Name: detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Déclaration éthique: échantillons tissus dépersonnalisés et de plasma humains ont été obtenus à partir de Hendrick Medical Center en vertu d&#39;un Institutional Review Board protocole approuvé. 1. Ajout d&#39;anticorps biotinylé REMARQUE: surveillance de cette étape est facultative. Voir protocole alternatif si ce ne est suivi. <ol><li> Obtenir dérivés des plaques revêtues d&#39;avidine disponibles dans le commerce (voir tableau Matériaux et équipement). </li><li> Ajouter 50 ul solution saline tamponnée de phosphate (PBS) pH 7,2 à puits. REMARQUE: préincuber PBS à 28 ° C pour minimiser les changements de température de résonance liés. </li><li> Ouvrez le logiciel du scanner d&#39;essai biologique et suivez l&#39;assistant de configuration pour définir la procédure expérimentale qui comprend la sélection d&#39;ébauches, des normes et des échantillons dans le plan de plaque, réglage de la température (28 ° C), le nombre de pages par minutes (1), et la durée de l&#39;expérience ( 150 min pour accueillir des étapes de préparation). </li&gt; <li> Insérez la plaque d&#39;essai préparé dans l&#39;étiquette bio-essai gratuite scanner et démarrer le premier balayage. Lorsque la première analyse est terminée, sélectionnez «auto-référence pour commencer&quot;. La ligne de base est la première série d&#39;analyses recueillies au début de l&#39;expérience. Si ce est la première lecture effectuée sur cette plaque spécifique, permettre au scanner de fonctionner pour équilibrer la température et éliminer la dérive dans la ligne de base. Voir Figure 2 pour une capture d&#39;écran d&#39;une ligne de base suivi par l&#39;addition de l&#39;échantillon. </li><li> Après la ligne de base est stabilisé, ou au moins cinq analyses, mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Retirer PBS par le dumping dans l&#39;évier et ajouter 50 ul RL21A anticorps biotinylé au [10 pg / ml dans du PBS pH 7,2] à tous, mais les puits de contrôle sur la plaque. Ajouter 50 ul de PBS dans les puits de contrôle. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture jusqu&#39;à saturation, environ 1,5 h. </li><li> Mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Laver le<html> plaque 3 fois avec 200 pl / puits de solution saline tamponnée au phosphate + 0,05% de Tween 20 (PBST), suivi par trois rinçages avec 200 pl / puits de PBS pH 7,2. Répéter l&#39;opération avec PBS. Tapez excès de PBS de la plaque sur du papier absorbant avant de passer à l&#39;étape suivante. NOTE: Cette étape peut être effectuée sur un laveur de plaques automatique ou laver la plaque trois fois avec PBST 200 pi par le dumping liquide dans un évier et le remplacement PBST avec une pipette. </li><li> Ajouter 50 ul de PBS pH 7,2 à tous les puits actifs. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture à surveiller résonance post-lavage. </li><li> Arrêtez la lecture et éjecter la plaque. </li></ol> Alternative protocole pour Étape 1: <ol start="13"><li> Ajouter 50 ul RL21A anticorps biotinylé à [10 ug / ml de PBS] pour tous les puits. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1,5 heures ou pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver la plaque 3 fois avec 200 pl / puits de PBST, suivi par trois rinçages avec 200 pl / puits de PBS que dans l&#39;étape 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Addition d&#39;analyte <ol><li> Retirez le PBS et ajouter 50 ul par puits de tampon de dosage approprié. Pour ce dosage, disponible dans le commerce du sérum humain normal dilué a été utilisé 1:20 dans du PBS. </li><li> Ouvrez le logiciel du scanner d&#39;essai biologique et suivez l&#39;assistant de configuration pour définir procédure expérimentale. </li><li> Insérez la plaque dans le scanner d&#39;analyse biologique et de commencer une base de référence lu. Si ce est la première lecture effectuée sur cette plaque spécifique, laisser le scanneur terme pour équilibrer la température et éliminer la dérive dans la ligne de base. </li><li> Après la ligne de base est stabilisé, ou au moins cinq analyses, mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Retirer le tampon d&#39;essai de puits. </li><li> contrôles Spike avec HLA A * 02: 01 monomère portant pertinentes (FLSL) ou non pertinentes (SLLV, YLEV ou KVL) peptides à des concentrations allant de [0,625 à 10 pg / ml] dans un tampon de dosage. Ajouter 50 ul de standards pour les puits de contrôle de la plaque </li><li> Ajouter 50 ul de substance à analyser dans un tampon de dosage de l&#39;échantillonpuits de la plaque. Pour ce dosage, enrichi de sérum humain disponible dans le commerce a été utilisé. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture jusqu&#39;à saturation, environ 30-60 min. </li><li> Mettre en pause la lecture et éjecter la plaque. </li><li> Laver la plaque 3 fois avec 200 pl / puits de PBST, suivi par trois rinçages avec 200 pl / puits de PBS que dans l&#39;étape 1.9. </li><li> Ajouter du tampon d&#39;essai de 50 ul à chaque puits actifs. </li><li> Insérez la plaque arrière dans le scanner d&#39;analyse biologique et de reprendre la lecture à surveiller résonance post-lavage. </li><li> Arrêtez la lecture et éjecter la plaque. NOTE: Le tampon d&#39;analyse peut être PBS, les milieux de culture tissulaire, ou de sérum humain dilué 1:20 dans du PBS en fonction de l&#39;objectif du test. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Analyser en utilisant le logiciel de numérisation d&#39;essai biologique ou des fichiers de données brutes à un logiciel d&#39;analyse statistique préféré exportation. Le logiciel de numérisation d&#39;essai biologique génère automatiquement la courbe de liaison sur la base dudisposition de la plaque fourni lors de l&#39;installation expérimentale. NOTE: Si vous ne utilisez pas le logiciel du scanner d&#39;essai biologique pour l&#39;analyse, suivez les étapes 3.2 à 3.4. </li><li> Soustraire la ligne de base et du contrôle négatif de chaque point de données suivant. </li><li> Calculer la moyenne et l&#39;écart type pour les puits répétés à chaque point de temps. </li><li> Générer un graphique de la courbe de liaison ou sélectionnez les données de point final pour les graphiques à barres. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Les auteurs, Debra Wawro Weidanz et Robert Magnusson, sont respectivement chef de la direction et chef de la technologie chez Resonant Capteurs Incorporated, qui produit le lecteur et analyse les plaques de la plaque d&#39;essai biologique utilisées dans cet article.

Le procédé décrit ici introduit un système de dépistage des biomarqueurs pour le diagnostic de cancer qui permettraient la détection rapide des complexes peptide / HLA solubles dans des échantillons de sérum, plasma, l&#39;urine ou la salive des patients dans un haut débit à 96 ou au format 384 puits. Ce système de dosage utilisant récepteur des cellules T imitant des anticorps monoclonaux et un système de détection sans marquage réduit le temps d&#39;analyse à moins de 1 h par rapport à 3,5 h par ELISA classique. Cette approche à haut débit permet la stratification rapide des patients aux essais cliniques pour des vaccins thérapeutiques contre le cancer ou les produits biopharmaceutiques. Les méthodes actuelles pour la détection de ces cibles pathologiques exigent la purification d&#39;affinité et HPLC-MS / MS des échantillons de patients individuels, un processus qui prend du lourd et du temps. Bien que cette méthode se prête à des techniques ELISA classiques, il est à craindre que les réactifs de détection secondaires tels que l&#39;anticorps anti-β2 microglobuline pourraient modifier la structure de la HL naissanteUne molécule et inhiber la liaison à la détection limitant TCRM. Détection sans étiquette atténue ces préoccupations. Cette procédure pourrait être modifié pour être utilisé sur d&#39;autres systèmes sans marquage tel qu&#39;un système de résonance de plasmon de surface. Cependant, cela réduirait considérablement les capacités de débit élevées par rapport au système d&#39;essai biologique utilisée dans cette étude. Ce protocole peut être modifié de manière efficace pour la détection de biomarqueurs non-HLA dans le sérum du patient et du plasma avec le respect de quelques pas critiques. Le suivi du processus de revêtement d&#39;anticorps initial est recommandé pour l&#39;optimisation de la surface, en tant que &lt;200 pm décalage entraînera probablement faible signal pour l&#39;étape de détection ultérieure. La ligne de base et post-lavage lit sont utiles pour l&#39;analyse de point de terminaison que l&#39;abondance de protéines sériques peut masquer liaison de faible analyte de concentration. Enfin, la variation de température des échantillons peut se traduire par une variation bien également. Il est recommandé que tous les échantillons sont incubés une préd le contrôleur de température de l&#39;unité de biosassay libre de l&#39;étiquette est fixée à 2-3 ° C au-dessus de la température ambiante. Les échantillons réfrigérés doivent être autorisés suffisamment de temps pour atteindre la température de fonctionnement. Modifications futures de ce protocole incluront le multiplexage de TCRM sur la surface de la plaque. Le système d&#39;essai biologique est actuellement prête à repérer des puits à une densité d&#39;au moins 8-plex. En introduisant 8.4 TCRM à chaque puits, pour des volumes d&#39;échantillon de test sont réduites et permettre la collecte de données de plus en plus complexes par patient. Cette capacité pourrait encore informer les patients en ce qui concerne les options thérapeutiques.

La classe antigène I leucocytes humains (HLA) échantillons peptides de 8-11 acides aminés provenant de la dégradation par le protéasome du répertoire de la protéine intracellulaire et présente ces peptides sur la surface de chaque cellule nucléée 1,2. Le complexe de HLA est le «biomarqueur de la nature&quot;, indiquant l&#39;état de chaque cellule (figure 1) qui circulent à lymphocytes T cytotoxiques (CTL). La reconnaissance de maladie associé peptides résultats dans l&#39;élimination de la cellule incriminée par CTL. Ainsi, la réponse immunitaire adaptative est très efficace pour éliminer l&#39;infection virale et de la tumeur. Toutefois, le système immunitaire exerce une pression de sélection qui favorise souvent des virus ou une tumeur capables de soustraire une réponse CTL efficace. Récepteur des cellules T (mimant TCRM) des anticorps monoclonaux (mAbs) qui reconnaissent spécifique de peptide / HLA-A * 02: 01 complexes tels que ceux dérivés de protéines associées au cancer du sein, le facteur inhibiteur de migration des macrophages (MIF19-27) 3 et NY-ESO-1 157-165, permettre la détection et la destruction des cellules du cancer du sein en l&#39;absence d&#39;un anti-tumorale efficace réponse CTL 4,5. Ce produit représentatif est centrée sur le HLA-A * 0201, qui est exprimé par jusqu&#39;à 30% de la population. Toutefois, l&#39;identification d&#39;autres complexes HLA / peptide pertinentes, suivie par la production de TCRM permet le développement d&#39;immunothérapies ciblées et le diagnostic des maladies compagnon, l&#39;expansion de l&#39;utilité de ce travail à une population beaucoup plus large. Une partie des complexes de peptide / HLA à destination de la surface de la cellule est libérée dans le plasma. En raison de la nature très complexe de peptide / HLA piscines, les méthodes actuelles de l&#39;exploitation minière du immunopeptidome de biomarqueurs associés sont HLA temps. Ce procédé nécessite la purification par affinité de l&#39;antigène HLA soluble du plasma, la séparation des peptides HLA associés par chromatographie liquide haute pression en phase inverse(RP-HPLC) et le séquençage de peptides par spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) 6,7. Bien que ce processus est une option viable pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques, ce est un processus lourd comme un outil de diagnostic compagnon pour les cibles associées HLA déjà dans le vaccin thérapeutique ou d&#39;un pipeline biopharmaceutique 8-10. TCRM dirigée contre ces objectifs fournissent les outils pour le développement de diagnostic compagnon rapide visant à stratifier les patients dans les essais cliniques pertinents et fournir des options thérapeutiques plus éclairées. Dans ce travail, un système de criblage percée de biomarqueur pour le diagnostic du cancer est présenté TCRM et qui utilise un système d&#39;essai biologique sans étiquette qui surveille les interactions biologiques avec des étapes de traitement minimum. Le système d&#39;essai biologique sans marquage est basé sur un procédé qui utilise l&#39;effet de résonance à mode guidé (GMR) qui se produit dans des réseaux de guides d&#39;ondes diélectriques 14/11. Lorsque les contacts de lumière à large bande de la diffractiongrille dans les plaques nécessaires pour ce système, deux longueurs d&#39;onde spécifiques sont reflétés. L&#39;interaction de liaison entre un récepteur et son ligand immobilisé est suivie en temps réel en surveillant le décalage de longueur d&#39;onde de résonance avec un analyseur de spectre 12. Séparer les pics de résonance se produisent pour incidente TE (vecteur électrique perpendiculaire au plan d&#39;incidence) et TM (magnétique vecteur normal au plan d&#39;incidence) des états de polarisation fournissant de multiples points de données qui peuvent potentiellement augmenter la précision de détection 11,14. En utilisant des plaques pré-sensibilisées anticorps dans ce système d&#39;essai sans étiquette, le temps d&#39;exécution de test d&#39;analyse de données est d&#39;environ 45 min. En outre, plusieurs échantillons de patients peuvent être interrogés dans un format à 96 ou 384 puits, un net avantage sur un format basé sur HPLC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Selon l&#39;American Cancer Society, plus de 200 000 femmes recevront un diagnostic de cancer du sein invasif chaque année et environ 40 000 mourront de la maladie. Échantillons I La classe antigène leucocytaire humain (HLA) de peptides dérivés de la dégradation par le protéasome des protéines cellulaires et présente ces fragments sur la surface de la cellule pour un interrogatoire par circulant lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Génération d&#39;synoptique du récepteur des cellules T (TCRM) des anticorps monoclonaux (mAbs) qui reconnaissent le cancer du sein spécifique peptide / HLA-A * 02: 01 complexes tels que ceux dérivés de MIF MIF (19-27) et NY-ESO- 1 157-165 permettre la détection et la destruction des cellules du cancer du sein en l&#39;absence d&#39;une réponse efficace de CTL anti-tumeur. Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses du sein et du cancer représentent biomarqueurs potentiellement pertinents. Dans ce travail, un système de dépistage percée biomarqueur du cancer de diagnostics intégrant récepteur des cellules T anticorps monoclonaux imiter combinés avec un roman, biocapteur sans étiquette utilisant résonance mode guidé (GMR) la technologie des capteurs est présenté. Détection de remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, additionné de sérum humain, et le plasma du patient est mise en évidence. L&#39;impact de ce travail pourrait révolutionner la médecine personnalisée à travers le développement du diagnostic de la maladie de compagnie pour les immunothérapies ciblées.

Une série représentative d&#39;expériences a été effectuée en utilisant le TCRM bien caractérisé, RL21A, un anticorps IgG2a monoclonal murin qui reconnaît spécifiquement un peptide (ou MIF FLSL 19-27) dans le contexte de la molécule HLA-A * 02: 3 01 molécule. Le monomère apparenté peptide / HLA, ainsi que HLA monomère non pertinent 15, a été utilisé pour démontrer le procédé décrit. La figure 3 illustre le format d&#39;essai. RL21A est spécifique pour le monomère FLSL / HLA avec peu de réactivité croisée avec d&#39;autres complexes peptide / HLA 3. Cette spécificité est récapitulé en utilisant le système d&#39;essai biologique sans marqueur (Figure 4). La sensibilité du système d&#39;essai biologique étiquette libre pour cette expérience est dans la plage nanomolaire basse comme déterminé par titrage de l&#39;anticorps immobilisé RL21A sur FLSL / HLA monomère (Figure 5). Bien que le signal de fond est significativement augmentée dans les échantillons de sérum, spécifique de détection de FLSL / HLA monomère dans le sérum humain est obtenu à pointes sur la figure 6 et un gradient de concentration est facilement discernable dans ces échantillons. Enfin, les surnageants de la lignée cellulaire MDA-MB-231, précédemment présentés pour présenter le FLSL / HLA-A * 02: 01 molécule, sont indiqués pour contenir monomère FLSL soluble en utilisant ce marqueur libre plate-forme de test (Figure 7). L&#39;addition ultérieure de monomère FLSL / HLA augmente le signal sur RL21A (figure 7). En raison de la sensibilité du système, et ainsi de variation de résonance, y compris les changements négatifs peuvent se produire à la suite de variations de température comme on le voit en fonction des écarts-types sur les figures 4 et 5. Ces variations peuvent être réduits considérablement par pré-incubation de tous les échantillons et le lecteur de plaques de dosage biologique à une température en léger excès de la température ambiante (c.-à-28 ° C). Sur la figure 8, brièvement, 96-Bien plaques de polystyrène ont été enduites avec [10 pg / ml] de RL21A pendant 2 heures à la température ambiante, on l&#39;a lavé avec du PBST, bloquées avec 0,5% de lait à faible teneur en matière grasse, on l&#39;a lavé avec du PBST et incubés pendant 2 heures à température ambiante avec des dilutions en série de FLSL HLA monomère dans du sérum humain normal dilué à 1:10 dans du PBS afin de générer une courbe d&#39;étalonnage ou de plasma de patient dilué au 1/10 dans du PBS. La plaque a été lavée avec du PBST, on incube 1 heure à température ambiante avec de lapin anti-microglobuline β2 humain [1: 5000] pour détecter HLA intact, et lavé dans PBST. Les plaques ont été ensuite incubées pendant 30 min avec de chèvre anti-IgG de lapin [1: 10 000] et lavées avec du PBST. Détection colorimétrique est réalisée en utilisant ABTS (2,2&#39;-azinobis [acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique] -diammonium sel) substrat avec un temps d&#39;incubation de 15 min et observé à 405 nm sur un lecteur de microplaques. FLSL / HLA a été détectée dans trois échantillons de patients. Sur la figure 8B, RL.064 de plasma du patient a été dilué 1:20 dans du PBS, puis ajoutered à la plaque et surveillés sur le détecteur sans étiquette pendant 60 min. Détection spécifique de complexe FLSL / HLA dans le sérum du patient a été réalisé. Le test t de Student a été effectuée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,05). Sur la figure 8C, les coupes de tissu ont été colorées à 1 ug / ml de souris anti-HLA-A2 (BB7.2) comme témoin positif, RL21A, IgG2a IgG2b et respectivement de témoins négatifs. La coloration a été détectée en utilisant un kit anti-souris détection, DAB (diaminobenzadine) et QS hématoxyline pour la coloration nucléaire comme indiqué par le fabricant. La coloration du tissu tumoral par RL21A confirme présentation de complexes FLSL / HLA. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Tumeur présentation de l&#39;antigène par l&#39;antigène de classe I de leucocyte humain transformation cancéreuse est un trouble intracellulaire. HLA échantillon intracellular protéines et révéler des changements liés au cancer à la surface cellulaire. TCRM CTL et sont capables de reconnaître les cellules cancéreuses par le biais des complexes HLA-peptide distinctes pour ces cellules. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Capture d&#39;écran de l&#39;acquisition de données dans le logiciel de numérisation d&#39;essai biologique Exemple d&#39;acquisition de données montrant la base initiale de scrutation, suivie par plus de RL21A anticorps à une plaque revêtue de 10 pg / ml de complexe FLSL / HLA. Les concentrations d&#39;anticorps sont telles qu&#39;indiquées. Chaque ligne représente un individu bien suivi dans le temps. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figure 3:. Format Assay Illustration d&#39;anticorps immobilisé sur la surface du réseau de diffraction de la rel plaque d&#39;essai de captureperti- complexes peptide / HLA en solution. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figure 4: Spécificité de RL21A pour FLSL / HLA complexe en évidence de la spécificité des biotinylé RL21A TCRM pour son monomère (FLSL) de HLA pertinent par rapport à HLA monomère non pertinent (YLEV, SLLV, et KVL).. RL21A TCRM biotinylé [10 pg / ml] a été immobilisé sur la surface de la plaque d&#39;essai revêtue d&#39;avidine et la détection a été effectuée en utilisant non marqué monomère HLA pertinent ou non [10 pg / ml] dans du PBS. RL21A était spécifique pour le complexe FLSL / HLA. Two-Way ANOVA a été réalisée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,001). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figure 5:. Reliure sensibilité de RL21A à son / complexe HLA de peptide apparenté Illustration de la detectisur la limite et la sensibilité de RL21A liaison au complexe FLSL / HLA. Biotinylés de HLA monomère FLSL [10 pg / ml] a été immobilisé sur la surface de la plaque de dosage et RL21A non marqué a été ajouté à la plaque dans des dilutions en série dans du PBS comme indiqué. Détection de ce système était de l&#39;ordre de quelques nanomoles. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figure 6: Détection de HLA Complexes dans le sérum humain à pointes en évidence de la détection de l&#39;antigène HLA dans le sérum humain.. RL21A TCRM biotinylé [10 pg / ml] a été immobilisé sur la surface de la plaque d&#39;essai revêtue d&#39;avidine. Pooled sérum humain normal additionné de cause (FLSL) ou non pertinent (SLLV) HLA monomère a été dilué 1:20 dans du PBS et ensuite ajouté à la plaque et surveillée sur le détecteur sans marquage pendant 60 min. Détection spécifique de complexe FLSL / HLA dans le sérum humain a été accompli. En général, le signal d&#39;arrière-plan (monomère SLLV sans objet) est élevéeer pour les échantillons de sérum dilués par rapport à analytes purifiés dans du PBS (voir Figure 4). Two-Way ANOVA a été réalisée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,0001). <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figure 7:. Complexes HLA solubles ont été détectés dans le cancer du sein surnageants de culture de cellules La capacité à détecter HLA mammaires dans des surnageants de cellules de cancer est démontrée. Biotinylé RL21A TCRM, RL9A TCRM (contrôle négatif), et une commande de isotype ont été immobilisés sur la surface de la plaque d&#39;essai. Spiked [5 pg / ml] et non enrichis MDA-231 de surnageants de culture cellulaire ont été ajoutés et la liaison a été suivie pendant 60 min sur le détecteur sans étiquette. FLSL et de monomère SLLV HLA échantillons enrichis représentent contrôles positifs pour RL9A et RL21A contraignant. L&#39;analyse de variance a été effectuée à l&#39;aide de graphiques et de logiciel de statistiques (p &lt;0,0001). Figure 8:. Détection spécifique des complexes FLSL / HLA dans les échantillons de patient (A) de A Enzyme Linked Immunosorbent Assay traditionnel (ELISA) a été utilisé pour détecter FLSL / HLA spécifiques des complexes dans le plasma du patient. (B) biotinylé RL21A TCRM ou IgG2a [10 pg / ml] a été immobilisé sur la plaque d&#39;essai de l&#39;avidine. (C) le tissu tumoral mammaire de RL.064 patient a été souillé comme décrit précédemment 3 pour vérifier la présentation de la tumeur des complexes FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses, ce qui représente un biomarqueur potentiel de cancer concerné. En utilisant la technologie des capteurs sans étiquette et récepteur des cellules T imitant les anticorps monoclonaux, la détection de la remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, dopés sérum humain, et le plasma du patient est démontrée, ce qui permet le développement de un nouveau cancer de la plateforme de diagnostic.

Détection de l&#39;antigène leucocytaire humain biomarqueurs du cancer du sein Utilisant la technologie des biocapteurs Sans étiquette

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