Name: fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00
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We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the &#8220;priority programmes&#8221; SPP1316 and SPP1617.

1. उच्च मार्ग आरएनए तैयारी <ol><li> शाही सेना अलगाव नोट: कुल शाही सेना के उच्च सांद्रता प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं. स्पिन स्तंभ किट आमतौर पर जरूरत शाही सेना की राशि उपज नहीं है (~ 5-16 माइक्?...

<ol>
	<li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+extension+assay.">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li><li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension:+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension.">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li><li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum.">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li><li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems.">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li><li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea.">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li><li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate.">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li><li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems.">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li><li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+interferases,+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems.">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li><li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+MazF-bs+(EndoA)+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase.">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence,+UACAU,+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP.">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA+interferases,+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA.">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li><li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+MazFSa,+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus.">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li><li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms.">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li><li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ompA+5'+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency.">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li><li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli.">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li><li>Schleifer, K. H., Kilpper-B&#228;lz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.,+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.:+Three+New+Coagulase-Negative,+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals.">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .</li><li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates.">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li><li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA.">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li></ol>

फ्लोरोसेंट प्राइमर विस्तार TSP- या माध्यमिक शाही सेना प्रसंस्करण पहचान के लिए, या तो RNAs के 5 &#39;सिरों को निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि है. कारण फ्लोरोसेंट प्राइमर का उपयोग करने के लिए, प्रतिक्?...

प्राइमर विस्तार 1 एक एक आधार संकल्प अप करने के लिए विशिष्ट आरएनए अणुओं के 5 &#39;समाप्त होता है निर्धारित करने के लिए एक आणविक विधि है. ऐसे 5&#39;-दौड़ (सीडीएनए की तेजी प्रवर्धन समाप्त होता है) के रूप में अन्य तरीकों को लाभ तेजी से बदलाव समय और आसानी से आरएनए अणुओं के अलग अलग लंबाई का एक मिश्रण का विश्लेषण करने की क्षमता है. इस विधि आरएनए अणुओं निश्चित लंबाई की सीडीएनए टुकड़े पैदा करने, विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्राइमर का उपयोग प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं रिवर्स करने के लिए subjecting द्वारा काम करता है. ये सीडीएनए अणुओं denaturing polyacrylamide जैल पर पारंपरिक सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं 2 के साथ चलाए जा रहे हैं और कारण fluorescently लेबल प्राइमरों का उपयोग करने के लिए उनके प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया जा सकता है. सीडीएनए टुकड़े की लंबाई तो 5 &#39;शाही सेना सिरों की मैपिंग की अनुमति, अनुक्रमण सीढ़ी की तुलना द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं. परंपरागत रूप से, प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं संयोजन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंरेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ एक्स-रे फिल्मों पर सीडीएनए अणुओं का पता लगाने के लिए. उनकी संवेदनशीलता से थोड़ा कम है यद्यपि कारण स्वास्थ्य को खतरा, अपशिष्ट निपटान के मुद्दों और हैंडलिंग की आसानी के लिए, नए प्रोटोकॉल, स्वचालित sequencers साथ प्राइमर विस्तार का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग. फ्लोरोसेंट प्राइमर (हमारे हाथों में एक वर्ष से अधिक) एक लंबे समय के लिए स्थिर रहे हैं के रूप में fluorescently लेबल प्राइमरों का प्रयोग, आवर्ती रेडियो-लेबलिंग प्रक्रिया, छोड़ा जा सकता है. हम यहाँ वर्णन विधि एक स्वचालित जेल Sequencer का इस्तेमाल करता है, लेकिन मामूली संशोधनों के साथ, केशिका sequencers भी सीडीएनए जुदाई और पहचान 3 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जेल विश्लेषण के समानांतर प्रकृति यह संभव आरएनए दरार या प्रसंस्करण की भी एक छोटी राशि का पता लगाने के लिए बनाता है. एक और लाभ यह पता लगाया जा सकता टर्मिनल दरार या यहां तक ​​कि एक आधार के प्रसंस्करण के रूप में, इस विधि के उच्च संकल्प है. शाही सेना दरार या प्रसंस्करण, टी का पता लगाने के संबंध मेंप्राइमर एक्सटेंशन के ypically दो अलग अलग प्रकार प्रतिष्ठित हैं. अन्य मामले में, प्रसंस्करण विवो में किया जाता है और जिसके परिणामस्वरूप शाही सेना शुद्ध होता है, जबकि एक मामले में, एंजाइमी उपचार, शुद्ध शाही सेना और शुद्ध एंजाइम का उपयोग कर इन विट्रो में किया जाता है. एक प्राइमर विस्तार विट्रो में किए गए करने के लिए दोनों ही मामलों में शाही सेना के शाही सेना के स्रोत पर निर्भर करता है, तथापि, अधीन है, विधि इन विट्रो या vivo में प्राइमर एक्सटेंशन कहा जाता है या तो. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम क्योंकि उपयोग की आसानी (कोई शुद्ध प्रोटीन आवश्यक) और एक ही समय में ट्रांस्क्रिप्शनल शुरू अंक और प्रसंस्करण निर्धारित करने के लिए संभावना की, केवल इन विवो प्राइमर विस्तार पर ध्यान केंद्रित. हालांकि, इन विट्रो प्राइमर एक्सटेंशन उसी तरह स्थापित सिद्धांत में हैं और इस प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकते हैं. यहाँ सचित्र विधि के रूप में वे उच्च करने के लिए उत्तरदायी हैं के रूप में कई बैक्टीरिया की प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता हैन्यूक्लिक एसिड की पवित्रता और उच्च उपज तैयारी. हमारी प्रयोगशाला में अनुसंधान विष-अतिविष (टा) सिस्टम 4,5, प्राइमर विस्तार विधि बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है, जिसमें एक क्षेत्र के नियामक दायरे पर केंद्रित है. टीए-सिस्टम एक स्थिर और endogenously सक्रिय जहरीले प्रोटीन और विषाक्तता 6,7 counteracts कि एक ज्यादातर अस्थिर प्रोटीन या शाही सेना अतिविष से मिलकर उस प्रोकार्योटिक जीनोम में मौजूद छोटे आनुवंशिक तत्व हैं. विष गतिविधि कभी कभी RNase गतिविधि 8,9 से सबसे अधिक बार प्रतिकृति, कोशिका दीवार संश्लेषण या अन्य तंत्र का निषेध द्वारा लगाए गए, लेकिन है. आमतौर पर, RNase विशिष्टता प्राइमर विस्तार विधि है, जिनमें से एक अलग परीक्षण का आयोजन द्वारा निर्धारित किया जाता है. Cleaved और पूर्ण लंबाई के टुकड़े का एक मिश्रण एक साथ उनके 5 &#39;समाप्त होता है निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है के रूप में प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं, इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. इन विट्रो की और इन विवो प्राइमर एक्सटेंशन में एक मिश्रण का उपयोग करना,विशिष्ट विष RNase दरार, जैसे, अनुक्रम विशिष्टता 10-13 निर्धारित किया जा सकता है. <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" /> . प्राइमर विस्तार प्रक्रिया 1. अवलोकन चित्रा बैक्टीरियल संस्कृतियों प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार incubated और इलाज कर रहे हैं. कुल शाही सेना कोशिकाओं, सीडीएनए उपज लक्ष्य विशिष्ट फ्लोरोसेंट डीएनए प्राइमरों का उपयोग कर एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए डीएनए निशान को दूर करने के लिए DNase मैं के साथ व्यवहार और अधीन से निकाला जाता है. जीनोमिक डीएनए या प्लास्मिड निकाली और बाद में सीडीएनए टुकड़े के साथ आकार तुलना के लिए फ्लोरोसेंट सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए उपयोग किया जाता है. प्राइमर विस्तार उत्पादों एक denaturing यूरिया polyacrylamide जेल पर सेंगर अनुक्रमण उत्पादों के साथ चलाने के लिए और एक स्वचालित लेजर और माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण कर रहे हैं. ला सीडीएनए बैंड के साथ लाइनों है कि अनुक्रमण आधारसेंट 5 &#39;सीडीएनए अंत (नीले तीर) के आधार. Fekete में अधिक जानकारी, एट अल. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> पूरे प्राइमर विस्तार प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में पाया जा सकता है. संक्षेप में, बैक्टीरियल कोशिकाओं काटा, सुसंस्कृत हैं, सेल गोली lysed और शाही सेना निकाली. शुद्ध आरएनए तो रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के लिए टेम्पलेट्स के रूप में कार्य कर सकता है जो डीएनए अणु के निशान को दूर करने के लिए DNase मैं के साथ व्यवहार किया जाता है. विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्राइमरों ब्याज के क्षेत्र को संकरित और बाद में एकल असहाय पूरक डीएनए (सीडीएनए), जिसके परिणामस्वरूप लिखित रिवर्स, शाही सेना को जोड़ रहे हैं. एक अनुक्रमण सीढ़ी फ्लोरोसेंट प्राइमरों रोजगार पारंपरिक सेंगर अनुक्रमण के द्वारा बनाई गई और प्राइमर विस्तार सीडीएनए टुकड़े के साथ एक denaturing polyacrylamide जेल पर अलग किया जाता है. जिसके परिणामस्वरूपजेल ब्याज की 5 &#39;सिरों की पहचान की अनुमति, फ्लोरोसेंट बैंड की तुलना द्वारा विश्लेषण किया है. Transcriptional शुरू अंक और प्रसंस्करण साइटों तो अनुक्रम तुलना द्वारा व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन कर रहे हैं.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1200">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;"><a name="RANGE!A1:D16">Name</a></td>
			<td style="width:196px;">Supplier</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number(s)</td>
			<td style="width:363px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:196px;">NEB / Roche</td>
			<td style="width:244px;">NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:399px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2222</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">FastPrep-24 Instrument&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MPBio</td>
			<td align="right">116004500</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:399px;">Fluorescently labeled primers</td>
			<td style="width:196px;">Biomers</td>
			<td style="width:244px;">n/a</td>
			<td style="width:363px;">5&#8217; DY-681 modification of &#8220;ordinary&#8221; DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software</td>
			<td style="width:196px;">Li-Cor</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:363px;">Product discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM9915G</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Plasmid mini preparation kit</td>
			<td style="width:196px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RapidGel-XL-40% Concentrate</td>
			<td style="width:196px;">USB</td>
			<td style="width:244px;">US75863</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RNA STORAGE BUFFER</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td>AM7000</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Roti-Aqua-P/C/I</td>
			<td style="width:196px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:244px;">X985.3</td>
			<td style="width:363px;">Alternative: &#8220;Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)&#8221; from Ambion (AM9720)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">SUPERase&#8226;In RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2696</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP</td>
			<td style="width:196px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:244px;">RPN2538</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">TRIzol reagent</td>
			<td style="width:196px;">life technologies</td>
			<td style="width:244px;">15596-026</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td>
			<td style="width:196px;">BioSpec</td>
			<td style="width:244px;">11079101z</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo

प्रतिदीप्ति आधारित प्राइमर विस्तार (एफपीई) ट्रांस्क्रिप्शनल शुरू अंक या आरएनए अणुओं के प्रसंस्करण साइटों का निर्धारण करने के लिए एक आणविक विधि है. इस विशिष्ट fluorescently लेबल प्राइमरों और polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing द्वारा परिणामस्वरूप सीडीएनए टुकड़े के बाद के विश्लेषण का उपयोग ब्याज की शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा हासिल की है. इसके साथ ही, एक पारंपरिक सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रिया उनके सटीक इसी अड्डों को सीडीएनए टुकड़े के सिरों नक्शा करने के लिए जेल पर चलाया जाता है. उत्पाद क्लोन किया जाना चाहिए और कई उम्मीदवारों अनुक्रम जहां 5&#39;-दौड़ (सीडीएनए रुप से रैपिड प्रवर्धन), के विपरीत, प्राइमर विस्तार से उत्पन्न सीडीएनए टुकड़े के थोक एक साथ एक जेल समय में पता लगाया जा सकता है. इसके अलावा, (परिणाम की अंतिम विश्लेषण करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन से) पूरी प्रक्रिया एक काम कर दिन में पूरा किया जा सकता है. Fluorescently लेबल प्राइमरों का उपयोग करके, खतरनाक रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग अभिकर्मकों लेबलबचा जा सकता है और उत्पादों वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान पता लगाया जा सकता है के रूप में प्रसंस्करण बार कम हो रहे हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम मज़बूती से और तेजी से एस में (जैसे, विष-अतिविष सिस्टम घटकों द्वारा) शुरू अंक और आरएनए प्रसंस्करण साइटों ट्रांस्क्रिप्शनल परिणाम निकालना RNAs के 5 &#39;समाप्त होता है पता लगाने के लिए एक vivo में फ्लोरोसेंट प्राइमर विस्तार विधि का वर्णन ऑरियस, ई कोलाई और अन्य जीवाणुओं.

चित्रा 6 में दर्शाया के रूप में, एक प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया ब्याज के टेप के transcriptional शुरू अंक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और (आमतौर -10 और -35 तत्वों द्वारा की पहचान) प्रमोटर क्षेत?...

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Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

प्रतिदीप्ति आधारित प्राइमर एक्सटेंशन तकनीक Transcriptional शुरू अंक और RNases की दरार साइटों का निर्धारण करने के<em&gt; Vivo</em

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

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प्राइमर एक्सटेंशन कैद: भारी अपमानित डीएनए स्रोत से लक्षित अनुक्रम रिट्रीवल

We present a method of targeted DNA sequence retrieval from DNA sources which are heavily degraded and contaminated with microbial DNA, as is typical of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Ribosome बाध्य नवजात polypeptides का अलगाव<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; MRNA के साथ translational रोकें ब्लॉग की पहचान के लिए

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

जीन विनियमन के एकल अणु इमेजिंग<em&gt; Vivo में</em&gt; विखंडन द्वारा Cotranslational सक्रियकरण (CoTrAC) का उपयोग

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

जीन एक्सप्रेशन का डीएनए बातचीत, डिस्कवर transcriptional नियामकों, और उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों की पहचान: प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक परख

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

एक Proteoliposome आधारित तपका परख सीएल के एकल अणु गुण निर्धारित करने के लिए<sup&gt; -</sup&gt; चैनल और ट्रांसपोर्टरों

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

तरीके वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग और murine Bcrp1 की Transcriptional नियमन डिस्कवर के लिए

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

इन विट्रो में और Vivo में आंतों उपकला कोशिका पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...