Name: detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay
Uploaded: 2015-01-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Vi tackar Bloomington Drosophila Stock Center för att ge flugan bestånd. Vi tackar också utvecklingsstudier Hybridoma Bank och Dr Lynn Cooley (Yale University) för att tillhandahålla antikroppar. Ett särskilt tack går till AhHyun Yoo för hennes hjälp på manuskriptet. Detta arbete har finansierats med bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (Krieger), William och Ada Isabelle Steel Fund (Krieger), och den kanadensiska Institutes of Health Research (Harden).

1. Body Wall Förberedelse OBS: Beredning av tredje stadiet larver kroppsväggar (för studier av de NMJs som innerverar kroppen väggen muskler) utfördes som tidigare beskrivits i Brent et al 10, eller Ramachandran och Budnik 11,12, men med vissa modifieringar.. <ol><li> Dissektion <ol><li> Höj gylflager och korsningar vid 25 ° C under 5-6 dagar under användning av standardförfaranden 13. </li><li> Plocka krypa tredje stadiet larver ...

<ol>
	<li>Woods, D. F., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+discs-large+tumor+suppressor+gene+of+Drosophila+encodes+a+guanylate+kinase+homolog+localized+at+septate+junctions.">The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions.</a> Cell. 66, 451-464 (1991).</li><li>Yamanaka, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Lgl/Dlg/Scribble+in+the+regulation+of+epithelial+junction,+polarity+and+growth.">Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth.</a> Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13, 823-835 (1994).</li><li>Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolding+proteins+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).</li><li>Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+as+a+model+for+scaffold+complexes+at+glutamatergic+synapses:+benefits+and+limitations.">The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations.</a> J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).</li><li>Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adducin:+structure,+function+and+regulation.">Adducin: structure, function and regulation.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+adducin+regulates+Dlg+phosphorylation+and+targeting+of+Dlg+to+the+synapse+and+epithelial+membrane.">Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane.</a> Dev Biol. 357, 392-403 (2011).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ovhts+polyprotein+is+cleaved+to+produce+fusome+and+ring+canal+proteins+required+for+Drosophila+oogenesis.">The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis.</a> Development. 134, 703-712 (2007).</li><li>Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hts/Adducin+controls+synaptic+elaboration+and+elimination.">Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination.</a> Neuron. 69, 1114-1131 (2011).</li><li>Spradling, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project:+Single+P-element+insertions+mutating+25%+of+vital+Drosophila+genes.">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153, 135-177 (1999).</li><li>Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+p21-Activated+Kinases.">Biology of the p21-Activated Kinases.</a> Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).</li><li>Bahri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leading+edge+during+dorsal+closure+as+a+model+for+epithelial+plasticity:+Pak+is+required+for+recruitment+of+the+Scribble+complex+and+septate+junction+formation.">The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation.</a> Development. 137, 2023-2032 (2010).</li><li>Albin, S. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+structural+and+functional+synapse+development:+postsynaptic+p21-activated+kinase+independently+specifies+glutamate+receptor+abundance+and+postsynaptic+morphology.">Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology.</a> J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).</li><li>Koles, K., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+neuromuscular+junction+development.">Wnt signaling in neuromuscular junction development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111, 319-330 (2002).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Maglione, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+forest+tree+by+tree:+super-resolution+light+microscopy+meets+the+neurosciences.">Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences.</a> Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).</li></ol>

Denna rapport visar hur PLA kan tillämpas på Drosophila larv NMJ. Analysen utförs på larvkroppen vägg muskelpreparat i syfte att upptäcka endogena protein-proteininteraktioner närvarande vid NMJ. Med denna teknik är Dlg och Hts visat sig vara i nära anslutning till varandra, och därmed existera i en komplex, speciellt på den postsynaptiska regionen 27. Till stöd för detta resultat, har en tidigare studie bevisat att de tillsammans med följande uppgifter: 1) de immunreaktiva distribution...

Drosophila Skivor stora (Dlg) är en konserverad medlem av membranassocierat guanylat kinasfamiljen av byggnadsställningar proteiner som hjälper iscensätta montering av stora proteinkomplex vid specifika ställen i plasmamembranet. Ursprungligen identifieras som ett tumörsuppressorprotein, tjänar Dlg som en viktig faktor för epitelial apicobasal polaritet 1,2,3. Dlg fungerar också som en viktig byggnadsställningar modul vid den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) av glutamaterga motoriska nervceller under larvutveckling 4. Dlg spelar olika roller på larv NMJ, och dess pleiotropism förlitar sig på sin förmåga att associera med flera proteiner 5,6. Ett sådant protein är Hu-li tai shao (HTS), en homolog till de däggdjurs adducins som främst har beskrivits i fråga om att deras roller i regleringen av aktin-spek cytoskelettet 7. Det har tidigare visats att Dlg och Hts kan bilda ett komplex med varandra som bygger på in vitro </em&gt; co-Immunutfällningsexperiment involverar hela vuxna flyga lysat 8. En brist av dessa resultat, är emellertid att de inte anger där denna komplexa former. Med användning av immunohistokemi, är fördelningarna av Dlg och Hts observerats att överlappa på det postsynaptiska membranet av larv NMJs, men är de i ett komplex i denna region 8? Som nyligen visat och beskrivs ytterligare här, är Proximity Ligation Assay (PLA) används för att leta efter en in situ samband mellan Dlg och Hts specifikt på larver NMJ 27. PLA är en relativt ny teknik som används mestadels i cell- och vävnadskultur som kan detektera protein-proteininteraktioner in situ 9. I denna analys är primära antikroppar mot de två proteiner av intresse detekteras med ett par av artspecifika sekundära antikroppar, benämnda PLA prober, vilka är konjugerade till oligonukleotider (Figur 1A, B). Om två-proteinets är i nära anslutning till varandra (dvs inom några tiotal nanometer), avståndet mellan de bifogade PLA sonder kan överbryggas genom hybridisering av ytterligare två oligonukleotider anslutnings (Figur 1C). I denna konformation, de fria ändarna av oligonukleotider kontaktdons är tillräckligt nära för att få kontakt med varandra, och en sluten cirkulär DNA-molekyl kan bildas vid in situ ligering (figur 1D). Den cirkulära DNA-molekylen tjänar som en mall för in situ rullande cirkel-amplifiering, som laddas genom att en av de oligonukleotider som är konjugerade till PLA prober (figur 1E). Sekvenser inom den erhållna amplifierade, concatemeric DNA-produkt kan sedan visualiseras med fluorescensmärkta, komplementära oligonukleotidsonder (figur 1F). Eftersom det förstärkta DNA förblir fäst till ett av PLA sonder, subcellulära lokalisering av protein-proteininteraktion withina vävnad kan lätt fastställas. Flera metoder används allmänt för att detektera protein-proteininteraktioner, inklusive in vitro-tekniker såsom sam-immunutfällning, pull-down-analyser och jäst två-hybridscreening, och in vivo-tekniker såsom Förster resonansenergiöverföring (FRET) och Bimolecular Fluorescens Komplettering ( BiFC). En fallgrop av de tekniker in vitro är att de inte identifiera var interaktionen endogent förekommande, medan den tidigare nämnda in vivo tekniker innebär den konstgjorda uttryck av fusionsproteiner som inte kan återspegla det nativa beteendet hos sina endogena motsvarigheter. En stor fördel med PLA är att det är i stånd att bestämma i en vävnad subcellulära lokalisering av endogena protein Interactmedlemmar som är i omedelbar närhet till varandra och sannolikt bildar ett komplex, med graden av närhet krävs för att generera en signal som är jämförbar till FRET och BiFC. PLA kan detektera interaktioner med hög specificitet och känslighet på grund av koppling av antikropps-igenkänning och DNA-amplifiering. Således kan analysen generera diskreta, ljusa signaler i form av puncta som avslöjar den exakta positionen för interaktionen. Dessutom kan knappast synliga antigener detekteras. Slutligen är PLA en relativt enkel teknik för att utföra, och det tar längre tid än en vanlig immunhistokemisk förfarande för att slutföra. Därför ger PLA en teknisk fördel jämfört med andra protein-proteininteraktioner analyser som ofta plågas med långa förberedelsetider och omfattande felsökning. Detta protokoll visar hur PLA kan appliceras på Drosophila larv NMJ i syfte att detektera endogena protein-proteininteraktioner in situ. Här är PLA utförs på larvkroppen vägg muskelpreparat där Dlg och Hts visar sig faktiskt existera i en komplex på den postsynaptiska regionen av NMJs. PLA har inte tidigare använts för att studera larver NMJ, och det finns i dagsläget bara en handfull publicerade artiklar som har använt denna analys i Drosophila vävnad. Förhoppningen är att ytterligare exponering av PLA till Drosophila samfundet kommer att leda till att en ökad användning som ett kompletterande verktyg för att komplettera andra, mer allmänt använda protein-proteininteraktioner analyser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

I vildtyp tredje stadiet larver NMJs är Dlg övervägande finns på postsynaptiska membran av typ I glutamaterga boutons, med Dlg Immunoreaktivitet nivåer är mer uttalad i typ IB boutons än typ Är boutons (Figur 3A) 4. Hts är närvarande under hela muskeln utan koncentrerar vid postsynaptiska regionen med Hts immunreaktivitet nivåer som förekommer lika i både typ I boutons, och finns även presynaptiskt (Figur 3A &#39;) 8,17. Observera att fördelning av D...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detektion av<em&gt; In situ</em&gt; Protein-proteinkomplex på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larv Neuromuskulära förbindelsen Använda Proximity Ligation Assay

Detta protokoll visar hur Proximity Ligation Assay kan användas för att upptäcka in situ protein-proteininteraktioner på Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen. Med denna teknik är Skivor stora och Hu-li tai shao visat att bilda ett komplex vid postsynaptiska regionen, en sammanslutning som tidigare identifierats genom co-immunoprecipitation.

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualisering av Larvernas segment nerver i 3 RD Instar Drosophila Larvernas Förberedelser

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualisering av Synaptic Blåsor Inom Drosophila Larvernas segment Axoner

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissekering och Imaging av Active Zoner i Drosophila Neuromuskulära förbindelsen

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekventiell fotoblekningsreaktion att avgränsa Single Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Mäta neuromuskulära förbindelsen funktionalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Två algoritmer för hög kapacitet och Multi-parametrisk Kvantifiering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskulära förbindelsen Morfologi

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch inspelningar av Synaptic strömmar från den Drosophila Larval neuromuskulära förbindelsen

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissekering och immunohistokemi av Drosophila Vuxen ben för att upptäcka förändringar vid neuromuskulära korsningen för en identifierad motor neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...