Name: using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Denne protokollen og video er ment å tjene som en følgesvenn til den opprinnelige artikkel som beskriver programvarepakken nærmere fire, samt den tekniske rapporten som følger med programvaren nedlasting på nettstedet til Det Danuser Lab. Leserne oppfordres til å gjennomgå disse dokumentene nøye om det er ytterligere spørsmål om bruken av programvaren. 1. Før bildeanalyse <ol><li> Konvertere hver time-lapse film i en sekvens av TIFF (Tagged Image File Format) bildefil...

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

PlusTipTracker gir en grei, grafisk brukergrensesnitt for å raskt og automatisk oppdage nesten alle synlige EB1-GFP kometer i en celle eller vekst kjegle, knytte kometer i spor, og beregne MT parametere. Andre publikasjoner har rapportert utformingen av lignende typer programvare (f.eks Marx et al. Også benyttes kvantitativ analyse av merket EB1 dynamikken i vekstkjegler 18). Men, synes denne programvaren til å være unik i sin enkel tilgang, som det er fritt lastes ned fra nettsiden til Danuser L...

Målet med denne metoden er å innhente kvantitativ informasjon om mikrotubulus (MT) pluss-end-sporing protein (+ TIP) dynamikken i levende vekst kjegler. MT + Tips er en gruppe proteiner som lokalisere til pluss-endene av MTS 9,10. De utfører en rekke funksjoner for å regulere parametere av MT dynamisk ustabilitet 11, inkludert priser av polymerisasjon, katastrofe, og redning. En godt brukt metode for å analysere MT dynamikken er å spore oppførselen til + TIP EB1, som binder seg spesifikt til voksende MT pluss-ender 1,12. EB1 er kjent for å rekruttere flere andre proteiner til voksende MT pluss-ender 13,14, og har nylig blitt etablert som en MT modning faktor 15, fremme både MT vekst og katastrofe frekvens 15,16. Mange studier av MT dynamikken i vekst kjegler har utnyttet hånd-sporing metoder for å måle endringer i EB1-GFP dynamikk over tid 1-3, som EB1 localizatividere til MT pluss-ender kan brukes som en markør for MT polymerisasjon. En viktig fordel for behandlingen EB1-GFP kometer som en proxy for MT veksten er at MT dynamikk kan måles selv i områder med betydelig MT overlapping. Mens metoden av hånd sporing EB1-GFP kometer har gitt nyttig innsikt i MT atferd 1-3, det er tidkrevende og kan være partisk. I tillegg, som avvikende vekst kjegle atferd er sannsynligvis et resultat av liten skift i cytoskeletal dynamikk, analysere bare en liten undergruppe av MTS (vanligvis nødvendig når hånd-sporing) kan gå glipp av vesentlig informasjon. Dermed måler vi globale MT dynamikk parametere ved hjelp av programvarepakken, plusTipTracker 4, etter oppkjøpet av høy oppløsning, levende bilder av merket EB1 i kultiverte embryonale vekst kjegler fem. Denne programvaren er utviklet i Danuser Lab, har vært brukt i flere studier som preger MT dynamikk i ulike celletyper 6-8. Det er en åpen-kildekode, osser-vennlig, MATLAB-basert pakke som inkluderer automatisert deteksjon, sporing, visualisering og analyse for filmer av fluorescently-merket + tipsene. En lang liste av spesifikke parametre for MT dynamikk er beregnet av denne programvaren (se Reference 4 for detaljer), men for analyse av MT dynamikken i vekst kjegler, de mest nyttige parametere er MT vekstsporet hastighet (i mikron / minutt), vekstsporet levetid (i sekunder), og vekst sporlengde (i mikron). Programvaren kan lastes ned direkte fra webområdet til Danuser Lab (under &quot;programvare&quot;). Mens Danuser Lab støtter for tiden en nyere grensesnitt for + TIP sporing analyse, som er innlemmet i en programvarepakke kalt u-track 2.0, den opprinnelige, frittstående programvare vil være tilgjengelig. De underliggende algoritmer mellom de to programmer er den samme (i det minste fra og med 2014), med bare en forskjell på grensesnitt og analyse utganger. For nybegynneren med lite Matlab og / eller beregningsorientert analyse opplhet, har plusTipTracker flere brukervennlige funksjoner, inkludert automatiserte statistiske parameter utganger. Her beskriver vi fremgangsmåten for å analysere bilder av EB1-GFP dynamikk i dyrkede Xenopus laevis vekst kjegler. Denne protokollen ble benyttet i en nyere artikkel undersøke MT dynamikk 17. Se også Lowery et al. 2012 5 for detaljerte instruksjoner om dyrking vekst kjegler uttrykker EB1-GFP. Mens dette papiret først og fremst fokusert på å undersøke EB1-GFP dynamikken i vekst kjegler, kan den samme protokollen brukes til andre celletyper 17. For alle celletyper, bør tidsintervallet mellom rammer være mellom 0,5-2 sek for optimal + TIP sporing. Et tidsintervall på opp til 4 sekunder mellom rammer er mulig, men dette økte tidsintervall resulterer i ytterligere sporingsfeil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Mikrotubulus (MT) pluss-end-sporing proteiner (+ spisser) lokalisere til den voksende pluss-endene av MTS og regulere MT dynamikk 1,2. En av de mest kjente og allment utnyttet + tips for å analysere MT dynamikk er slutten-bindende protein, EB1, som binder alle voksende MT pluss-ender, og dermed er en markør for MT polymerisasjon en. Mange studier av EB1 atferd innen vekst kjegler har brukt tidkrevende og partisk IT-baserte, hånd-sporing metoder for å analysere individuelle MTS 1-3. Vår tilnærming er å kvantifisere globale parametere av MT dynamikk ved hjelp av programvarepakken, plusTipTracker 4, etter oppkjøpet av høy oppløsning, levende bilder av merket EB1 i kultiverte embryonale vekst kjegler fem. Denne programvaren er en MATLAB-basert, åpen kildekode, brukervennlig pakke som kombinerer automatisert deteksjon, sporing, visualisering og analyse for filmer av fluorescently-merket + tipsene. Her presenterer vi protokollen for bruk plusTipTRacker for analyse av fluorescently-merket + tips kometer i dyrkede Xenopus laevis vekst kjegler. Imidlertid kan denne programvaren også brukes til å karakterisere MT dynamikken i forskjellige celletyper 6-8.

Ved hjelp av denne programvaren som beskrevet her vil gi flere filer med informasjon som kvantifiserer + tips dynamikken i levende celler. Funksjons plusTipGetTracks identifiserer sporene (med eksempelinnstillingene vist i figur 1), og gir parametre vedrørende + tips spor da. Hvis du vil vise informasjon om at programvaren har oppnådd, gå inn i roi_X katalogen som ble opprettet i trinn 2.2. Den &quot;feat&quot; mappen inneholder &quot;overlayImages&quot;, som er en serie ...

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

MATLAB-basert, åpen kildekode programvarepakke, plusTipTracker, kan brukes til å analysere bildeserie av fluorescently-merket + tips for å kvantifisere mikrotubulidynamikk.

Bruke plusTipTracker Programvare to Measure mikrotubulidynamikk i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; vekst kjegler

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produksjon av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Ekstrakter å identifisere microtubule-tilknyttede RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Ansikts transplantasjoner i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...