Name: atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping
Uploaded: 2014-10-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping at JoVE.com

Die NSF-MRT-Programm (CHE: 1229103) ist für die Finanzierung des Kaufs von neuen Steuerelektronik, Software, Flüssigkeitszellen und andere Geräte benötigt, um eine Dual-AFM / STM zusammen anerkannt. Wir erkennen die gemeinsamen Einrichtungen an der Universität von Chicago NSF-MRSEC Programm (DMR-0820054) für die Unterstützung bei AFM Instrumentierung, Ausbildung und Bildgebung, und für Systemzeit von der Materialforschung Einrichtungen Network (DMR-0820054) zur Verfügung gestellt. Wir danken besonders Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, und Prof. Ka Yee Lee für vor die Finanzierung des NSF-MRT Vorschlag, dass die notwendige Messtechnik, um unsere Campus gebracht begrüßen unsere Studenten. Wir erkennen die Finanzierung aus einem Titel III STEM Grant (ID: P031C110157) Northeastern Illinois University verliehen, die Forschungsstipendien Sommer für Studierende und Lehr sowie Unterstützung für Verbrauchsmaterialien zur Verfügung gestellt. Schließlich erkennen wir Bruker-Nano, Inc. für die weitere instrumentale Unterstützung und für die Erlaubnis, reproduce ein Diagramm, das den Mechanismus der Peakforce QNM und das Wort ScanAsyst verwenden, um die automatische Software zu beschreiben.

1. Computer und Mikroskop Set Up <ol><li> Öffnen Sie das Ventil der N 2-Zylinder, und stellen Sie die Regler, um sicherzustellen, dass die Lufttisch schwimmt und Niveau. </li><li> Schalten Sie den Computer, Controller und Faseroptik-Licht in dieser Reihenfolge. </li><li> Stellen Sie den Scanner an AFM / LFM-Modus und in der Mitte der Kamera über der AFM Kopf. </li><li> Offene Software. Wählen Experiment Kategorie &quot;Nanomechanische Eigenschaften&quot;, &quot;Quantitative Nano Mapping&quot; unter Exper...

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

AFM ist ein Rastersondenmikroskopie Verfahren vollständig in der Lage Abbildung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen in physiologisch relevanten Bedingungen. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie und NMR, eine Begrenzung der AFM ist ihre Unfähigkeit, die gleiche Auflösung, insbesondere die laterale Auflösung zu erzielen. Bei der Verwendung von AFM, ein Molekül auf einer Oberfläche zu analysieren, müssen die Auswirkungen der Oberfläche und der Sonde auf dem Bild des Moleküls auch bei der Dat...

Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein sehr wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der strukturellen und mechanischen Eigenschaften von Oberflächen, dünne Filme und Einzelmoleküle seit seiner Erfindung im Jahr 1986 (Abbildung 1). 1-3 Verwendung einer flüssigkeits Zelle hat das Verfahren werden in einem physiologisch relevanten Umwelt besonders nützlich in Studien von biologischen Makromolekülen und sogar lebende Zellen. 4-10 Tapping-Mode-AFM ist traditionell für die Abbildung von weichen Materialien oder locker gebundenen Moleküle an die Oberfläche, da der Kontakt-Modus AFM verwendet worden ist in der Regel nicht geeignet aufgrund auf die Schäden, die durch die seitlichen Kräfte verursacht auf die Probe ausgeübt durch den Freischwinger. Tapping-Modus 11 AFM wesentlich reduziert diese Kräfte, indem er die Spitze weise die Oberfläche berühren und nicht in ständigem Kontakt. In diesem Modus wird der Ausleger an oder nahe seiner Resonanzfrequenz normal zu der Oberfläche in Schwingungen versetzt. Ähnlich wie bei Kontaktmodus AFM ist Topographie analdurch Auftragen der Bewegung der Z-Piezo als eine Funktion der xy-(Abstand) yzed. Die Ausleger Dynamik bei oder nahe der Resonanz sehr instabil; daher sind sie sehr schwierig, außerhalb eines &quot;steady-state&quot; Situation zu automatisieren. Genauer gesagt, diese Dynamik hängen sowohl von der Probeneigenschaften und Scan-Umgebung. Für eine weiche Molekül auf eine Fest (er) Oberfläche adsorbiert, kann eine gut abgestimmte Rückkopplungsschleife für das Molekül zu Rückkopplungsschwingung für die Oberfläche führen. Betrieb in Fluid erschwert die Abstimmung des Auslegers. Änderungen der Temperatur oder Flüssigkeitsstände erfordern ständige Nachjustierung der Sollwert, Gewinne und andere Bildparameter. Diese Anpassungen sind in der Regel sehr zeitaufwendig und anspruchsvoll für die Nutzer. Spitzenkraft Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM), wie Tapping Mode AFM, vermeidet lateralen Wechselwirkungen von intermittierend Kontaktieren der Probe (Abbildung 2). 12-15 &lt;/ Sup&gt;, arbeitet jedoch PF-QNM in nicht-resonanten Modus und Frequenzen viel niedriger als Tapping-Mode-AFM. Dadurch entfällt die Abstimmung Herausforderungen Tapping-Mode-AFM, insbesondere durch das Vorhandensein der Flüssigkeit verstärkt. Mit PF-QNM werden Bilder, indem sie eine Kraft-Antwort-Kurve an jedem Kontaktpunkt gesammelt. Mit dem Zusatz von ScanAsyst Software können 15 Einstellung der Scan-Parameter automatisiert werden und ein hochauflösendes Bild in einer Angelegenheit von Minuten mit dem auch unerfahrene Benutzer erhalten. Sobald der Benutzer mehr mit dem AFM wird, können einige oder alle der automatisierten Parameter zu jeder Zeit, die die Bildqualität der Experimentator manuell ermöglicht die Feineinstellung deaktiviert. Seit seiner Gründung PF-QNM wurde angewandt, um Bakteriorhodopsin, ein Membranprotein und andere native Proteine ​​auf der submolekularen Ebene abzubilden. 16-18 Für Bakteriorhodopsin, gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinflexibilität und Röntgenkristallstrukturen. PF 12 -QNM ist verwendet worden, lebende Zellen mit einer hohen Auflösung zu untersuchen. 19,20 Darüber hinaus hat PF-QNM Daten aufgeklärt wichtige Verbindungen zwischen Struktur und Mechanik in der Erythrozytenmembran, die für die Zellintegrität und Funktion sind. 21. Wir haben Rastersondenmikroskopie (SPM) Verfahren eingesetzt, darunter 22 AFM, 23, um die Struktur der Rotlicht-Photorezeptoren genannt Bakteriophytochrome (BphPs) zu studieren. 24,25 Sie bestehen aus einer Lichtsensormodul kovalent an eine Signal-Effektor-Modul verlinkten Histidin-Kinase (HK). 26 Die Lichterfassungsmodul enthält typischerweise einen Bilin-Chromophor, der bei der Absorption eines Photons strukturelle Umwandlung erfährt, mit einer Reihe von strukturellen Veränderungen Erreichen der Signal-Effektor-Modul und die zu einer globalen Transformation des gesamten Proteins . 24,27-29 Basierend auf dieser Transformation gibt es zwei unterschiedliche Lichtabsorptions sTates von BphPs, einem roten und dunkelrotem Licht absorbierenden Zustand, als Pr und Pfr bezeichnet. Pr ist thermisch stabil, dunkeladaptierten Zustand für die meisten BphPs. 28. Die molekularen Grundlagen der Pr / Pfr-Photo nicht vollständig aufgrund der begrenzten Strukturwissen dieser Proteine ​​zu verstehen. Mit Ausnahme einer Struktur von D. durans, sind 30 alle veröffentlichten Röntgenkristallstrukturen dieser Proteine ​​in der dunkeladaptierten Zustand und Effektor-Domäne fehlt. Die intakten BphPs sind zu groß, um wirksam durch Kernspinresonanz (NMR) untersucht werden und sind notorisch schwierig in ihrer intakten Form kristallisieren (insbesondere in der Licht adaptierten Zustand) für Röntgen-Kristallographie. BphPs wurden vor kurzem als Infrarot-Fluoreszenzproteinmarker entwickelt worden (IFP). 31. Strukturelle Charakterisierung dieser Proteine ​​kann Hilfe in effektive IFP Design zu fördern. 32-36 Der Schwerpunkt dieses Artikels ist es, ein Verfahren für präsentierenAbbildung BphPs mit Flüssig-Zelle über AFM PF-QNM. Das Verfahren wird durch Untersuchungen der licht adaptierten Zustand des Bakteriophytochrom RpBphP3 (P3) aus dem Photosynthesebakterium R. nachgewiesen palustris. Das hier vorgestellte Verfahren AFM ist bequem und einfacher Ansatz zur Darstellung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen. Mit diesem Verfahren können strukturelle Einzelheiten der einzelnen Moleküle in einem kurzen Zeitraum, ähnlich einer oberen Ebene Wissenschaft natürlich Laborsitzung gesammelt werden. Über Messquerschnitte und Erfüllen weiteren eindimensionalen Analysen können experimentelle Daten, um nützliche Rechenmodelle verglichen werden. 37-42

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet eine Pyramidenspitze auf einem Ausleger angebracht ist, um die Kraftantwort der Oberfläche zu untersuchen. Die Auslenkungen der Spitze kann durch einen Laser und Detektor in Sektoren, die Topographiebild umgerechnet werden können gemessen werden, um ~ 10 pN. Amplitudenmodulation oder &quot;Tapping Mode&quot; AFM umfasst die Sonde so intermittierenden Kontakt mit der Oberfläche beim Oszillieren bei seiner Resonanzfrequenz, um ein Bild zu erzeugen. In Verbindung mit einer Fluidzelle verwendet, Tapping-Mode-AFM ermöglicht die Abbildung von biologischen Makromolekülen, wie Proteinen in physiologisch relevanten Bedingungen. Tapping-Mode AFM erfordert manuelle Abstimmung der Sonde und häufige Anpassungen aus einer Vielzahl von Scan-Parameter, die schwierig sein kann für unerfahrene Anwender. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, sind diese Anpassungen die meiste Zeit. Peakforce Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM) erzeugt ein Bild durch die Messung einer Kraft Verantse Kurve für jeden Berührungspunkt mit der Probe. Mit ScanAsyst Software können PF-QNM automatisiert werden. Diese Software passt den Sollwert, Antriebsfrequenz, Abtastrate, Gewinne und andere wichtige Scan-Parameter automatisch für eine bestimmte Probe. Nicht nur, dass dieses Verfahren zum Schutz sowohl zerbrechlich Sonden und Proben, es reduziert die erforderliche Zeit, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. PF-QNM ist für AFM in Flüssigkeit kompatibel; Daher war es umfangreiche Anwendung zur Abbildung biologisch relevanten Materialien. Die in diesem Papier vorgestellte Methode beschreibt die Anwendung von PF-QNM, um Bilder von einer bakteriellen Rotlicht-Photorezeptor, RpBphP3 (P3) zu erhalten, aus photo R. palustris in seinem Licht-adaptierten Zustand. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden einzelne Protein Dimere von P3 und Aggregate von Dimeren auf einer Glimmer-Oberfläche in Gegenwart eines bildgebenden Puffer beobachtet. Mit entsprechenden Anpassungen an die Oberfläche und / oder der Konzentration der Lösung, wobei dieses Verfahrenkann allgemein auch für andere biologisch relevante Makromoleküle und weichen Materialien angewendet werden.

Vertreter AFM-Bilder von einem Photorezeptor-Protein, P3, in seinem Licht-adaptierten Zustand sind in den 3 und 4 dargestellt. Ein frisch geschnittenen Glimmer-Substrat (3A) ist eine geeignete, ebene Fläche für Protein-Adsorption. Sammeln eines Bildes saubere Glimmer als Negativkontrolle ist aus mehreren Gründen wichtig. Zunächst versichert es der Flüssigkeitszelle ist sauber und keine Reststoffe aus früheren Experimenten wird die Oberfläche verunreinigen. Zweite...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Research

JoVE Journal

Engineering

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Vorbereitung und Reibungskraftmikroskopie Messungen mischbar, Entgegenpolymerbürsten

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

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Ingenieurwesen

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Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

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Abklingende Feld Basierend Photoakustik: Optische Objektbewertung an Oberflächen

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