Name: detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

हम उड़ शेयरों प्रदान करने के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र धन्यवाद। हम यह भी एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक और डॉ लिन कूली (येल विश्वविद्यालय) धन्यवाद। एक विशेष धन्यवाद पांडुलिपि पर उसकी मदद के लिए AhHyun हम आ गए करने के लिए चला जाता है। इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (क्रीगर), विलियम और एडीए इसाबेल स्टील फंड (क्रीगर), और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (कठोर) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

1. शरीर दीवार तैयारी । नोट: पहले से ब्रेंट एट अल 10, या रामचंद्रन और Budnik 11,12 में वर्णित के रूप में (शरीर दीवार मांसपेशियों अंदर आना जो NMJs के अध्ययन के लिए) तीसरे instar लार्वा शरीर दीवारों क?...

<ol>
	<li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions.">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li><li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Lgl/Dlg/Scribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction,+polarity+and+growth.">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li><li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li><li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses:+benefits+and+limitations.">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li><li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adducin:+structure,+function+and+regulation.">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane.">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis.">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li><li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hts/Adducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination.">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li><li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li><li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+p21-Activated+Kinases.">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li><li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity:+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation.">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li><li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+structural+and+functional+synapse+development:+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology.">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li><li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development.">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+forest+tree+by+tree:+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences.">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li></ol>

इस रिपोर्ट में पीएलए ड्रोसोफिला लार्वा NMJ को लागू किया जा सकता है दर्शाता है। परख NMJ में उपस्थित अंतर्जात प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के उद्देश्य के लिए लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों की तैय...

बड़े ड्रोसोफिला डिस्क (dlg) प्लाज्मा झिल्ली के विशिष्ट स्थलों पर बड़े प्रोटीन परिसरों की विधानसभा आर्केस्ट्रा मदद प्रोटीन है कि मचान की झिल्ली जुड़े guanylate काइनेज परिवार का एक संरक्षित सदस्य है। एक ट्यूमर शमन प्रोटीन, dlg उपकला apicobasal polarity के 1,2,3 का एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में कार्य करता है के रूप में मूल रूप से पहचान की। Dlg भी लार्वा विकास 4 दौरान glutamatergic मोटर न्यूरॉन्स की neuromuscular जंक्शन (NMJ) में एक प्रमुख मचान मॉड्यूल के रूप में कार्य करता है। Dlg लार्वा NMJ में विविध भूमिकाएं निभाता है, और इसके pleiotropism कई प्रोटीन 5,6 के साथ संबद्ध करने की क्षमता पर निर्भर करता है। ऐसा ही एक प्रोटीन हू-ली ताई शाओ (एचटीएस), मुख्य रूप से 7 cytoskeleton एक्टिन-spectrin को विनियमित करने में अपनी भूमिका के संबंध में वर्णित किया गया है कि स्तनधारी adducins करने के लिए एक सजात है। यह पहले dlg और एचटीएस में इन विट्रो के आधार पर एक दूसरे के साथ एक जटिल फार्म कर सकते हैं दिखाया गया है कि </उन्हें&gt; पूरे वयस्क मक्खी lysates 8 को शामिल सह immunoprecipitation प्रयोगों। इन परिणामों के एक कमी है, तथापि, वे जहां इस जटिल रूपों का संकेत नहीं है। Immunohistochemistry के उपयोग के साथ, dlg और एचटीएस का वितरण लार्वा NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में ओवरलैप करने के लिए मनाया जाता है, लेकिन वे इस क्षेत्र में 8 में एक परिसर में कर रहे हैं? हाल ही में दिखाया गया है और आगे यहाँ विस्तृत रूप में, निकटता Ligation परख (पीएलए) लार्वा NMJ 27 पर विशेष रूप से dlg और एचटीएस के बीच सीटू सहयोग से एक के लिए देखने के लिए प्रयोग किया जाता है। पीएलए ज्यादातर सीटू 9 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगा सकते हैं कि सेल और ऊतक संस्कृति में इस्तेमाल एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है। इस परख में, ब्याज की दो प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजाति विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी की एक जोड़ी के साथ पता चला रहे हैं, oligonucleotides के संयुग्मित कर रहे हैं जो पीएलए जांच, कहा जाता है (चित्रा 1 ए, बी)। दो प्रोटीन हैंएस, संलग्न पीएलए जांच के बीच की दूरी दो अतिरिक्त कनेक्टर oligonucleotides (चित्रा 1C) के संकरण के माध्यम से दूर किया जा सकता है (नैनोमीटर की कुछ दसियों के भीतर यानी) एक दूसरे के करीब निकटता में हैं। इस रचना में, कनेक्टर oligonucleotides के नि: शुल्क समाप्त होता है एक दूसरे के साथ संपर्क बनाने के लिए काफी करीब हैं, और एक बंद परिपत्र डीएनए अणु सीटू बंधाव में (चित्रा -1) पर गठित किया जा सकता है। परिपत्र डीएनए अणु पीएलए जांच (चित्रा 1E) संयुग्मित oligonucleotides के एक से primed है जो बगल में रोलिंग चक्र प्रवर्धन, के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धित, concatemeric डीएनए उत्पाद भीतर दृश्यों तो fluorescently लेबल, पूरक oligonucleotide जांच (चित्रा 1F) के साथ देखे जा सकते हैं। प्रवर्धित डीएनए पीएलए जांच में से एक, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत ढंग से की subcellular स्थानीयकरण के साथ जुड़ा रहता चूंकिNA ऊतक आसानी से पता लगाया जा सकता है। कई तरीकों आमतौर पर इस तरह के सह immunoprecipitation के रूप में इन विट्रो तकनीक में शामिल प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने (-नीचे खींच assays और खमीर दो संकर स्क्रीनिंग, और इस तरह के Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और bimolecular प्रतिदीप्ति complementation रूप विवो तकनीक में इस्तेमाल किया जाता है BiFC)। इन विट्रो तकनीकों का एक ख़तरा बातचीत endogenously उत्पन्न हो रही है, जहां में ऊपर उल्लिखित विवो तकनीक उनके अंतर्जात समकक्षों के जन्म का व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है कि संलयन प्रोटीन की कृत्रिम अभिव्यक्ति को शामिल करते हुए वे पहचान नहीं है। पीएलए का एक प्रमुख लाभ यह है कि वित्तीय संसाधन के लिए तुलनीय जा रहा है एक संकेत उत्पन्न करने के लिए आवश्यक निकटता की डिग्री के साथ, एक ऊतक के भीतर एक दूसरे के करीब निकटता में हैं और संभावना है कि एक जटिल गठन कि अंतर्जात प्रोटीन interactors के subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने में सक्षम है, वह यह है किईटी और BiFC। पीएलए के कारण एंटीबॉडी मान्यता और डीएनए प्रवर्धन की युग्मन के लिए उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ बातचीत का पता लगा सकते। इस प्रकार, परख बातचीत की सही स्थिति का पता चलता है कि puncta के रूप में असतत, उज्ज्वल संकेतों को उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, शायद ही दिखाई दे एंटीजन का पता लगाया जा सकता है। अंत में, पीएलए प्रदर्शन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है, और इसे पूरा करने के लिए एक मानक immunohistochemical प्रक्रिया से नहीं रह लेता है। इसलिए, पीएलए अक्सर लंबी तैयारी के समय और व्यापक समस्या निवारण के साथ त्रस्त हैं कि अन्य प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays के ऊपर एक तकनीकी लाभ प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल पीएलए बगल में अंतर्जात प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के उद्देश्य के लिए ड्रोसोफिला लार्वा NMJ करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे को दर्शाता है। इधर, पीएलए dlg और एचटीएस वास्तव में NMJs की पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक परिसर में मौजूद करने के लिए दिखाए जाते हैं, जहां लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों की तैयारियों पर किया जाता है। पीएलए ने पहले लार्वा NMJ अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है, और ड्रोसोफिला ऊतकों में इस परख का इस्तेमाल किया है कि प्रकाशित कागजात के केवल एक मुट्ठी वर्तमान में कर रहे हैं। यह ड्रोसोफिला समुदाय को पीएलए के आगे लोगों तक पहुंचाने के अन्य, अधिक आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays के पूरक करने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में अपनी वृद्धि हुई उपयोग में परिणाम होगा कि आशा व्यक्त की है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

जंगली प्रकार तीसरे instar लार्वा NMJs में, dlg मुख्यतः प्रकार BOUTONS की तुलना dlg immunoreactivity स्तरों प्रकार आईबी BOUTONS में अधिक स्पष्ट होने के साथ, प्रकार मैं glutamatergic BOUTONS के पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में पाया जाता है (चित्रा 3 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

की जांच<em&gt; बगल में</emपर&gt; प्रोटीन प्रोटीन परिसरों<em&gt; ड्रोसोफिला</emनिकटता Ligation परख का उपयोग&gt; लारवल neuromuscular जंक्शन

इस प्रोटोकॉल निकटता Ligation परख ड्रोसोफिला लार्वा neuromuscular जंक्शन पर सीटू प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दर्शाता है। इस तकनीक के साथ, डिस्क बड़े और हू-ली ताई शाओ पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षेत्र में एक जटिल, पहले सह immunoprecipitation के माध्यम से पहचान की एक एसोसिएशन बनाने के लिए दिखाए जाते हैं।

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

3 में लारवल कमानी नसों के विज़ुअलाइज़ेशन तीसरी Instar ड्रोसोफिला लारवल तैयारी

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

ड्रोसोफिला लारवल कमानी axons के भीतर Synaptic vesicles के vivo विज़ुअलाइज़ेशन

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

विच्छेदन में सक्रिय जोन इमेजिंग ड्रोसोफिला Neuromuscular जंक्शन

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

अनुक्रमिक neuromuscular जंक्शन पर एकल श्वान कोशिकाओं को चित्रित फोटो विरंजन

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

क्यों मात्रा मामला: phenotypes की विशेषता पर<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लारवल neuromuscular जंक्शन

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular जंक्शन कार्यक्षमता को मापने

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

के उच्च throughput और मल्टी पैरामीट्रिक मात्रा के लिए दो एल्गोरिदम<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Neuromuscular जंक्शन आकृति विज्ञान

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila लार्वा Neuromuscular जंक्शन से Synaptic धाराओं की फोकल Macropatch रिकॉर्डिंग

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

विच्छेदन और ड्रोसोफिला वयस्क पैर के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक पहचाने गए मोटर न्यूरॉन के लिए न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर परिवर्तनों का पता लगाने के लिए

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...