Name: detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Etikk uttalelse: De-identifiserte menneskelig vev og plasmaprøver ble innhentet fra Hendrick Medical Center under en Institutional Review Board godkjent protokollen. 1. Tilsetting av Biotinylated antistoff MERK: Overvåking av dette trinnet er valgfritt. Se alternative protokollen hvis ikke overvåking. <ol><li> Skaff kommersielt tilgjengelige avidinbelagte derivative belagte plater (se Materialer og utstyr Table). </li><li> Tilsett 50 ul fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,2 til brønnene. MERK: forinkubere PBS ved 28 ° C for å minimalisere temperaturrelaterte resonans skift. </li><li> Åpen bioassay skannerprogramvaren og følg installasjonsveiviseren for å definere den eksperimentelle prosedyre som inkluderer valg av blanks, standarder og prøver i plateoppsettet temperaturinnstilling (28 ° C), antall skanninger per min (1), og lengden på eksperimentet ( 150 minutter for å få plass for preparative trinn). </li&gt; <li> Sett forberedt analyseplaten inn i etiketten gratis bioassay scanner og starte den første skanningen. Når den første skanningen er fullført, velger du &quot;self referanse til start&quot;. Grunnlinjen er det første sett av skanninger innsamlet ved starten av forsøket. Hvis dette er første lese utført på denne spesifikke plate, la skanneren til å kjøre for å stabilisere temperaturen og eliminere drift i baseline. Se figur 2 for et skjermbilde av en baseline fulgt av prøven tillegg. </li><li> Etter grunnlinjen har stabilisert seg, eller i det minste 5 skanninger, pause lese og løse ut platen. </li><li> Fjern PBS ved dumping i vasken og tilsett 50 ul RL21A biotinylert antistoff i [10 ug / ml i PBS, pH 7,2] for alle bortsett fra kontrollbrønner på plate. Tilsett 50 ul PBS til kontrollbrønnene. </li><li> Sett platen tilbake i bioassay skanneren og fortsette å lese inntil metning er oppnådd, omtrent 1,5 timer. </li><li> Pause lese- og løse ut platen. </li><li> Vask<html> platen 3 ganger med 200 ul / brønn fosfatbufret saltvann + 0,05% Tween 20 (PBST), etterfulgt av 3 skyllinger med 200 ul / brønn PBS pH 7,2. Gjenta med PBS. Tapp overflødig PBS fra plate på tørkepapir før du flytter til neste trinn. MERK: Dette trinnet kan utføres på en automatisk platevasker eller platen vaskes 3 ganger med 200 ul PBST ved å dumpe væske i en vask og erstatte PBST med en pipette. </li><li> Tilsett 50 ul PBS pH 7,2 til alle aktive brønner. </li><li> Sett platen tilbake i bioassay scanner og gjenoppta lesing for å overvåke etter vask resonans. </li><li> Stopp lese og løse ut platen. </li></ol> Alternativ protokoll for Trinn 1: <ol start="13"><li> Tilsett 50 ul RL21A biotinylert antistoff ved [10 ug / ml PBS] til alle brønnene. </li><li> Inkuber ved romtemperatur i 1,5 timer eller over natten ved 4 ° C. </li><li> Platen vaskes 3 ganger med 200 ul / brønn PBST etterfulgt av 3 skyllinger med 200 ul / brønn PBS som i trinn 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Tilsetting av Analytt <ol><li> Fjern PBS og tilsett 50 ul per brønn av hensiktsmessige analysebuffer. For denne analyse, ble kommersielt tilgjengelig normalt humant serum anvendt fortynnet 1:20 i PBS. </li><li> Åpen bioassay skannerprogramvaren og følg installasjonsveiviseren for å definere eksperimentell prosedyre. </li><li> Sett platen inn i den biologiske metode skanneren og begynner på en baseline les. Hvis dette er første lese utført på denne spesifikke plate, la skanneren løp til stabilisering temperatur og eliminere drift i baseline. </li><li> Etter grunnlinjen har stabilisert seg, eller i det minste 5 skanninger, pause lese og løse ut platen. </li><li> Fjern analysebuffer fra brønnene. </li><li> Spike kontroller med HLA-A * 02: 01 monomer som bærer relevant (FLSL) eller irrelevante (SLLV, YLEV eller KVL) peptider ved konsentrasjoner som strekker seg fra [0,625 til 10 pg / ml] i analysebuffer. Tilsett 50 ul av standardene til kontrollbrønner i platen </li><li> Tilsett 50 pl av analytten i analysebuffer til prøvenbrønner i platen. For denne analyse ble tilsatt kommersielt tilgjengelig humanserum ble anvendt. </li><li> Sett platen tilbake i bioassay scanner og gjenoppta lesing inntil metning er nådd, ca 30-60 min. </li><li> Pause lese- og løse ut platen. </li><li> Platen vaskes 3 ganger med 200 ul / brønn PBST etterfulgt av 3 skyllinger med 200 ul / brønn PBS som i trinn 1.9. </li><li> Tilsett 50 ul analysebuffer til alle aktive brønner. </li><li> Sett platen tilbake i bioassay scanner og gjenoppta lesing for å overvåke etter vask resonans. </li><li> Stopp lese og løse ut platen. MERK: analysebuffer kan være PBS, Tissue kulturmedium, eller humant serum fortynnet 1:20 i PBS, avhengig av målet for analysen. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Analysere bruk av bioassay skannerprogramvaren eller eksport rådatafiler til foretrukne statistisk analyse programvare. Bioanalysen skannerprogramvaren genererer bindingskurve basert på automatiskplate layout gitt under eksperimentelle oppsettet. MERK: Hvis du ikke bruker bioanalysen skannerprogramvaren for analyse, følg trinn 03.02 til 03.04. </li><li> Trekk fra grunnlinjen og negativ kontroll fra hver påfølgende datapunkt. </li><li> Beregne gjennomsnitt og standardavvik for replikate brønner ved hvert tidspunkt. </li><li> Generere en graf over bindingskurve eller velg endepunkt data for søylediagram. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Forfatterne, Debra Wawro Weidanz og Robert Magnusson, er henholdsvis administrerende direktør og Chief Technology Officer i Resonant Sensorer Incorporated, som produserer bioassay plateleser og analyseplater som brukes i denne artikkelen.

Den her beskrevne fremgangsmåte innfører en biomarkør screeningsystem for kreftdiagnostikk som ville muliggjøre rask deteksjon av oppløselige peptid / HLA-komplekser i pasientens serum, plasma, urin eller spytt prøver i en høy gjennomstrømning 96- eller 384-brønners format. Dette assay-system som anvender T-celle-reseptor ligne monoklonale antistoffer og en etikett fritt deteksjonssystem reduserer analysetiden til mindre enn 1 time, sammenlignet med 3,5 timer ved konvensjonell ELISA. Denne high-throughput tilnærming muliggjør rask stratifisering av pasienter til kliniske studier for terapeutiske kreftvaksiner eller Biopharmaceuticals. Nåværende metoder for å påvise disse sykdoms mål krever affinitetsrensing og HPLC-MS / MS av individuelle pasientprøver, en tungvint og tidkrevende prosess. Selv om denne metoden er mottagelig for konvensjonelle ELISA-teknikker, er det bekymring for at sekundære påvisningsreagenser som for eksempel anti-β2 mikroglobulin antistoff kunne endre strukturen i den begynnende HLEt molekyl og hemme binding til TCRm begrensende deteksjon. Etikett-free deteksjon lindrer disse bekymringene. Denne fremgangsmåten kan modifiseres for bruk i andre etikett-frie systemer, for eksempel en overflate-plasmonresonans system. Dette vil imidlertid i stor grad redusere de høyere gjennomstrømning kapasiteter i forhold til den biologiske metode som brukes i denne undersøkelsen. Denne protokollen kan effektivt modifiseres for påvisning av ikke-HLA biomarkører i pasientens serum og plasma med tilslutning til noen kritiske trinn. Overvåking av det opprinnelige antistoff belegningsprosessen er anbefalt for optimalisering av overflaten, som en &lt;200 pm skiftet vil trolig føre til lavt signal for den etterfølgende deteksjonstrinn. Grunnlinjen og ettervasker leser er nyttige for sluttpunktanalyse som overflod av serumproteiner kan maskere binding av lav konsentrasjon analytt. Endelig kan temperaturvariasjon av prøver resultere i brønn til brønn variasjon. Det anbefales at alle prøvene være pre-inkubert end etiketten gratis biosassay enhet temperaturregulator settes til 2-3 ° C over romtemperatur. Kjølte prøver bør få lov nok tid til å nå driftstemperatur. Fremtidige endringer av denne protokollen vil omfatte multipleksing av TCRm på tallerkenen overflaten. Den biologiske metode Systemet er mottagelig for å fange opp av brønner i en tetthet på minst 8-plex. Ved å innføre 4-8 TCRm til hver brønn, per testprøvevolum reduseres og gjøre det mulig for innsamling av stadig mer komplekse data per pasient. Denne evnen kan videre informere pasienter med hensyn til behandlingsalternativer.

Den klasse I humane leukocytt antigen (HLA) samples peptider med 8-11 aminosyrer i lengde avledet fra proteasomal degradering av intracellulære proteiner repertoaret og presenterer disse peptider på overflaten av hvert kjernedannelse celle 1,2. HLA-komplekset er «naturens biomarkør&quot;, som indikerer helsen til hver celle (figur 1) for å sirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Anerkjennelse av sykdom forbundet peptider resulterer i eliminering av den fornærmende celle ved CTL. Således er den adaptive immunrespons meget effektiv på å eliminere virusinfeksjon og tumor. Men utøver immunsystemtrykk som ofte fremmer utvalget for virus eller svulst i stand til å unndra en effektiv CTL respons. T-celle-reseptor-ligne (TCRm), monoklonale antistoffer (mAbs) som gjenkjenner spesifikke peptid / HLA-A * 02: 01-komplekser, slik som de avledet fra brystkreft assosierte proteiner, makrofag migrerings inhiberende faktor (MIF19-27) 3 og NY-ESO-1 157-165, aktiverer deteksjon og ødeleggelse av brystkreft celler i fravær av en effektiv anti-tumor CTL respons 4,5. Denne representative arbeidet er fokusert på HLA-A * 0201-molekyl, som uttrykkes med opp til 30% av befolkningen. Imidlertid identifisering av andre relevante HLA / peptid-komplekser, etterfulgt av produksjon av TCRm muliggjør utvikling av målrettet immunterapi og ledsager sykdomsdiagnostikk, utvider nytten av dette arbeidet til et mye bredere populasjon. En del av peptid / HLA-komplekser bundet til celleoverflaten er sluppet inn i plasma. På grunn av den svært komplekse natur av peptid / HLA bassenger, aktuelle metoder for gruvedrift immunopeptidome for HLA forbundet biomarkører er tidkrevende. Denne prosessen krever at affinitetsrensing av oppløselig HLA fra plasma, separering av HLA-assosierte peptider ved revers fase høytrykks-væskekromatografi(RP-HPLC) og peptid-sekvensering ved tandem-massespektrometri (MS / MS) 6,7. Selv om denne prosessen er et levedyktig alternativ for oppdagelsen av nye terapeutiske mål, er det en tungvint prosess som en følges diagnostisk verktøy for HLA tilhørende mål allerede i terapeutisk vaksine eller biofarmasøytisk rørledning 8-10. TCRm rettet mot disse målene gir verktøy for rask følges diagnostisk utvikling rettet mot stratifying pasienter i relevante kliniske studier og gi mer informerte behandlingsalternativer. I dette arbeidet er et gjennombrudd biomarkør screening system for kreftdiagnostikk presenteres som benytter TCRm og en etikett fritt bioassay system som overvåker biologiske interaksjoner med minimal behandlingstrinn. Etiketten frie bioassay systemet er basert på en metode som benytter den ledet modusresonans (GMR) effekt som oppstår i dielektriske bølgeleder gitter 11-14. Når bredbånd light kontakter diffraktivegitteret i platene som kreves for dette systemet, er to spesifikke bølgelengder som reflekteres. Bindingen samspillet mellom en immobilisert reseptor og dens ligand overvåkes i sanntid ved å spore resonans bølgelengde skift med en spektrumanalysator 12. Separate resonanstopper oppstå for innfall TE (elektrisk vektor vinkelrett på innfallsplanet) og TM (magnetiske vektor vinkelrett på innfallsplanet) polarisasjonstilstander som gir flere datapunkter som potensielt kan øke deteksjonsnøyaktighet 11,14. Ved hjelp av antistoff pre-sensibiliserte plater i denne etiketten frie analysesystem, analyse kjøretid med dataanalyse er ca 45 min. I tillegg kan flere pasientprøver bli avlest i et 96- eller 384-brønners-formatet, en klar fordel i forhold til en HPLC-MS / MS basert format.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Ifølge American Cancer Society, vil mer enn 200.000 kvinner bli diagnostisert med invasiv brystkreft hvert år, og ca 40 000 vil dø av sykdommen. Den humane leukocytt antigen (HLA) klasse I prøvene peptider avledet fra proteasomal nedbrytning av cellulære proteiner og presenterer disse fragmentene på celleoverflaten for utspørring av sirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Generasjon av T-celle reseptor ligne (TCRm) monoklonale antistoffer (mAbs) som gjenkjenner brystkreft bestemt peptid / HLA-A * 02: 01 komplekser som de som stammer fra makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF 19-27) og NY-ESO- 1 157-165 aktivere deteksjon og ødeleggelse av brystkreftceller i fravær av en effektiv anti-tumor CTL-respons. Intakte klasse I HLA / peptidkomplekser er utgytt av brystkreftceller og representerer potensielt relevante kreft biomarkører. I dette arbeidet, et gjennombrudd biomarkør screening system for kreft diagnostisks innlemme T-celle reseptor ligne monoklonale antistoffer kombinert med en roman, etikett-fri biosensor utnytte guidet-modus resonans (GMR) sensorteknologi er presentert. Påvisning av skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231 cellesupernatanter, piggete humant serum, og pasienten plasma er demonstrert. Virkningen av dette arbeidet kan revolusjonere personlig medisin gjennom utvikling av companion sykdomsdiagnostikk for målrettede immunotherapies.

Et representativt sett av eksperimenter ble utført ved anvendelse av godt karakterisert TCRm, RL21A, et murint IgG2a monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner et peptid (MIF 19-27 eller FLSL) i sammenheng med HLA-A * 02: 01-molekylet 3. Beslektet peptid / HLA-monomer, så vel som irrelevant HLA monomer 15, ble brukt for å demonstrere den beskrevne fremgangsmåte. Figur 3 viser analyseformat. RL21A er spesifikk for FLSL / HLA monomer med lite kryssreaktivitet med andre peptid / HLA komplekser 3. Dette spesifisitet er rekapitulert hjelp av etiketten frie bioassay system (figur 4). Følsomheten av etiketten fri bioassay system for dette forsøk er i det lave nanomolare området som bestemt ved titrering av RL21A antistoff immobilisert på FLSL / HLA monomer (figur 5). Selv om bakgrunnssignalet er betydelig økt i serumprøver, specific påvisning av FLSL / HLA-monomer i spiked humant serum oppnås i figur 6, og en konsentrasjonsgradient er lett merkes i disse prøvene. Endelig supernatanter fra MDA-MB-231-cellelinjen, som tidligere er vist å presentere FLSL / HLA-A * 02: 01-molekylet, er vist å inneholde oppløselig FLSL monomer ved hjelp av denne etikett fri assay plattformen (figur 7). Etterfølgende tilsetning av FLSL / HLA monomer øker signal på RL21A (figur 7). På grunn av følsomheten av systemet, brønn til brønn variasjoner inkludert negative resonans skift kan oppstå som et resultat av temperatursvingninger som sett som en funksjon av standardavvikene i figurene 4 og 5. Disse variasjoner kan reduseres dramatisk ved pre-inkubering av alle prøver og bioassay plateavleser ved en temperatur i svakt overskudd av romtemperatur (dvs. 28 ° C). I figur 8, kort, 96-godt polystyren plater ble belagt med [10 ug / ml] i RL21A i 2 timer ved romtemperatur, vasket med PBST, blokkert med 0,5% lettmelk, vasket med PBST, og inkubert i 2 timer ved romtemperatur med seriefortynninger av FLSL HLA monomer i normalt humant serum fortynnet 1:10 i PBS for å generere en standardkurve, eller pasientens plasma fortynnet 1:10 i PBS. Platen ble vasket med PBST, inkubert 1 time ved romtemperatur med kanin-anti-human β2 mikroglobulin [1: 5000] for å påvise intakt HLA, og vasket i PBST. Platene ble så inkubert i 30 minutter med geit-anti-kanin-IgG [1: 10000] og vasket med PBST. Kolorimetrisk deteksjon ble utført ved anvendelse av ABTS (2,2&#39;-Azinobis [3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre] -diammonium-salt) substrat med en 15 min inkubasjonstid og observert ved 405 nm på en mikroplateleser. FLSL / HLA ble oppdaget i tre pasientprøver. I figur 8B, ble pasienten plasma RL.064 fortynnet 1:20 i PBS og deretter leggeed til platen og overvåkes på etiketten fritt detektor i 60 min. Spesifikk påvisning av FLSL / HLA-komplekset i pasientens serum ble oppnådd. Student t test ble utført ved hjelp av graf og statistikk programvare (p &lt;0,05). I figur 8C ble vevssnitt farget ved 1 pg / ml med mus-anti-HLA-A2 (BB7.2) som en positiv kontroll, RL21A, IgG2b IgG2a og henholdsvis som negative kontroller. Farging ble oppdaget ved hjelp av en anti-mus deteksjon kit, DAB (diaminobenzadine), og Hematoxylin QS for nukleær farging som anvist av produsenten. Farging av svulstvev ved RL21A bekrefter presentasjon av FLSL / HLA komplekser. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Fig. 1: Tumor antigenpresentasjon av klasse I humane leukocytt antigen cancerøs omdannelse er en intracellulær lidelse. HLA prøve intracellular proteiner og avdekke kreftrelaterte endringer på celleoverflaten. CTL og TCRm er i stand til å gjenkjenne kreftceller gjennom HLA-peptid-komplekser distinkte til disse cellene. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Fig. 2: skjermbilde for datainnsamling i den biologiske metode skannerprogramvaren Eksempel på datainnsamling som viser den opprinnelige basislinjeskanning fulgt av RL21A antistoff tillegg til en plate belagt med 10 ug / ml av FLSL / HLA kompleks. Konsentrasjoner av antistoff er som angitt. Hver linje representerer et individuelt overvåket godt over tid. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Fig. 3: Analyse format Illustrasjon av antistoffer immobilisert på diffraktivt gitter overflaten av analyseplaten fange relevant peptid / HLA komplekser i løsningen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figur 4: Spesifisitet av RL21A for FLSL / HLA kompleks demonstrasjon av spesifisiteten av biotinylert RL21A TCRm for dens relevante (FLSL) HLA-monomer, sammenlignet med irrelevant HLA monomer (YLEV, SLLV, og KVL).. Biotinylert RL21A TCRm [10 ug / ml] ble immobilisert på avidinbelagt analyseplate overflate og påvisning ble utført ved å bruke umerket relevant eller irrelevant HLA monomer [10 ug / ml] i PBS. RL21A var spesifikk for FLSL / HLA-komplekset. Toveis ANOVA ble utført ved hjelp av graf og statistikk programvare (p &lt;0,001). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figur 5:. Binding følsomhet av RL21A til sin beslektet peptid / HLA-komplekset Illustrasjon av detectipå grensen og bindende følsomhet av RL21A til FLSL / HLA-komplekset. Biotinylert HLA Monomer FLSL [10 ug / ml] ble immobilisert på analyseplateoverflaten og umerket RL21A ble tilsatt til platen i serielle fortynninger i PBS som angitt. Deteksjon for dette systemet var i lav nanomolare området. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figur 6: Påvisning av HLA komplekser i Spiked Menneskelig Serum Demonstrasjon av påvisning av HLA i humant serum.. Biotinylert RL21A TCRm [10 ug / ml] ble immobilisert på avidinbelagt analyseplate overflate. Sammenslått normalt humant serum tilsatt relevant (FLSL) eller irrelevant (SLLV) HLA-monomer ble fortynnet 1:20 i PBS og deretter tilsatt til platen og overvåkes på etiketten fritt detektor i 60 min. Spesifikk påvisning av FLSL / HLA kompleks i human serum ble oppnådd. Generelt er høy bakgrunn signal (irrelevant SLLV monomer)er for fortynnede serumprøver i forhold til rensede analytter i PBS (se figur 4). Toveis ANOVA ble utført ved hjelp av graf og statistikk programvare (p &lt;0,0001). <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figur 7:. Løselig HLA komplekser ble oppdaget i brystkreft cellekultursupernatanter Evnen til å oppdage HLA i bryst kreft cellesupernatantene blir demonstrert. Biotinylert RL21A TCRm, RL9A TCRm (negativ kontroll) og en isotype-kontroll ble immobilisert på analyseplateoverflaten. Spiked [5 ug / ml] og unspiked MDA-231 cellekultursupernatanter ble tilsatt, og bindingen ble overvåket i 60 minutter på etiketten fritt detektor. FLSL og SLLV HLA monomer piggete prøvene representerer positive kontroller for RL9A og RL21A bindende. Enveis ANOVA ble utført ved hjelp av graf og statistikk programvare (p &lt;0,0001). Fig. 8: Spesifikk gjenkjenning av FLSL / HLA-komplekser i pasientprøver (A) En tradisjonell Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ble anvendt for å detektere FLSL / HLA-spesifikke komplekser i pasientens plasma. (B) biotinylert RL21A TCRm eller IgG2a [10 ug / ml] ble immobilisert på avidin analyseplate. (C) Breast svulstvev fra pasient RL.064 var farget som tidligere beskrevet 3 for å bekrefte svulst presentasjon av FLSL / HLA komplekser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intakte klasse I HLA / peptidkomplekser er utgytt av kreftceller, som representerer en potensiell relevant kreft biomarkør. Utnytte etikett-fri sensorteknologi og T-celle-reseptor ligne monoklonale antistoffer, deteksjon av skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231-cellesupernatanter, tilsatt humant serum, og pasientens plasma demonstreres, slik at utvikling av en roman kreft diagnostisk plattform.

Påvisning av humant leukocytt antigen Biomarkører i Breast Cancer Utnytte Etikett-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Påvisning av Invasiv pulmonal aspergillose i hematologisk malignitet pasienter ved hjelp av Lateral-Strømningsteknikk

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi for utvikling av Adenovirus Serotype 5-vectored Vaksine tilnærminger

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intramikroskopi av Leukocytt-endothelial og blodplater-leukocytt Interaksjon i Mesenterial Vener i Mus

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generering<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spesifikke humane T-cellereseptorer etter retroviral transduksjon av Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Ultrasensitive gjenkjenning av Biomarkers ved hjelp av en molekylær preging basert kapasitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

En Protein Microarray analysen for serologisk fastsettelse av Antigen-spesifikke antistoffer svar følgende Clostridium difficile infeksjon

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...