Name: detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Etik uttalande: De identifierade humana vävnads och plasmaprover erhölls från Hendrick Medical Center under en Institutional Review Board godkänt protokoll. 1. Tillsättning av Biotinyliserad Antikropp OBS: Övervakning av detta steg är valfritt. Se alternativt protokoll om inte övervakning. <ol><li> Skaffa kommersiellt tillgängliga avidin derivatbelagda plattor (se Material och utrustning Table). </li><li> Lägg 50 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2 till brunnarna. OBS: preinkubera PBS vid 28 ° C för att minimera temperaturrelaterade resonansskift. </li><li> Öppna bioassay skannerprogrammet och följ installationsguiden för att definiera den experimentella proceduren som inkluderar urval av ämnen, standarder och prover i plattan layout, temperaturinställningen (28 ° C), antal svep per minut (1), och längden på experimentet ( 150 min för att rymma för förberedande åtgärder). </li&gt; <li> Sätt i beredd analysplattan in i etiketten fri bioassay scanner och börja den första genomsökningen. När den första genomsökningen är klar, välj &quot;själv hänvisning till start&quot;. Baslinjen är den ursprungliga uppsättningen skanningar som samlats i början av experimentet. Om detta är första läsning utförs på detta specifika plattan, låt skannern att köra till jämvikt temperatur och eliminera drift i baslinjen. Se figur 2 för en skärmdump av en baslinje följt av provtillsats. </li><li> Efter baslinjen har stabiliserats, eller åtminstone fem skannar, pausa läs- och mata ut plattan. </li><li> Ta PBS genom dumpning i handfat och tillsätt 50 pl RL21A biotinylerad antikropp på [10 ug / ml i PBS pH 7,2] till alla utom kontrollbrunnar på plattan. Lägg 50 pl PBS till kontrollbrunnarna. </li><li> Sätt plattan tillbaka in i bioassay scanner och återuppta läsa tills mättnad uppnås, ca 1,5 tim. </li><li> Pausa läs- och mata ut plattan. </li><li> Tvätta<html> plattan 3 gånger med 200 pl / brunn fosfatbuffrad saltlösning + 0,05% Tween 20 (PBST), följt av tre sköljningar med 200 pl / brunn PBS pH 7,2. Upprepa med PBS. Knacka överskott PBS från plattan på hushållspapper innan du flyttar till nästa steg. OBS: Detta steg kan utföras på en automatisk plattvättare eller tvätta plattan 3 gånger med 200 pl PBST genom dumpning vätska i ett handfat och ersätta PBST med en pipett. </li><li> Lägg 50 pl PBS pH 7,2 till alla aktiva brunnar. </li><li> Sätt plattan tillbaka i bioanalysen scanner och återupptar inläsningen för att övervaka eftertvätt resonans. </li><li> Stoppa läs- och mata ut plattan. </li></ol> Alternativa protokoll för Steg 1: <ol start="13"><li> Lägg 50 pl RL21A biotinylerad antikropp vid [10 | ig / ml PBS] till samtliga brunnar. </li><li> Inkubera vid rumstemperatur under 1,5 h eller över natten vid 4 ° C. </li><li> Tvätta plattan 3 gånger med 200 pl / brunn PBST följt av tre sköljningar med 200 pl / brunn PBS som i steg 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Tillsats av analyt <ol><li> Avlägsna PBS och tillsätt 50 | il per brunn av lämplig analysbuffert. För denna analys var kommersiellt tillgängligt normalt humanserum användes utspädda 1:20 i PBS. </li><li> Öppna bioassay skannerprogrammet och följ installationsguiden för att definiera experimentell förfarande. </li><li> Sätt plattan i bioanalysen scanner och börja en baslinje läsa. Om detta är första läsning utförs på detta specifika plattan, låt skannern springa till jämvikt temperatur och eliminera drift i baslinjen. </li><li> Efter baslinjen har stabiliserats, eller åtminstone fem skannar, pausa läs- och mata ut plattan. </li><li> Avlägsna analysbufferten från brunnarna. </li><li> Spike kontroller med HLA A * 02: 01 monomer lager relevant (FLSL) eller irrelevanta (SLLV, YLEV eller KVL) peptider i koncentrationer från [,625-10 pg / ml] i analysbuffert. Lägg 50 pl av standarder för kontrollbrunnarna i plattan </li><li> Lägg 50 pl av analyt i analysbuffert till provetbrunnar i plattan. För denna analys spiked kommersiellt tillgängligt humant serum användes. </li><li> Sätt plattan tillbaka in i bioassay scanner och återuppta läsa tills mättnad uppnås, ca 30-60 min. </li><li> Pausa läs- och mata ut plattan. </li><li> Tvätta plattan 3 gånger med 200 pl / brunn PBST följt av tre sköljningar med 200 pl / brunn PBS som i steg 1.9. </li><li> Lägg 50 pl analysbuffert till alla aktiva brunnar. </li><li> Sätt plattan tillbaka i bioanalysen scanner och återupptar inläsningen för att övervaka eftertvätt resonans. </li><li> Stoppa läs- och mata ut plattan. OBS: Analysbufferten kan vara PBS, vävnadsodlingsmedium, eller humant serum utspätt 1:20 i PBS, beroende på målet för analysen. </li></ol> 3. Dataanalys <ol><li> Analysera med hjälp av bioassay skannerprogrammet eller exportera rå datafiler till drog statistisk programvara analys. Bioanalysen scanner programvara genererar automatiskt bindningskurva baserad påplatta layout tillhandahålls under experimentuppställning. OBS: Om du inte använder bioassay skannerprogrammet för analys, följ steg 3,2-3,4. </li><li> Subtrahera baslinjen och negativ kontroll från varje efterföljande datapunkt. </li><li> Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för brunnar i replikat vid varje tidpunkt. </li><li> Generera en graf av bindningskurvan eller välj slutpunktsdata för stapeldiagram. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Författarna, Debra Wawro Weidanz och Robert Magnusson, är respektive verkställande direktör och Chief Technology Officer på Resonant Sensorer Incorporated, som producerar de bioassay plattläsare och analysplattor används i denna artikel.

Den metod som beskrivs häri introducerar en biomarkör screening system för cancerdiagnostik som skulle möjliggöra snabb detektion av lösliga peptid / HLA-komplex i patientens serum, plasma, urin eller salivprov i en hög genomströmning 96- eller 384-väl format. Detta analyssystem som använder T-cellreceptor mimicking monoklonala antikroppar och en märkning fritt detekteringssystemet skär analystiden till mindre än en timme jämfört med 3,5 timmar med konventionell ELISA. Denna hög genomströmning tillvägagångssätt möjliggör snabb skiktning av patienter till kliniska prövningar för terapeutiska cancervacciner eller proteinläkemedel. Nuvarande metoder för detektion av dessa mål sjukdoms kräver affinitetsrening och HPLC-MS / MS enskilda patientprover, ett besvärligt och tidskrävande process. Även om denna metod är mottaglig för konventionella ELISA-tekniker, det finns oro för att sekundära detektionsreagens såsom anti-β2 mikroglobulin antikropp kan förändra strukturen på begynnande HLEn molekyl och hämmar bindning till TCRm begränsande upptäckt. Etikett-detektering minskar dessa bekymmer. Detta förfarande kan modifieras för användning på andra märkningsfria system såsom en ytplasmonresonans-system. Emellertid skulle detta i hög grad minska de högre genomströmningskapacitet jämfört med bioassay system som används i denna studie. Detta protokoll kan effektivt modifieras för detektion av icke-HLA biomarkörer i patientserum och plasma med vidhäftning till några kritiska steg. Övervakning av den initiala antikroppbeläggningsprocessen rekommenderas för optimering av ytan, som en &lt;200 pm förskjutning kommer sannolikt att resultera i låg signal för det efterföljande steget detektering. Baslinjen och eftertvätt läser är användbara för ändpunktsanalys som överflödet av serumproteiner kan maskera bindning av låg koncentration analyt. Slutligen kan temperaturvariation av prover resultera i brunn till brunn variation. Det rekommenderas att alla prover förinkuberas end etiketten fria biosassay enhet temperaturregulator ställas in på 2-3 ° C över rumstemperatur. Kylda prov bör få tillräckligt med tid för att nå arbetstemperatur. Framtida ändringar av detta protokoll kommer att omfatta multiplexering av TCRm på plåtytan. Bioanalysen systemet för närvarande är mottaglig för spotting av brunnar vid en densitet av åtminstone 8-Plex. Genom att införa 4-8 TCRm till varje brunn, per provprovvolymer minskar och möjliggör insamling av allt mer komplexa data per patient. Denna förmåga kan ytterligare informera patienter när det gäller behandlingsalternativ.

De klass I HLA-antigen (HLA) Prover peptider av 8-11 aminosyror i längd härledda från proteasomal nedbrytning av det intracellulära proteinet repertoar och presenterar dessa peptider på ytan av varje kärnförsedd cell 1,2. HLA-komplex är &quot;naturens biomarkör&quot;, vilket indikerar att hälsa varje cell (Figur 1) till cirkulerande cytotoxiska T-lymfocyter (CTL). Erkännande av sjukdom associerad peptider leder eliminering av den felande cellen genom CTL. Således är det adaptiva immunsvaret mycket effektiv på att eliminera viral infektion och tumör. Men utövar immunsystemtryck som ofta främjar val för virus eller tumör som kan kringgå en effektiv CTL respons. T-cellreceptor mimicking (TCRm) monoklonala antikroppar (mAbs) som känner igen specifika peptid / HLA-A * 02: 01 komplex, såsom de som är härledda från bröstcancer associerade proteiner, migration av makrofager inhiberande faktor (MIF19-27) 3 och NY-ESO-1 157-165, möjliggör upptäckt och förstörelse av bröstcancerceller i avsaknad av en effektiv anti-tumör CTL-svar 4,5. Denna representativa arbete är inriktat på HLA-A * 0201-molekyl, som uttrycks med upp till 30% av befolkningen. Men identifieringen av andra relevanta HLA / peptidkomplex, följt av produktionen av TCRm möjliggör utvecklingen av riktade immunterapier och diagnostik följeslagare sjukdom, utöka nyttan av detta arbete till en mycket bredare population. En del av peptiden / HLA-komplexen bundna till cellytan frisätts in i plasman. På grund av den mycket komplicerade karaktären av peptid / HLA pooler, nuvarande metoder för gruvdrift immunopeptidome för HLA associerade biomarkörer är tidskrävande. Denna process kräver att affinitetsrening av lösligt HLA från plasma, separation av HLA associerade peptider genom omvänd fas högtrycksvätskekromatografi(RP-HPLC) och peptid sekvense med tandem masspektrometri (MS / MS) 6,7. Även om denna process är ett gångbart alternativ för upptäckten av nya terapeutiska mål, det är en besvärlig process som sällskap diagnostiskt verktyg för HLA tillhörande mål redan i den terapeutiska vaccin eller biofarmaceutiska rörledning 8-10. TCRm riktad mot dessa mål ger verktygen för snabb följeslagare diagnostisk utveckling som syftar till att stratifiera patienter i relevanta kliniska prövningar och ge mer välgrundade terapeutiska alternativ. I detta arbete är ett genombrott biomarkör screening system för cancerdiagnostik presenteras som utnyttjar TCRm och en etikett fritt bioassay system som övervakar biologiska interaktioner med minimala processteg. Etiketten fria bioanalys-systemet bygger på en metod, som utnyttjar den guidade-modsresonans (GMR) verkan som inträffar i dielektriska vågledargitter 11-14. När bredbandsljus kontakt med diffraktivarivning i plattorna som erfordras för detta system, är två specifika våglängder reflekteras. Den bindningsinteraktionen mellan en immobiliserad receptor och dess ligand övervakas i realtid genom att spåra resonansvåglängdsförändring med en spektrumanalysator 12. Separata resonanstoppar uppstå av incident TE (elektrisk vektor normal till planet infalls) och TM (magnetiska vektor normal till planet infalls) polarisationstillstånden ger flera datapunkter som potentiellt kan öka upptäckt noggrannhet 11,14. Användning av antikropp pre-sensibiliserade plattorna i denna etikett fritt analyssystem, tidsanalyskörning med dataanalys är ca 45 min. Dessutom kan flera patientprover avfrågas i en 96- eller 384-brunnsformat, en klar fördel gentemot en HPLC-MS / MS-baserat format.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Enligt American Cancer Society, kommer mer än 200.000 kvinnor diagnostiseras med invasiv bröstcancer varje år och cirka 40.000 kommer att dö av sjukdomen. Den mänskliga leukocytantigen (HLA) klass I prover peptider härledda från proteasomal nedbrytning av cellulära proteiner och presenterar dessa fragment på cellytan för förhör genom cirkulerande cytotoxiska T-lymfocyter (CTL). Generering av T-cellreceptor härmare (TCRm) monoklonala antikroppar (mAbs) som känner igen bröstcancer specifik peptid / HLA-A * 02: 01 komplex, såsom de som härrör från migration av makrofager inhiberande faktor (MIF 19-27) och NY-ESO- 1 157-165 möjliggör upptäckt och förstörelse av bröstcancerceller i avsaknad av en effektiv anti-tumör CTL-svar. Intakta klass I HLA / peptidkomplex fälls av bröstcancerceller och representerar potentiellt relevanta cancer biomarkörer. I detta arbete, ett genombrott biomarkör screening system för cancer diagnostiks införliva T-cellreceptor mimic monoklonala antikroppar i kombination med en roman, märkningsfri biosensor utnyttjar guidad-modsresonans (GMR) sensorteknik presenteras. Detektering av skjul MIF / HLA-A * 02: 01 komplex i MDA-MB-231-cellsupernatanter, spetsade humanserum, och patientplasma demonstreras. Effekterna av detta arbete skulle kunna revolutionera personlig medicin genom utveckling av diagnostik följeslagare sjukdoms för riktade immunterapier.

En representativ uppsättning av experiment utfördes med användning av den välkarakteriserade TCRm, RL21A, en murin IgG2a monoklonal antikropp som specifikt känner igen en peptid (MIF 19-27 eller FLSL) inom ramen för HLA-A * 02: 01-molekylen tre. Den besläktade peptid / HLA-monomer, samt irrelevant HLA monomer 15, användes för att demonstrera det beskrivna förfarandet. Figur 3 illustrerar analysformatet. RL21A är specifik för FLSL / HLA-monomer med liten korsreaktivitet med andra peptid / HLA-komplex 3. Denna specificitet rekapituleras använder etiketten fria bioassay systemet (Figur 4). Känsligheten av etiketten fria bioanalys system för detta experiment är i det låga nanomolära området som bestäms genom titrering av RL21A antikropp på immobiliserad FLSL / HLA-monomer (Figur 5). Även bakgrundssignalen ökar avsevärt i serumprover, sÄRSKILD upptäckt av FLSL / HLA monomer i spetsiga humant serum uppnås i figur 6 och en koncentrationsgradient är lätt urskiljbara i dessa prover. Slutligen supernatanter från MDA-MB-231-cellinjen, som tidigare visats presentera FLSL / HLA-A * 02: 01-molekylen, är visade sig innehålla löslig FLSL monomer använder denna etikett fritt analysplattform (figur 7). Efterföljande tillsats av FLSL / HLA monomer ökar signalen på RL21A (Figur 7). På grund av känsligheten i systemet, väl till såväl variationer inklusive negativa resonans skift kan uppstå som en följd av temperatursvängningar som ses som en funktion av de standardavvikelser i figurerna 4 och 5. Dessa variationer kan minskas dramatiskt genom förinkubation av samtliga prover och bioanalysen plattläsare vid en temperatur i svagt överskott av rumstemperatur (dvs 28 ° C). I figur 8, i korthet, 96-Jo polystyren-plattor belades med [10 | ig / ml] av RL21A för 2 h vid rumstemperatur, tvättades med PBST, blockerades med 0,5% lättmjölk, tvättades med PBST och inkuberades under 2 h vid rumstemperatur med serieutspädningar av FLSL HLA monomer i normalt humant serum utspätt 1:10 i PBS för att generera en standardkurva eller patientplasma utspädd 1:10 i PBS. Plattan tvättades med PBST, inkuberades 1 h vid rumstemperatur med kanin-anti-human-β2-mikroglobulin [1: 5000] för att detektera intakt HLA, och tvättades i PBST. Plattorna inkuberades sedan under 30 min med get-anti-kanin-IgG [1: 10000] och tvättades med PBST. Kolorimetrisk detektion utfördes med användning av ABTS (2,2&#39;-azinobis [3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra] -diammonium salt) substrat med en 15 min inkubation tid och observerades vid 405 nm på en mikroplattläsare. FLSL / HLA upptäcktes i tre patientprover. I figur 8B, var patientplasma RL.064 utspätt 1:20 i PBS och sedan läggaed till plattan och övervakas på etiketten fria detektor för 60 min. Specifik detektion av FLSL / HLA komplex i patientserum fördes. Students t-test utfördes med användning av grafer och statistik programvara (p &lt;0,05). I figur 8C, var vävnadssektioner färgade vid 1 pg / ml med mus-anti-HLA-A2 (BB7.2) som en positiv kontroll, RL21A, IgG2b och IgG2a respektive som negativa kontroller. Färgning detekterades med hjälp av en anti-mus upptäckt kit, DAB (diaminobenzadine), och hematoxylin QS för nukleär färgning enligt anvisningar från tillverkaren. Färgning av tumörvävnad från RL21A bekräftar presentation av FLSL / HLA-komplex. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figur 1:. Tumörantigenpresentation av klass I HLA-antigen Cancerous omvandling är en intracellulär sjukdom. HLA prov intracellular proteiner och avslöjar cancerrelaterade förändringar vid cellytan. CTL och TCRm kan känna igen cancerceller genom HLA-peptidkomplex distinkta till dessa celler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figur 2:. Skärmdump av datainsamling i bioassay skannerprogrammet Exempel på datainsamling visar den initiala baslinjen skanna följt av RL21A antikropps Förutom en platta belagd med 10 mikrogram / ​​ml FLSL / HLA-komplex. Halterna av antikroppar är angivna. Varje linje representerar en individuell brunn övervakades över tiden. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figur 3:. Analysformat Illustration av antikroppar immobiliserade på den diffraktiva gitterytan av analysplattan fånga relvanta peptid / HLA-komplex i lösning. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figur 4: specificitet RL21A för FLSL / HLA-komplex Demonstration av specificitet biotinylerad RL21A TCRm för dess betydelse (FLSL) HLA monomer jämfört med irrelevant HLA monomer (YLEV, SLLV och KVL).. Biotinylerad RL21A TCRm [10 | ig / ml] immobiliserades på den avidinbelagda analysplattan yta och detektion utfördes med användning av omärkt relevant eller irrelevant HLA-monomer [10 ^ g / ml] i PBS. RL21A var specifik för FLSL / HLA Complex. Tvåvägs ANOVA utfördes med användning av grafer och statistik programvara (p &lt;0,001). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figur 5:. Bindning känslighet RL21A till dess besläktade peptid / HLA-komplex Illustration av detectipå gränsen och bindande känslighet RL21A till FLSL / HLA-komplex. Biotinylerad HLA Monomer FLSL [10 | ig / ml] immobiliserades på analysplattan ytan och omärkt RL21A sattes till plattan i seriespädningar i PBS såsom anges. Detection för detta system var i det låga nanomolarområdet. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figur 6: Detektion av HLA-komplex i spetsade humanserum Demonstration av detekteringen av HLA i humant serum.. Biotinylerad RL21A TCRm [10 | ig / ml] immobiliserades på den avidinbelagda analysplattan yta. Poolad normalt humant serum spetsat med relevant (FLSL) eller irrelevanta (SLLV) HLA-monomer späddes 1:20 i PBS och sedan till plattan och övervakas på etiketten fria detektor för 60 min. Specifik detektion av FLSL / HLA-komplex i humant serum uppnåddes. I allmänhet är hög bakgrundssignal (irrelevant SLLV monomer)er för utspädda serumprover jämfört med renade analyter i PBS (se figur 4). Tvåvägs ANOVA utfördes med användning av grafer och statistik programvara (p &lt;0,0001). <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figur 7:. Lösliga HLA-komplex detekterades i bröstcancer cellkultursupernatanter Förmågan att upptäcka HLA i bröstcancer cellsupematanter demonstreras. Biotinylerade RL21A TCRm, RL9A TCRm (negativ kontroll), och en isotypkontroll immobiliserades på analysplattan ytan. Spiked [5 | ig / ml] och ospetsade MDA-231 cellkultursupernatanter tillsattes och bindningen övervakades under 60 min på etiketten fria detektorn. FLSL och SLLV HLA-monomer spetsade proverna representerar positiva kontroller för RL9A och RL21A bindande. Envägs ANOVA utfördes med användning av grafer och statistik programvara (p &lt;0,0001). Figur 8:. Specifik detektering av FLSL / HLA-komplex i patientprover (A) En traditionell enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) användes för att detektera FLSL / HLA specifika komplex i plasma hos patienter. (B) Biotinylerad RL21A TCRm eller IgG2a [10 | ig / ml] immobiliserades på avidin analysplatta. (C) Brösttumörvävnad från patienter RL.064 var färgade som tidigare beskrivits 3 för att verifiera tumör presentation av FLSL / HLA-komplex. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology at JoVE.com

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intakta klass I HLA / peptidkomplex fälls av cancerceller, vilket motsvarar en potentiell relevant cancer biomarkör. Använda märkningsfri sensorteknik och T-cellreceptor mimicking monoklonala antikroppar, detektion av skjul MIF / HLA-A * 02: 01 komplex i MDA-MB-231-cellsupernatanter, spetsade humanserum, och patientplasma demonstreras, vilket möjliggör utveckling av en roman cancer diagnostisk plattform.

Upptäckt av HLA-antigen Biomarkers i bröstcancer Använda Label fria Biosensor Teknik

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Icke-invasiv avbildning av Leukocyt Homing och migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Detektering av invasiv pulmonell aspergillos i hematologiska maligniteter patienter med Lateral-Flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Använda Antigen Capsid-inkorporering strategi för utveckling av adenovirus serotyp 5-vektor Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital mikroskopi av leukocyt-endotel och Platelet-leukocyter Interaktioner i Mesenterial Veins hos möss

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Alstrande<em&gt; De Novo</em&gt; Antigenspecifika Human T-cellreceptorer från Retroviral Transduction av Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Ultrasensitive identifiering av biomarkörer med hjälp av en Molecular Imprinting baserat kapacitiv Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

En Protein Microarray analys för serologisk bestämning av Antigen-specifika antikroppen Svaren följande Clostridium difficile infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...