم تجهيز في الجسم الحي ويتم تنقيته من RNA الناتجة عن ذلك. في كلتا الحالتين تتعرض RNA لتنفيذ تمديد التمهيدي في المختبر، ومع ذلك، اعتمادا على مصدر من الحمض النووي الريبي، وطريقة إما يسمى في المختبر أو في الجسم الحي تمديد التمهيدي. في بروتوكول نقدم هنا، ونحن نركز فقط على المجراة التمهيدي التمديد، بسبب سهولة الاستخدام (لا يوجد تنقية البروتينات الضرورية) وإمكانية تحديد نقاط انطلاق النسخي والمعالجة في نفس الوقت. ومع ذلك، في المختبر ملحقات التمهيدي من حيث المبدأ اقامة بنفس الطريقة وهذا البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة نقطة الانطلاق. طريقة موضح هنا يمكن تطبيقها على العديد من الأنواع البكتيرية طالما أنها قابلة للارتفاعالنقاء وعالية الغلة إعداد الأحماض النووية. البحث في مختبرنا يركز على نطاق تنظيمي نظم السامة الترياق (TA-) 4،5، وهو الحقل الذي يتم استخدام طريقة تمديد التمهيدي على نطاق واسع. TA-النظم هي عناصر جينية صغيرة موجودة في الجينوم بدائية النواة التي تتكون من البروتين السام مستقر ونشط التطور الطبيعي ومعظمها غير مستقر البروتين أو RNA الترياق الذي يصد سمية 6،7. النشاط السم يمارس أحيانا عن طريق تثبيط تكرار، تركيب جدار الخلية أو آليات أخرى، لكن في معظم الأحيان حسب النشاط ريبونوكلياز 8،9. عادة، يتم تحديد ريبونوكلياز خصوصية عن طريق إجراء اختبارات مختلفة، واحدة منها هي طريقة تمديد التمهيدي. ردود الفعل تمديد التمهيدي هي مناسبة تماما لهذا التطبيق، وخليط من شظايا طول المشقوق وكاملة يمكن تحليلها في وقت واحد لتحديد من 5 &#39;تنتهي. باستخدام مزيج من في المختبر وفي الجسم الحي ملحقات التمهيدي، والسم محدد ريبونوكلياز الانقسام، على سبيل المثال، خصوصية التسلسل يمكن تحديد 10-13. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. نظرة عامة على إجراء تمديد التمهيدي. يتم تحضين الثقافات البكتيرية وعلاجها وفقا لاحتياجات التجريبية. يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا، وتعامل مع الدناز أنا لإزالة آثار الحمض النووي وتعرض لردة فعل عكس النسخ باستخدام بادئات محددة الهدف الحمض النووي الفلورسنت ذات العوائد [كدنا]. يتم استخراج الحمض النووي الجيني أو البلازميدات وتستخدم بعد ذلك لالفلورسنت ردود الفعل سانجر تسلسل للمقارنة مع حجم شظايا [كدنا]. تدار المنتجات تمديد التمهيدي إلى جانب المنتجات التسلسل سانجر على تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد اليوريا وتحليلها مع الليزر الآلي والمجهر. قاعدة التسلسل الذي يصطف مع الفرقة [كدنا] هي لاالحادي قاعدة 5 &quot;نهاية [كدنا] (السهم الأزرق). مزيد من المعلومات في Fekete، وآخرون. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> لمحة عامة عن الإجراء بأكمله تمديد التمهيدي يمكن العثور عليها في الشكل 1. باختصار، الخلايا البكتيرية هي مثقف، تحصد، بيليه الخلايا هي lysed والحمض النووي الريبي المستخرج. ثم يتم التعامل مع RNA المنقى مع الدناز أنا لإزالة آثار لجزيئات الحمض النووي التي يمكن أن تكون بمثابة نماذج للالناسخ العكسي. تضاف الاشعال الفلورسنت محددة إلى RNA، المهجنة إلى المنطقة في وقت لاحق من الاهتمام وعكس كتب، مما أدى إلى واحد DNA مكملة الذين تقطعت بهم السبل ([كدنا]). يتم إنشاء سلم التسلسل بواسطة التسلسل التقليدي سانجر استخدام بادئات الفلورسنت وفصلها على تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد جانب من شظايا تمديد التمهيدي [كدنا]. الناتجويتم تحليل هلام بمقارنة العصابات الفلورسنت، مما يسمح بتحديد الغايات 5 &#39;من الفائدة. نقطة الانطلاق النسخي ومواقع المعالجة ثم يتم تقييمها بشكل فردي عن طريق مقارنات تسلسل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1200">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;"><a name="RANGE!A1:D16">Name</a></td>
			<td style="width:196px;">Supplier</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number(s)</td>
			<td style="width:363px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:196px;">NEB / Roche</td>
			<td style="width:244px;">NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:399px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2222</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">FastPrep-24 Instrument&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MPBio</td>
			<td align="right">116004500</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:399px;">Fluorescently labeled primers</td>
			<td style="width:196px;">Biomers</td>
			<td style="width:244px;">n/a</td>
			<td style="width:363px;">5&#8217; DY-681 modification of &#8220;ordinary&#8221; DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software</td>
			<td style="width:196px;">Li-Cor</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:363px;">Product discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM9915G</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Plasmid mini preparation kit</td>
			<td style="width:196px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RapidGel-XL-40% Concentrate</td>
			<td style="width:196px;">USB</td>
			<td style="width:244px;">US75863</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RNA STORAGE BUFFER</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td>AM7000</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Roti-Aqua-P/C/I</td>
			<td style="width:196px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:244px;">X985.3</td>
			<td style="width:363px;">Alternative: &#8220;Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)&#8221; from Ambion (AM9720)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">SUPERase&#8226;In RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2696</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP</td>
			<td style="width:196px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:244px;">RPN2538</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">TRIzol reagent</td>
			<td style="width:196px;">life technologies</td>
			<td style="width:244px;">15596-026</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td>
			<td style="width:196px;">BioSpec</td>
			<td style="width:244px;">11079101z</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo

مضان مقرها تمديد التمهيدي (FPE) هي طريقة الجزيئية لتحديد نقاط الانطلاق النسخي أو مواقع تصنيع جزيئات الحمض النووي الريبي. ويتحقق هذا عن طريق النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي من الفائدة باستخدام بادئات fluorescently المسمى محددة والتحليل اللاحق للشظايا [كدنا الناجم عن تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد الكهربائي. في الوقت نفسه، يتم تشغيل رد فعل التسلسل التقليدي سانجر على جل لرسم نهايات شظايا [كدنا لقواعد المناظرة الدقيقة الخاصة بهم. وعلى النقيض من 5&#39;-RACE (السريع التضخيم من [كدنا ينتهي)، حيث يجب استنساخ المنتج ومرشحين متعددين التسلسل، فإن الجزء الأكبر من شظايا [كدنا] الناتجة عن تمديد التمهيدي يمكن الكشف في وقت واحد في واحدة المدى هلام. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء بأكمله (من النسخ العكسي إلى التحليل النهائي لنتائج) يمكن أن تكتمل في يوم عمل واحد. باستخدام بادئات fluorescently المسمى، واستخدام النظائر المشعة الخطرة وصفت الكواشفويمكن تجنب وخفض أوقات المعالجة كما يمكن الكشف عن المنتجات أثناء إجراء الكهربائي. في البروتوكول التالي، نحن تصف طريقة تمديد التمهيدي الفلورسنت في الجسم الحي موثوق وسريع لكشف نهايات 5 &#39;من الرنا للاستدلال النسخي نقطة البداية وتجهيز مواقع RNA (على سبيل المثال، من خلال مكونات النظام السم الترياق) في س. الذهبية، E. كولاي وغيرها من البكتيريا.

كما هو مبين في الشكل (6)، يمكن استخدام رد فعل تمديد التمهيدي لتحديد نقاط الانطلاق النسخي من النصوص ذات الأهمية ويمكن أن يساعد على استخلاص مناطق المروج (التي تم تحديدها عادة من قبل -10 و -35 العناصر). يمثل العلوي (أطول) [كدنا] جزء من &quot;نهاية 5 من مرنا وبالتالي يمكن ت...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo at JoVE.com

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

مضان استنادا تمديد التمهيدي تقنية لتحديد ما الترانسكربتي المنطلقات ومواقع الشق من RNases<em&gt; في فيفو</em

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

خرطوم ملحق مواجهتها (PER) الفحص في ذبابة الفاكهة

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

التمهيدي لقطة فرعي : استرجاع المستهدفة تسلسل الحمض النووي من مصادر المتدهورة بالديون

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور<sup&gt; -</sup&gt; القنوات وأنظمة نقل

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

طرق لاكتشاف المروج البديل الاستخدام وتنظيم الترانسكربتي من الفئران Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...