Name: fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00
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We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the &#8220;priority programmes&#8221; SPP1316 and SPP1617.

1.高収量のRNAの準備<ol><li> RNAの単離 NOTE：トータルRNAの高濃度は、プライマー伸長反応のために必要とされる。スピンカラムキットは、通常必要とされるRNAの量を得られない（〜5から16μgの5μlの体積中）。したがって、酸グアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出法を用いて精製を以下に概説する、推奨される。 注：フェノールは、発がん性、有毒で腐食性?...

<ol>
	<li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+extension+assay.">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li><li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension:+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension.">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li><li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum.">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li><li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems.">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li><li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea.">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li><li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate.">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li><li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems.">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li><li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+interferases,+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems.">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li><li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+MazF-bs+(EndoA)+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase.">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence,+UACAU,+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP.">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA+interferases,+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA.">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li><li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+MazFSa,+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus.">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li><li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms.">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li><li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ompA+5'+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency.">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li><li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli.">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li><li>Schleifer, K. H., Kilpper-B&#228;lz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.,+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.:+Three+New+Coagulase-Negative,+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals.">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .</li><li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates.">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li><li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA.">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li></ol>

蛍光プライマー伸長はTSP-または二次RNA処理識別のためのいずれか、RNAの5 &#39;末端を決定するための簡単​​かつ迅速な方法である。原因蛍光プライマーの使用のために、反応が設定することができ、（放射性標識したプライマーの場合と異なり）追加のセキュリティ対策なしで実行されます。サンプルは、蛍光によって検出されるように、電気泳動、X線フィルムが一般的に使用される放射?...

プライマー伸長は、1つの基地解像度までの特定のRNA分子の5 &#39;末端を決定するための分子方法である。そのような5&#39;-RACE（cDNA末端の迅速増幅）のような他の方法の利点は、高速のターンアラウンドタイムと容易にRNA分子の異なる長さの混合物を分析する能力である。 この方法は、特定の長さのcDNA断片を生成する、特異的な蛍光プライマーを用いて逆転写反応するRNA分子を供することによって動作する。これらのcDNA分子は、変性ポリアクリルアミドゲル上で従来のサンガー配列決定反応2と一緒に実行される起因蛍光標識プライマーの使用に、それらの蛍光によって検出することができる。 cDNA断片の長さは、5 &#39;RNA末端のマッピングを可能にする、シークエンシングラダーとの比較によって評価される。 伝統的に、プライマー伸長反応は、組み合わせて使用​​される放射性同位体でX線フィルム上のcDNA分子を検出することができる。それらの感度が若干低いとはいえ起因する健康被害、廃棄物処理の問題や取り扱いの容易さのために、より新しいプロトコルは、自動化されたシーケンサーを持つプライマー伸長を検出するための蛍光を利用している。蛍光プライマーは（我々の手で一年以上）、長い​​間安定しているように、蛍光標識されたプライマーを用いて、定期的な放射性標識化手順は、省略することができる。 ここで記述する方法は、自動化されたゲルシーケンサーを利用したが、若干の変更を加えて、キャピラリーシーケンサーも、cDNAの分離および検出の3のために使用することができる。ゲル分析の並列性は、RNA切断または加工の小さな量を検出することが可能となる。別の利点は、検出することができる末端切断、あるいは一つの塩基の処理として、この方法は、高解像度である。 RNA切断または処理、tは検出に関してはypicallyプライマー拡張の2つのタイプが区別される。他の場合には、処理は、生体内で行われ、得られたRNAが精製されるのに対し、あるケースでは、酵素処理は、精製されたRNAおよび精製された酵素を用いてインビトロで行われる。プライマー伸長は、in vitroで実施する両方の場合において、RNAは、RNAの供給源に依存して、しかし、供され、この方法は、in vitroまたはin vivoでのプライマー伸長と呼ばれるか。ここで提示したプロトコルでは、使いやすさのために（無精製タンパク質必要）と同時に、転写開始点と処理を決定する可能性を、in vivoでのプライマー伸長のみに焦点を当てる。しかし、in vitroでのプライマー拡張は同じように設定する原則にあり、このプロトコルは、出発点として役立つことができる。 ここに示された方法は、それらが高に適しているように、多くの細菌種に適用することができ純度および核酸の高収率製剤。 私たちの研究室での研究は、毒素-抗毒素（TA-）システム4,5、プライマー伸長法が広く使用されているフィールドの規制範囲に焦点を当てています。 TA-システムが安定しており、内因的に積極的な毒性タンパク質や毒性6,7を打ち消す主に不安定なタンパク質またはRNA抗毒素で構成され、原核生物のゲノム中に存在する小さな遺伝的要素である。毒素活性は、しばしば複製の阻害、細胞壁合成、または他の機構によって作用するが、ほとんどの場合RNase活性8,9によってれる。一般的に、RNアーゼ特異性プライマー伸長法であるそのうちの一つの異なる試験を行うことによって決定される。切断された完全長断片の混合物が同時にそれらの5 &#39;末端を決定するために分析することができるように、プライマー伸長反応は、この用途に非常に適している。 、in vitroおよびin vivoプライマーエクステンション内のミックスを使用特定の毒素のRNase切断は、 例えば、配列特異性は、10-13を決定することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" /> プライマー伸長手順の概要を図1。細菌培養実験のニーズに応じてインキュベートし、処理される。全RNAを、細胞から抽出したDNAの痕跡を除去するためにDNアーゼIで処理したcDNAを得た標的特異的蛍光DNAプライマーを用いて逆転写反応に供される。ゲノムDNAまたはプラスミドを抽出し、続いてcDNA断片とサイズ比較用蛍光サンガー配列決定反応のために使用される。プライマー伸長産物は、変性尿素ポリアクリルアミドゲル上サンガーシークエンシング産物と一緒に実行して、自動化されたレーザー顕微鏡で分析する。ラcDNAのバンドとラインアップしているシーケンシングベースSTの5 &#39;cDNAの端（青い矢印）のベース。 Feketeの中でより多くの情報、 ら 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 全体のプライマー伸長手順の概要を図1に見ることができる。簡単に説明すると、細菌細胞を培養し、収穫し、細胞ペレットを溶解し、RNAを抽出した。精製されたRNAは、逆転写酵素のためのテンプレートとして作用し得るDNA分子の痕跡を除去するためにDNアーゼIで処理する。特異的な蛍光プライマーは、RNAに付加関心領域にハイブリダイズし、続いて一本鎖の相補的DNA（cDNA）の結果として、逆転写されている。配列決定ラダーは、蛍光プライマーを用いた従来のサンガー配列決定によって作成され、プライマー伸長cDNA断片の横に変性ポリアクリルアミドゲル上で分離する。結果として生じるゲルは、対象の5 &#39;末端の同定を可能にする、蛍光バンドを比較することによって分析される。転写開始点およびプロセシング部位は、次いで配列比較によって個別に評価される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1200">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;"><a name="RANGE!A1:D16">Name</a></td>
			<td style="width:196px;">Supplier</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number(s)</td>
			<td style="width:363px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:196px;">NEB / Roche</td>
			<td style="width:244px;">NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:399px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2222</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">FastPrep-24 Instrument&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MPBio</td>
			<td align="right">116004500</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:399px;">Fluorescently labeled primers</td>
			<td style="width:196px;">Biomers</td>
			<td style="width:244px;">n/a</td>
			<td style="width:363px;">5&#8217; DY-681 modification of &#8220;ordinary&#8221; DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software</td>
			<td style="width:196px;">Li-Cor</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:363px;">Product discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM9915G</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Plasmid mini preparation kit</td>
			<td style="width:196px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RapidGel-XL-40% Concentrate</td>
			<td style="width:196px;">USB</td>
			<td style="width:244px;">US75863</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RNA STORAGE BUFFER</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td>AM7000</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Roti-Aqua-P/C/I</td>
			<td style="width:196px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:244px;">X985.3</td>
			<td style="width:363px;">Alternative: &#8220;Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)&#8221; from Ambion (AM9720)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">SUPERase&#8226;In RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2696</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP</td>
			<td style="width:196px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:244px;">RPN2538</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">TRIzol reagent</td>
			<td style="width:196px;">life technologies</td>
			<td style="width:244px;">15596-026</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td>
			<td style="width:196px;">BioSpec</td>
			<td style="width:244px;">11079101z</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo

蛍光ベースのプライマー伸長（FPE）は、転写開始点またはRNA分子のプロセシング部位を決定するための分子方法である。これは、特定の蛍光標識プライマーおよび変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られたcDNA断片のその後の分析を使用して、目的のRNAを逆転写することによって達成される。同時に、従来のサンガー配列決定反応は、正確な対応するベースにcDNA断片の末端をマッピングするためにゲル上で実行される。生成物をクローン化しなければならず、複数の候補を配列決定5&#39;-RACE（cDNA末端の迅速増幅）とは対照的に、プライマー伸長によって生成されたcDNA断片の大部分は、同時に1つのゲルの実行を検出することができる。また、（逆転写の結果の最終分析に）全体の手順は、1営業日で完了することができる。蛍光標識されたプライマーを用いることによって、危険な放射​​性同位体の使用は、試薬を標識回避することができ、生成物は、電気泳動手順中に検出することができるように、処理時間が低減される。 以下のプロトコールでは、確実かつ迅速にS.（例えば、毒素-抗毒素システムコンポーネントによって）開始点及びRNAプロセッシング部位、転写を推定するRNAの5 &#39;末端を検出するためのin vivo蛍光プライマー伸長方法を記載球菌、E。 coliおよび他の細菌。

図6に示されるように、プライマー伸長反応は、目的の転写物の転写開始点を決定するために用いることができる（通常-10および-35要素によって識別される）のプロモーター領域を推定するのを助けることができる。一番上の（最長）のcDNA断片は、mRNAの5 &#39;末端を表し、従って、配列決定ラダーと比較した場合に容易にマッピングすることができる。 <img al...

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Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

転写開始点を決定するための蛍光に基づくプライマー伸長技術とのRNaseの切断サイト<em&gt;インビボ</em

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

冷凍細胞から出発培養：ヒトES細胞

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

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ショウジョウバエにおけるテングザル拡張レスポンス（PER）アッセイ

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

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のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

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Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

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A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

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