Name: detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Ethische verklaring: De-geïdentificeerde menselijke weefsels en plasma monsters werden verkregen van Hendrick Medical Center onder een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. 1. Toevoeging van gebiotinyleerd antilichaam OPMERKING: Monitoring van deze stap is optioneel. Zie alternatief protocol als niet te bewaken. <ol><li> Te verkrijgen in de handel verkrijgbare avidine afgeleide gecoate platen (zie materialen en apparatuur tabel). </li><li> Voeg 50 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2 putjes. OPMERKING: Preincubate PBS bij 28 ° C tot gerelateerd resonantie verschuivingen minimaliseren. </li><li> Open bioassay scanner software en volg de Setup Wizard om de experimentele procedure die selectie van blanks, standaarden en monsters in de plaat lay-out, temperatuurinstelling (28 ° C), het aantal scans per minuut inclusief define (1), en de lengte van het experiment ( 150 min om tegemoet te preparatieve stappen). </li&gt; <li> Plaats de bereide testplaat in het label vrij bioassay scanner en start de eerste scan. Toen de eerste scan is voltooid, selecteert &quot;self verwijzing te starten&quot;. De basislijn is de eerste reeks scans verzameld op het begin van het experiment. Als dit de eerste lezen uitgevoerd op deze specifieke plaat, zodat de scanner werking temperatuur evenwicht en elimineren drift baseline. Zie figuur 2 voor een screenshot van een baseline, gevolgd door toevoegen van een monster. </li><li> Nadat de basislijn gestabiliseerd, althans 5 scans, pauzeren lezen en uitwerpen van de plaat. </li><li> Verwijder PBS door het storten in de gootsteen en voeg 50 ul RL21A gebiotinyleerd antilichaam bij [10 ug / ml in PBS pH 7,2] alles behalve controle wells. Voeg 50 pl PBS om de controleputjes. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen totdat verzadiging bereikt is, ongeveer 1,5 uur. </li><li> Pauzeer de lees- en uitwerpen van de plaat. </li><li> Was de<html> plaat 3 maal met 200 ul / putje fosfaatgebufferde zoutoplossing + 0,05% Tween 20 (PBST), gevolgd door 3 spoelingen met 200 ul / putje PBS pH 7,2. Herhaal met PBS. Tik overtollige PBS van de plaat op keukenpapier voorafgaand aan het verplaatsen naar de volgende stap. OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op een automatische plaatwasser of was de plaat 3 maal met 200 pi PBST door storten vloeistof in een gootsteen en het vervangen van PBST met een pipet. </li><li> Voeg 50 ul PBS pH 7,2 tot alle actieve putjes. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen te controleren post-wash resonantie. </li><li> Stop de lees- en uitwerpen van de plaat. </li></ol> Alternatieve protocol voor Stap 1: <ol start="13"><li> Voeg 50 ul RL21A gebiotinyleerd antilichaam bij [10 ug / ml PBS] aan alle putjes. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de plaat 3 maal met 200 ul / putje PBST, gevolgd door 3 spoelingen met 200 ul / putje PBS zoals in stap 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Toevoeging van analyt <ol><li> Verwijder de PBS en voeg 50 ul per putje van geschikte testbuffer. Voor deze test werd de handel verkrijgbare normaal menselijk serum gebruikt 1:20 verdund in PBS. </li><li> Open bioassay scanner software en volg de installatiewizard om experimentele procedure te definiëren. </li><li> Plaats de plaat in de bioassay scanner en beginnen met een baseline te lezen. Als dit de eerste lees- uitgevoerd op dit specifieke bord, laat de scanner draaien om de temperatuur in evenwicht komen en te elimineren drift in baseline. </li><li> Nadat de basislijn gestabiliseerd, althans 5 scans, pauzeren lezen en uitwerpen van de plaat. </li><li> Verwijder de testbuffer uit de putjes. </li><li> Spike controles met HLA A * 02: 01 monomeer lager relevante (FLSL) of irrelevant (SLLV, YLEV, of KVL) peptiden in concentraties die variëren van [,625-10 ug / ml] in assaybuffer. Voeg 50 ul van normen de controle putjes van de plaat </li><li> Voeg 50 ul van analyt in assaybuffer het monsterputjes van de plaat. Voor deze test spiked handel verkrijgbaar humaan serum werd gebruikt. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen totdat verzadiging is bereikt, ongeveer 30-60 min. </li><li> Pauzeer de lees- en uitwerpen van de plaat. </li><li> Was de plaat 3 maal met 200 ul / putje PBST, gevolgd door 3 spoelingen met 200 ul / putje PBS zoals in stap 1.9. </li><li> Voeg 50 ul assaybuffer alle actieve putjes. </li><li> Plaats de plaat terug in de bioassay scanner en hervat het lezen te controleren post-wash resonantie. </li><li> Stop de lees- en uitwerpen van de plaat. OPMERKING: De testbuffer kunnen PBS, weefselcultuur of humaan serum 1:20 verdund in PBS, afhankelijk van het doel van de assay. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Analyseren met behulp van de bioassay scanner software of exporteren ruwe data bestanden naar de voorkeur van statistische analyse software. De bioassay scanner software genereert de binding curve gebaseerd op het automatischplaatindeling verstrekt tijdens experimentele opstelling. OPMERKING: Als het niet gebruiken van de biologische scanner software voor analyse, volgt u de stappen 3,2-3,4. </li><li> Aftrekken van de basislijn en de negatieve controle van elke volgende data punt. </li><li> Bereken het gemiddelde en de standaardafwijking voor duplo putjes op elk tijdstip. </li><li> Genereren van een grafiek van de bindende curve of selecteer eindpunt gegevens voor staafdiagrammen. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

De auteurs, Debra Wawro Weidanz en Robert Magnusson, respectievelijk Chief Executive Officer en Chief Technology Officer bij Resonant Sensoren Incorporated, die de biologische plaat lezer en assayplaten gebruikt in dit artikel oplevert.

De werkwijze die hierin beschreven introduceert een biomarker screening systeem voor de diagnostiek van kanker die een snelle detectie van oplosbare peptide / HLA-complexen in de patiënt serum, plasma, urine of speeksel in staat zou stellen in een high throughput 96- of 384-wells-formaat. Dit testsysteem gebruikmakend van de T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen en een ongelabelde detectiesysteem snijdt de analyse tot minder dan 1 uur in vergelijking met 3,5 uur met conventionele ELISA. Deze high-throughput aanpak maakt een snelle stratificatie van patiënten met klinische proeven voor therapeutische vaccins tegen kanker of biofarmaceutica. Huidige werkwijzen voor de detectie van deze ziekte doelen vereisen affiniteitszuivering en HPLC-MS / MS van individuele patiëntenmonsters, een omslachtig en tijdrovend proces. Hoewel deze methode is vatbaar voor conventionele ELISA-technieken is er bezorgdheid dat secundaire detectie reagentia zoals de anti-β2-microglobuline antilichaam de structuur van de ontluikende HL kunnen wijzigenEen molecuul en remt binding aan de TCRm beperken detectie. Label-free detectie verlicht deze zorgen. Deze procedure kan worden aangepast voor gebruik op andere labelvrije systemen zoals oppervlakte plasmon resonantie systeem. Dit zou echter sterk verminderen de hogere doorvoer mogelijkheden in vergelijking met de bioassay systeem gebruikt in deze studie. Dit protocol kan effectief worden aangepast voor de detectie van niet-HLA biomarkers patiënt serum en plasma met volgen van een paar kritische stappen. Controle van de oorspronkelijke antilichaam bekledingsproces wordt aanbevolen voor optimalisering van het oppervlak, als &lt;200 pm verschuiving zal waarschijnlijk resulteren in lage signaal voor de daaropvolgende detectiestap. De basislijn en post-wash leest bruikbaar voor de eindpuntanalyse de overvloed aan serumeiwitten binding van lage concentratie analyt kan maskeren. Ten slotte kan de temperatuur variatie van de monsters resulteren in goed om goed variatie. Het wordt aanbevolen dat alle monsters vooraf worden geïncubeerd eend het label gratis biosassay eenheid temperatuurregelaar worden ingesteld op 2-3 ° C boven kamertemperatuur. Gekoelde stalen moeten worden toegestaan ​​genoeg tijd om de bedrijfstemperatuur te bereiken. Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal multiplexing van TCRm op de plaat oppervlak. De bioassay systeem nog vatbaar spotten van putjes met een dichtheid van ten minste 8-plex. Door de introductie van 4-8 TCRm aan elk putje, per monster volumes worden verminderd en kan de collectie van steeds complexere gegevens per patiënt. Deze mogelijkheid zou kunnen patiënten verder te informeren met betrekking tot de therapeutische opties.

De klasse I menselijk leukocyt antigeen (HLA) monsters peptiden van 8-11 aminozuren in lengte afgeleid uit de proteasomale degradatie van het intracellulaire eiwit repertoire en presenteert deze peptiden op het oppervlak van een kernhoudende cel 1,2. De HLA-complex is &quot;biomarker van de natuur&quot;, met vermelding van de gezondheid van elke cel (figuur 1) om circulerende cytotoxische T-lymfocyten (CTL). Erkenning van de ziekte geassocieerd peptiden resulteert in verwijdering van de gewraakte cel door CTL. Dus de adaptieve immuunreactie is zeer effectief bij het elimineren van virale infectie en tumor. Echter, het immuunsysteem druk uitoefent die vaak bevordert keuze voor virussen of tumoren kunnen ontwijken een effectieve CTL respons. T-cel receptor nabootsen (TCRm) monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek peptide / HLA-A * 02 herkennen 01 complexen zoals die afgeleid van borstkanker geassocieerde eiwitten, macrofaagmigratie remmende factor (MIF19-27) 3 en NY-ESO-1 157-165, maken detectie en vernietiging van borstkankercellen in afwezigheid van een effectieve anti-tumor CTL respons 4,5. Deze vertegenwoordiger werk is gericht op het HLA-A * 0201 molecuul, die wordt uitgedrukt tot 30% van de bevolking. De identificatie van andere relevante HLA / peptide-complexen, gevolgd door de productie van TCRm maakt de ontwikkeling van gerichte immuuntherapie en companion diagnostica, uitbreiden van de bruikbaarheid van dit werk een veel bredere populatie. Een deel van het peptide / HLA-complexen gebonden voor het celoppervlak wordt vrijgegeven in het plasma. Vanwege de zeer complexe aard van peptide / HLA zwembaden, de huidige methoden voor de mijnbouw de immunopeptidome voor HLA geassocieerd biomarkers zijn tijdrovend. Dit proces vereist de affiniteitszuivering van oplosbare HLA uit het plasma scheiden van HLA geassocieerde peptiden met omgekeerde fase hogedrukvloeistofchromatografie(RP-HPLC) en peptide sequentiebepaling door tandem massaspectrometrie (MS / MS) 6,7. Hoewel deze werkwijze een haalbare optie voor de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten is een moeizaam proces als gezelschap diagnostisch hulpmiddel voor HLA bijbehorende doelen reeds in de therapeutisch vaccin of biofarmaceutische pijpleiding 8-10. TCRm tegen de targets bieden de instrumenten voor snelle companion diagnostics ontwikkeling gericht op stratificatie patiënten in relevante klinische studies en meer gefundeerde therapeutische opties. In dit werk wordt een doorbraak biomarker screening systeem voor de diagnostiek van kanker gepresenteerd die TCRm en een label-free bioassay systeem dat de biologische interacties met minimale stappen-monitors gebruikt. De ongelabelde bioassay is gebaseerd op een werkwijze, waarbij de geleide-modus resonantie (GMR) effect dat optreedt diëlektrische golfgeleider roosters 11-14 gebruikt. Toen breedband licht contact met de diffractierooster in de voor dit systeem platen worden twee specifieke golflengten gereflecteerd. De binding interactie tussen een geïmmobiliseerde receptor en zijn ligand wordt gevolgd in real time door het volgen van de resonantie golflengteverschuiving met een spectrum analyzer 12. Afzonderlijke resonantiepieken voordoen bij incident TE (elektrische vector loodrecht op het vlak van inval) en TM (magnetische vector loodrecht op het vlak van inval) polarisatietoestanden verschaffen van meerdere gegevenspunten die potentieel kan verhogen detectienauwkeurigheid 11,14. Met behulp van antilichaam pre-gesensibiliseerd platen in dit label-free testsysteem, de test run tijd met data-analyse is ongeveer 45 min. Bovendien kunnen meerdere patiëntmonsters worden opgevraagd in een 96- of 384 putjes, een duidelijk voordeel over een HPLC-MS / MS-gebaseerd formaat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Volgens de American Cancer Society, meer dan 200.000 vrouwen worden gediagnosticeerd met invasieve borstkanker elk jaar ongeveer 40.000 zullen sterven aan de ziekte. Het menselijk leukocyt antigeen (HLA) klasse I monsters peptiden afgeleid van proteasomale afbraak van cellulaire eiwitten en presenteert deze fragmenten op het celoppervlak voor ondervraging door circulerende cytotoxische T-lymfocyten (CTL). Vorming van T-cel receptor nabootsen (TCRm) monoklonale antilichamen (mAbs) die borstkanker herkennen specifiek peptide / HLA-A * 02: 01 complexen zoals die afgeleid van macrofaagmigratie remmende factor (MIF 19-27) en NY-ESO- 1 157-165 inschakelen detectie en vernietiging van borstkankercellen in afwezigheid van een effectieve anti-tumor CTL respons. Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door borstkankercellen en vertegenwoordigen potentieel relevante kanker biomarkers. In dit werk, een doorbraak biomarker screening voor kanker diagnostisches opnemen van T-cel receptor na te bootsen monoklonale antilichamen in combinatie met een nieuw, label-free biosensor gebruik te maken van geleide-modus resonantie (GMR) sensortechnologie wordt gepresenteerd. Detectie van loods MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 celsupernatanten, spiked humaan serum en plasma van de patiënt wordt aangetoond. De impact van dit werk kon gepersonaliseerde geneeskunde een revolutie door de ontwikkeling van de ziekte companion diagnostics voor gerichte immuuntherapie.

Een representatieve reeks experimenten werd uitgevoerd met de goed gekarakteriseerde TCRm, RL21A, een murine IgG2a monoklonaal antilichaam dat specifiek een peptide (MIF 19-27 of FLSL) in de context van het HLA-A * 02: 01 molecule 3. De verwante peptide / HLA monomeer en irrelevant HLA monomeer 15 werd gebruikt om de procedure te tonen. Figuur 3 illustreert de testformaat. RL21A is specifiek voor de FLSL / HLA monomeer met weinig kruisreactiviteit met andere peptide / HLA complexen 3. Deze specificiteit wordt geïncorporeerd met de labelvrije bioassay (zie figuur 4). De gevoeligheid van het label vrij bioassay voor dit experiment in de lage nanomolaire bereik zoals bepaald door titratie van de RL21A antilichaam op geïmmobiliseerde FLSL / HLA monomeer (figuur 5). Hoewel het achtergrondsignaal significant verhoogd in serummonsters, sSPECIFIEKE detectie van FLSL / HLA monomeer spiked humaan serum bereikt in figuur 6 en een concentratiegradiënt gemakkelijk waarneembaar in deze monsters. Tenslotte supernatanten van de MDA-MB-231 cellijn, waarvan eerder is aangetoond de FLSL / HLA-A * 02 voorstellen: 01 molecule, getoond oplosbare FLSL monomeer bevatten met dit label vrij assay platform (figuur 7). Na toevoeging van FLSL / HLA monomeer verhoogt het signaal op RL21A (figuur 7). Vanwege de gevoeligheid van het systeem, goed goed variatie om negatieve resonantie verschuivingen kunnen optreden als gevolg van temperatuurschommelingen gezien als functie van de standaardafwijkingen in de figuren 4 en 5. Deze variaties kunnen drastisch worden verminderd door pre-incubatie van alle monsters en de bioassay plaatlezer bij een temperatuur in geringe overmaat kamertemperatuur (bijvoorbeeld 28 ° C). In figuur 8 kort 96-Goed polystyreen platen werden bekleed met [10 ug / ml] van RL21A gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gewassen met PBST, geblokkeerd met 0,5% magere melk, gewassen met PBST en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met seriële verdunningen van FLSL HLA monomeer in normaal menselijk serum 1:10 verdund in PBS tot een standaardcurve of patiënt plasma 1:10 verdund in PBS. De plaat werd gewassen met PBST, 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur met konijn anti-humaan β2-microglobuline [1: 5000] aan intacte HLA detecteren en gewassen in PBST. De platen werden vervolgens gedurende 30 minuten met geit anti-konijn IgG [1: 10.000] en gewassen met PBST. Colorimetrische detectie werd uitgevoerd met ABTS (2,2&#39;-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur] -diammonium zout) substraat met een 15 min incubatietijd en waargenomen bij 405 nm op een microplaat lezer. FLSL / HLA werd ontdekt in drie monsters van patiënten. In figuur 8B, werd patiënt plasma RL.064 1:20 verdund in PBS en voeged aan de plaat en bewaakt de labelvrije detector gedurende 60 min. Specifieke detectie van FLSL / HLA complex patiënt serum werd bereikt. Student&#39;s t test werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,05). In figuur 8C werden coupes gekleurd bij 1 ug / ml met muizen anti-HLA-A2 (BB7.2) als een positieve controle, RL21A, IgG2b en IgG2a respectievelijk als negatieve controles. Kleuring werd gedetecteerd met een anti-muis detectiekit, DAB (diaminobenzadine) en hematoxyline QS nucleaire kleuring zoals aangegeven door de fabrikant. Kleuring van tumorweefsel door RL21A bevestigt presentatie van FLSL / HLA-complexen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. Tumor antigeen presentatie door de klasse I menselijk leukocyt antigen Cancerous transformatie is een intracellulaire stoornis. HLA monster intracellular eiwitten en onthullen kankergerelateerde veranderingen op het celoppervlak. CTL en TCRm zijn in staat om kankercellen te herkennen door middel van HLA-peptide complexen onderscheiden om die cellen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figuur 2:. Screenshot van data voor de biologische scanner software Voorbeeld data acquisitie die de oorspronkelijke basislijn scan gevolgd door RL21A antilichaam Naast een plaat bekleed met 10 ug / ml FLSL / HLA complex. Concentraties van antilichaam zijn zoals aangegeven. Elke regel staat voor een individu goed de tijd gevolgd. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figuur 3:. Test uitvoering illustratie van antilichamen geïmmobiliseerd op de diffractieve roosteroppervlak van de testplaat vastleggen relvante peptide / HLA-complexen in oplossing. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figuur 4: Specificiteit van RL21A voor FLSL / HLA complex Demonstratie van de specificiteit van gebiotinyleerd RL21A TCRm voor haar relevante (FLSL) HLA-monomeer in vergelijking met irrelevante HLA monomeer (YLEV, SLLV en KVL).. Gebiotinyleerde RL21A TCRm [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak avidine gecoat en detectie werd uitgevoerd met ongelabelde relevant of irrelevante HLA monomeer [10 ug / ml] in PBS. RL21A was specifiek voor FLSL / HLA Complex. Two-way ANOVA werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,001). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figuur 5:. Binding gevoeligheid van RL21A zijn verwant peptide / HLA complex Illustratie van de detectiop de limiet en bindende gevoeligheid van RL21A aan de FLSL / HLA-complex. Gebiotinyleerd HLA Monomeer FLSL [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak ongemerkt RL21A werd aan de plaat toegevoegd seriële verdunningen in PBS aangegeven. Detectie voor dit systeem was in de lage nanomolaire bereik. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figuur 6: Detectie van HLA Complexen in Spiked Human Serum Demonstratie van de detectie van HLA in humaan serum.. Gebiotinyleerde RL21A TCRm [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak avidine gecoat. Samengevoegd normaal humaan serum verrijkt met relevante (FLSL) of irrelevant (SLLV) HLA monomeer werd 1:20 verdund in PBS en vervolgens aan de plaat toegevoegd en bewaakt de labelvrije detector gedurende 60 min. Specifieke detectie van FLSL / HLA complex in humaan serum werd uitgevoerd. In het algemeen, achtergrond signaal (irrelevante SLLV monomeer) is hooger voor verdunde serummonsters tegenover gezuiverd analyten in PBS (zie figuur 4). Two-way ANOVA werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,0001). <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figuur 7:. Borstkanker celkweek supernatanten oplosbare HLA complexen gedetecteerd Het vermogen om HLA detecteren borstkanker celsupernatanten aangetoond. Gebiotinyleerde RL21A TCRm, RL9A TCRm (negatieve controle), en een isotypecontrole werden geïmmobiliseerd op de testplaat oppervlak. Spiked [5 pg / ml] en-verrijkte MDA-231 celkweek supernatanten werden toegevoegd en binding werd gedurende 60 min op de labelvrije detector. FLSL en SLLV HLA monomeer spiked samples vertegenwoordigen positieve controles voor RL9A en RL21A bindend. One-way ANOVA werd uitgevoerd met grafische en statistische software (p &lt;0,0001). Figuur 8:. Specifieke detectie van FLSL / HLA complexen in patiëntmonsters (A) Traditionele Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) werd gebruikt om FLSL / HLA specifieke complexen detecteren patiënt plasma. (B) gebiotinyleerd RL21A TCRm of IgG2a [10 ug / ml] werd geïmmobiliseerd op het avidine testplaat. (C) Borst tumorweefsel van patiënten RL.064 werd gekleurd zoals eerder beschreven 3 tot tumor presentatie van de FLSL / HLA-complexen te controleren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door kankercellen, wat neerkomt op een potentieel relevante kanker biomarker. Met behulp labelvrije sensortechnologie en T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen, detectie van stal MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 cel supernatanten, spiked humaan serum en plasma van een patiënt wordt aangetoond, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe kankertherapie diagnostisch platform.

Detectie van Humaan leukocytenantigeen Biomarkers bij Borstkanker Gebruikmakend-Label gratis biosensortechnologie

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...