Name: detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Agradecemos a la Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar reservas de la mosca. También agradecemos al hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco y el Dr. Lynn Cooley (Universidad de Yale) para proporcionar anticuerpos. Un agradecimiento especial a AhHyun Yoo por su ayuda en el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (Krieger), el William y Fondo de acero Isabelle Ada (Krieger), y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (Harden).

1. Cuerpo Preparación de la pared NOTA: Preparación de tercer estadio larval paredes del cuerpo (para el estudio de los NMJs que inervan los músculos de la pared corporal) se realizó como se ha descrito previamente en Brent et al 10, o Ramachandran y Budnik 11,12, pero con algunas modificaciones.. <ol><li> Disección <ol><li> Elevar las existencias de moscas y cruces a 25 ° C durante cinco o seis días, utilizando procedimientos estándar 1...

<ol>
	<li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions.">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li><li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Lgl/Dlg/Scribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction,+polarity+and+growth.">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li><li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li><li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses:+benefits+and+limitations.">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li><li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adducin:+structure,+function+and+regulation.">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane.">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Brent, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis.">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li><li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hts/Adducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination.">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li><li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li><li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+p21-Activated+Kinases.">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li><li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity:+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation.">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li><li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+structural+and+functional+synapse+development:+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology.">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li><li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development.">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+forest+tree+by+tree:+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences.">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li></ol>

Este informe demuestra cómo PLA se puede aplicar a la Drosophila larval NMJ. El ensayo se realizó en preparaciones de músculo de la pared corporal de larvas para el propósito de la detección de interacciones proteína-proteína endógenos presentes en la NMJ. Con esta técnica, Dlg y Hts se muestran a estar en estrecha proximidad entre sí, y por lo tanto existir en un complejo, específicamente en la región postsináptica 27. En apoyo de este resultado, un estudio previo ha proporcionado prueb...

Drosophila discos grandes (DLG) es un miembro conservada de la guanilato quinasa de la familia asociada a la membrana de andamios proteínas que ayudan a orquestar el ensamblaje de complejos de proteínas grandes en sitios específicos de la membrana plasmática. Originalmente identificado como una proteína supresora de tumores, Dlg sirve como un determinante importante de la polaridad epitelial 1,2,3 apicobasal. Dlg también sirve como un módulo de andamio importante en la unión neuromuscular (NMJ) de las neuronas motoras glutamatérgicas durante el desarrollo larvario 4. Dlg juega diversos papeles en la larval NMJ, y su pleiotropism se basa en su capacidad para asociarse con múltiples proteínas de 5,6. Una de estas proteínas es shao Hu-li tai (HTS), un homólogo de los mamíferos adducins que principalmente se han descrito en lo que respecta a sus funciones en la regulación de la actina-espectrina citoesqueleto 7. Previamente se ha demostrado que Dlg y Hts pueden formar un complejo con el uno al otro sobre la base de in vitro </em&gt; experimentos de co-inmunoprecipitación que participe toda adultos lisados ​​mosca 8. Una deficiencia de estos resultados, sin embargo, es que no indican donde este complejo formas. Con el uso de inmunohistoquímica, se observan las distribuciones de Dlg y Hts a superponerse en la membrana postsináptica de NMJs larvas, pero son en un complejo en esta región 8? Como se muestra recientemente y se detalla más adelante aquí, ligadura de ensayo de proximidad (PLA) se utiliza para buscar una en asociación situ entre Dlg y Hts específicamente en el larval NMJ 27. PLA es una técnica relativamente nueva se utiliza principalmente en las células y el tejido cultural que puede detectar interacciones proteína-proteína in situ 9. En este ensayo, los anticuerpos primarios contra las dos proteínas de interés se detectan con un par de anticuerpos secundarios específicos de especie, denominados sondas de PLA, que están conjugados a oligonucleótidos (Figura 1A, B). Si la proteína de doss están muy cerca entre sí (es decir, dentro de unas pocas decenas de nanómetros), la distancia entre las sondas PLA adjuntos puede salvarse a través de la hibridación de dos oligonucleótidos de conectores adicionales (Figura 1C). En esta conformación, los extremos libres de los oligonucleótidos de conector son lo suficientemente cerca para hacer contacto uno con otro, y una molécula de ADN circular cerrado se pueden formar sobre la ligadura en situ (Figura 1D). La molécula de ADN circular sirve como una plantilla para in situ amplificación por círculo rodante, que se prepara por uno de los oligonucleótidos conjugados con las sondas PLA (Figura 1E). Las secuencias dentro de la amplificado, producto de ADN resultante concatemeric entonces se pueden visualizar con, sondas de oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia (Figura 1f). Dado que el ADN amplificado permanece unida a una de las sondas de PLA, la localización subcelular de la interacción proteína-proteína withitejido na puede determinarse fácilmente. Varios métodos se usan comúnmente para detectar interacciones proteína-proteína incluyendo técnicas in vitro tales como co-inmunoprecipitación, ensayos de pull-down y la levadura de dos híbridos, y en técnicas in vivo tales como Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) y bimolecular de fluorescencia de Complementación ( BiFC). Un error de las técnicas in vitro es que no se identifican donde la interacción se produce de manera endógena, mientras que la mencionada en técnicas in vivo implican la expresión de proteínas de fusión artificial que puede no reflejar el comportamiento natural de sus homólogos endógenos. Una ventaja importante de PLA es que es capaz de determinar dentro de un tejido la localización subcelular de interactores de proteínas endógenas que se encuentran en estrecha proximidad entre sí y probablemente formando un complejo, con el grado de cercanía requerido para generar una señal comparable a FRET y BiFC. PLA puede detectar interacciones con alta especificidad y sensibilidad debido al acoplamiento de reconocimiento de anticuerpos y la amplificación de ADN. Por lo tanto, el ensayo puede generar, señales luminosas discretas en forma de puntos lagrimales que revelan la posición exacta de la interacción. Además, los antígenos apenas visibles pueden ser detectados. Finalmente, PLA es una técnica relativamente sencilla de realizar, y ya no tiene que un procedimiento inmunohistoquímico estándar para completar. Por lo tanto, PLA ofrece una ventaja técnica sobre otros ensayos de interacción proteína-proteína que a menudo se ven afectadas con largos tiempos de preparación y amplia solución de problemas. Este protocolo se muestra cómo PLA se puede aplicar a la Drosophila larval NMJ para el propósito de la detección de interacciones proteína-proteína endógenos in situ. Aquí, el PLA se realiza en preparaciones de músculo de la pared corporal larvarios donde se muestran Dlg y Hts de existir de hecho en un complejo en la región postsináptica de NMJs. PLA no se ha utilizado previamente para estudiar la larval NMJ, y existen en la actualidad sólo un puñado de trabajos publicados que han utilizado este ensayo en el tejido Drosophila. Se espera que una mayor exposición de PLA a la comunidad de Drosophila se traducirá en el aumento de su uso como una herramienta adicional para complementar otros ensayos de interacción proteína-proteína más comúnmente utilizados,.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

En los de tipo salvaje tercer instar NMJs larvales, Dlg es predominantemente encontrar en la membrana postsináptica de boutons glutamatérgicos tipo I, con niveles de inmunorreactividad Dlg siendo más pronunciada en boutons tipo Ib que el tipo es boutons (Figura 3) 4. Hts está presente en todo el músculo sino que se concentra en la región postsináptica con Hts niveles de inmunorreactividad aparece igual en ambos tipo I boutons, y también se encuentra presinápticamente (Figura ...

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Disección e inmunohistoquímica de la pierna adulta de Drosophila para detectar cambios en la unión neuromuscular de una neurona motora identificada

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...