Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden unter Leitlinien von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of Louisville gesetzt durchgeführt, um Bundesvorschriften einzuhalten. 1. Vorbereitung der Low Ca 2+ und 2 mM Ca 2+ Künstliche Liquor (aCSF) Perfusaten <ol><li> Bereiten 2x niedrigen Ca 2+ (0,1 mM) Auf C-Puffer, 2x Normal Ca 2+ (2 mM) Auf A-Puffer und 2x Auf B-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben....

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+regulating+axon+regeneration:+an+integrin+perspective.">Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).</li><li>McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+in+combinatorial+approaches+for+spinal+cord+regeneration.">Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration.</a> Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).</li><li>Pernet, V., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo-A+in+axonal+plasticity,+regrowth+and+repair.">The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).</li><li>Bradbury, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitinase+ABC+promotes+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.</a> Nature. 416, 636-640 (2002).</li><li>Cregg, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+beyond+the+glial+scar.">Functional regeneration beyond the glial scar.</a> Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).</li><li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN/mTOR+pathway.">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+wld(s),+and+nmnat.">Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Sulaiman, W., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+peripheral+nerve+injury,+regeneration,+and+functional+recovery:+from+bench+top+research+to+bedside+application.">Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application.</a> Ochsner J. 13, 100-108 (2013).</li><li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy:+the+precursor+to+axon+regeneration.">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).</li><li>Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganized+microtubules+underlie+the+formation+of+retraction+bulbs+and+the+failure+of+axonal+regeneration.">Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration.</a> J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).</li><li>Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+degeneration+'dieback'+in+the+corticospinal+tract+after+transection+injury+of+the+rat+spinal+cord:+a+confocal+microscopy+study.">Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study.</a> J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).</li><li>Fishman, P. S., Mattu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+severed+cortical+projection+axons.">Fate of severed cortical projection axons.</a> J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).</li><li>McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+activated+phagocytes+and+myelin+degeneration+to+axonal+retraction/dieback+following+spinal+cord+injury.">The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury.</a> Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+treatment+reduces+delayed+oligodendrocyte+death,+attenuates+axonal+dieback,+and+improves+functional+outcome+after+spinal+cord+injury.">Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+laser-scanning+microscopy+of+Ca2++dynamics+in+visual+motion-sensitive+neurons.">In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).</li><li>Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+of+cortical+astrocytic+networks+in+vivo.">Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo.</a> PLoS Biol. 2, 96 (2004).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-+and+short-term+intravital+imaging+reveals+differential+spatiotemporal+recruitment+and+function+of+myelomonocytic+cells+after+spinal+cord+injury.">Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury.</a> J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58, 1133-1144 (2010).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+cortex+in+vivo.">Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nat Commun. 3, 1227 (2012).</li><li>Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+maintenance+of+molecular+domains+in+myelinated+axons.">Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons.</a> J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2-mediated+alternative+activation+of+microglia+is+protective+after+spinal+cord+injury.">Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury.</a> Brain. 137, 707-723 (2014).</li><li>Greenspan, P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrofluorometric+studies+of+the+lipid+probe,+nile+red.">Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red.</a> J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li><li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice.">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+white+matter+in+central+nervous+system+pathophysiologies.">Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies.</a> ASN Neuro. 4, (2012).</li><li>Matute, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dyshomeostasis+in+white+matter+pathology.">Calcium dyshomeostasis in white matter pathology.</a> Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).</li><li>Stys, P. K., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+NMDA+receptors:+an+unexpected+new+therapeutic+target.">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li><li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+anoxia:+a+tale+of+two+white+matter+tracts.">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li><li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Bildgebung des Rückenmarks myelinisierten Axone (dh Fasciculus gracilis), kombiniert mit einem Laser-induzierte Verletzung des Rückenmarks, die dynamische Fortschreiten der primären und sekundären myelinisierten axonale Degeneration im Laufe der Zeit zu studieren. Ex-vivo-Bildgebung der Oberfläche das Rückenmark überwindet viele der Komplikationen, die mit in-vivo-Abbildung zugeordnet, wie Bewegungsartefakte und das Potential der Experi...

Degeneration von Axonen ist eine prominente Ursache für Morbidität über mehrere neurologischen Erkrankungen einschließlich Neurotrauma, Schlaganfall, Autoimmunerkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen. Im Gegensatz zu dem peripheren Nervensystem (PNS), Zentralnervensystem (ZNS) Axone haben eine begrenzte Kapazität zu regenerieren, sobald aufgrund sowohl intrinsische als auch extrinsische Barrieren (dh inhibitorische Moleküle axonale Wachstum während der Narbenbildung während der Myelindegeneration produziert und freigesetzt) ​​1 verletzt -7. Obwohl einige dieser Hindernisse wurden intensiv erforscht, therapeutische Interventionen Ziel, ZNS-axonale Degeneration verhindern, fördern robuste axonale Regeneration und Wiederherstellung funktions verbindend, begrenzt bleiben. Axone einmal von ihren Soma getrennt durchlaufen eine stereotype Prozess der Degeneration wie Waller-Degeneration, die durch axonalen Schwellungen, Sphäroid Bildung und eventuelle Fragmentierung (in 8 mit Beiträgen) gekennzeichnet ist bekannt. InDagegen ist der proximale Stumpf, der in Kontinuität mit dem Soma eines durchtrennten peripheren Axonen bleibt, bildet eine Schwellung an seinem Ende, Matrizen zurück zur nächsten Knoten Ranvier, und kann dann zu initiieren Wachstumskegel Aufstellung für nachfolgende axonale Regeneration eine wichtige Voraussetzung erforderlichen 9-11. Im Gegensatz dazu sind die proximalen Enden von axonalen vielen zentralen Axone bilden charakteristische &quot;endbulbs&quot; oder Einfahren Glühbirnen, nicht zu Wachstumskegeln bilden, und statt zurückzuziehen von der Verletzungsstelle, wo sie für die Monate nach der Verletzung 12-15 bleiben. Neben der primären axonalen Schädigung, können zusätzliche axonalen Schäden / Verluste auch Axone, die im Wesentlichen aus der anfänglichen Verletzung verschont auftreten. Diese verzögerte axonalen Verlust zunächst verschont Axone wird als Sekundär axonale Degeneration bezeichnet. Diese inhärente Reaktion von ZNS Axone Schädigung macht funktionale axonale Regeneration noch schwieriger Ziel im Gehirn und Rückenmark zu erreichen. Obwohl hallmarks der axonalen Schädigung (zB Sphäroidbildung, Rückzug Glühbirnen) wurden auch von post-mortem Gewebe und experimentellen Modellen der axonale Degeneration gekennzeichnet hat Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser dynamischen Prozesse sind beschränkt. Die meisten dieser Studien angeführten statischen Endpunkt Beobachtungen, die von Natur gescheitert einzelne axonalen Antworten über die Zeit zu erfassen. Obwohl exogen applizierten axonalen Tracern nützlich gewesen zu axonalen Antworten von statischen Abschnitten und während der Live-Bildgebung zu klären, hat die Verfügbarkeit von genetisch kodierten axonalen Marker stark verbessert unsere Fähigkeit, Axone in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. In der Tat, eine wegweisende Bericht Kerschensteiner und Kollegen zunächst vorgesehen unmittelbarer Nachweis der axonalen Degeneration und Regeneration in vivo mit Thy1 -GFP-S Mäuse, die das grün fluoreszierende Protein in Teilmengen von Neuronen, die ihre Projektionen in die Hinterstränge des Rücken senden kodierenKabel 16. Live-Imaging-Ansätze mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) und genetische fluoreszierende Protein Markierung von Zellen von Interesse nach wie vor direkte Beweise und mechanistischen Einblick in viele verschiedene dynamische Prozesse wie axonale Degeneration, Ca 2+ Signal, axonale Regeneration, Astrozyten Physiologie liefern, Mikroglia Physiologie und Reaktion auf eine Verletzung 17-25. Im Gegensatz zu den Axonen ist sehr wenig von Myelin Reaktionen auf Verletzungen in Echtzeit bekannt. Myelin ist ein wesentlicher Bestandteil der weißen Substanz produziert und von Oligodendrozyten im ZNS und Schwann-Zellen in der PNS erhalten. Myelin isoliert 99% der Oberfläche von Axonen und dadurch eine hochohmige, kapazitätsarme Schutzabdeckung, die eine schnelle und effiziente saltatory Impulsausbreitung, die kürzlich von Buttermore et al. 26 überprüft unterstützt. Um die Dynamik von Myelin, um Verletzungen verwenden wir die solvatochromen, lipophile erfassenFluoreszenzfarbstoff Nile Red 27. Solvatochromen Eigenschaften dieses Vitalfärbung erlauben Spektralverschiebungen seines Emissionsspektrums, das von der physikalisch-chemischen Umgebung 28,29 ist. Diese Eigenschaften sind nützlich, um Einblick in die Mechanismen der axomyelinic Verletzungen zu gewinnen und können mit entsprechend ausgewählten dichroitische und Emissionsfilter sichtbar gemacht oder gelöst mit spektralen Mikroskopie 27 werden. Zum Beispiel ist Nilrot Emissionsspektrum blau-verschoben in weniger polare lipidreichen Umgebungen, wie sie in Adipozyten und normale CNS Myelin (Spitzenemission ~ 580-590 nm) 27 gefunden. Im Gegensatz dazu Emissionsspektrum Spitzen dieser Vitalfarbstoff ist bei ~ 625 nm in endbulbs wie Axone gebildet ziehen axonalen Sterben 27. Obwohl die genauen Mechanismen dieser spektralen Verschiebungen speziell in endbulbs gegenüber normalen Myelin unklar bleiben, können solche spektralen Veränderungen zugrunde liegenden Veränderungen der Proteinakkumulation oder Desorganisation, die zu enthüllenExposition von hydrophoben Bindungsstellen 27. Während in-vivo-Bildgebung ist die entscheidende Messgröße für die Beobachtung des Rückenmarks axonalen Verletzungen Dynamik in ihrer natürlichen Umgebung, es ist technisch anspruchsvoll und erfordert erhebliche chirurgischem Know-how und oft wiederholen Operationen, um die dorsalen Säule, die experimentellen Artefakten führen kann ausgesetzt werden (zB Entzündungen und Narben Bildung). Außerdem ist teure Ausrüstung oft notwendig, um Suspendierung und Positionierung von einem intakten Tier unter der Mikroskopobjektivlinse ermöglicht. Die Tiere müssen sorgfältig überwacht werden, als auch, um sicherzustellen, bleiben sie warm, um sicherzustellen, Flüssigkeiten wieder aufgefüllt werden, und um sicherzustellen, gibt es keine Anzeichen von Hypoxie aufgrund längerer betäubt Imaging-Sitzungen. Letzteres ist äußerst wichtig, da Axone und Myelin unbedingt benötigen konstante Durchblutung und eine angemessene Sauerstoffgehalt lebensfähig zu bleiben. Dies ist jedoch oft nicht gemeldet oder in den meisten in-vivo-Studien zu überwachenDatum. Zusätzlich Bewegungsartefakte durch Herzfrequenz und Atmung (Isofluran erwachsenen Maus: ~ 300-450 Schläge pro Minute (BPM) ist optimal, um 97 bis 98% Sauerstoffsättigung (wie normal ~ 632 BPM) und pflegen ~ 55-65 Atemzüge pro min (normal ist ~ 163 Atemzüge pro min), beziehungsweise)) 30 während der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make begegnet differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie Herausforderung als auch die schnellsten Laserscans unvermeidlich unterliegen diese Bewegung Artefakte. Fortschritte in der ultraschnellen Resonanzscanner in Verbindung mit einem implantierbaren starren Wirbel gerahmte Fenster können Abbildung der Maus Rückenmark bei wachen Tieren zu ermöglichen, aber schnellere Scanzeiten zwangsläufig das Signal-Rausch-Verhältnis Bild erniedrigender Qualität. Weitere Verbesserungen in der Rückenmarksbildgebenden Verfahren, wie sie derzeit für die Bildgebung des Gehirns verwendet werden, können viele dieser Hindernisse zu überwinden und potenziellen verwechselt von ina eingeführt begrenzendequate Gewebedurchblutung, zB 31-33. Vieles, was über der weißen Substanz Physiologie und Mechanismen der weißen Substanz Verletzungen bekannt wurde nach den in vitro oder ex vivo Zubereitungen der weißen Substanz von Sehnerv, der peripheren Nerven und Bänder des Rückenmarks weißen Substanz 34 bis 41 bestimmt. Diese Präparate weiterhin unser Wissen über weißen Substanz Verletzungsmechanismen zu fördern, da sie ermöglichen eine kontrollierte Veränderungen der Umweltfaktoren, kontrollierte Anwendung von Arzneimitteln und Reagenzien, Funktionsprüfungen mit der Elektrophysiologie und die direkte Fluoreszenzmikroskopie Beobachtungen der Axone und Myelin in lebendem Gewebe. Doch einige frühere Ansätze zur Axone Rückenmark dorsalen Säule Streifen oder ventralen weißen Substanz Streifen beobachten unweigerlich verletzen Oberfläche Axone während der Entfernungsstufe, die die Reaktion von eng gegen Axone beeinflussen können. Um auf die experimentelle Manipulationen oben zu nutzen und vermeiden Schäden an der very Fasern untersucht, verwenden wir eine ex vivo Halsmark-Modell, da es einen direkten Kontakt der Dorsalseite des Kabels verhindert. Somit ist die Architektur der Pia und neben oberflächlichen dorsalen Säule Axone tragfähige und gelassen bleiben, während der Isolierung. Hier beschreiben wir eine relativ einfache Methode, die direkte Visualisierung von zentraler markhaltigen Axonen, da sie dynamisch mit einer Brenn Verletzungen in Echtzeit bis zu 8 reagieren können - 10+ Stunden nach der Verletzung. Die laserinduzierte Verletzung des Rückenmarks (Liščí) Modell erlaubt die Unterscheidung zwischen primären und sekundären axonalen Verletzungsmechanismen als primäre Läsion (Ablationsstelle) bleibt räumlich über die Zeit eingeschränkt. Die Open-Bad Abbildungskammer ist zugänglich für eine therapeutische Intervention, Reagenz Lieferung und Umwelt Manipulationen. Vermeintliche axomyelinic Schutzmittel lassen sich schnell in Echtzeit durch direkte Beobachtungen gegenüber langwierigen und kostenintensiven Experimenten mit Gewebeprozess bewertet werdening, Schneiden, Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse und daher eine nützliche Ersatzmodell zu akuten Reaktionen und Schutz Manipulationen vor der Prüfung die experimentellen Agenten mit lebenden Tieren zu bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Verletzte CNS Axone nicht zu regenerieren und oft zurückziehen von der Verletzungsstelle. Axone aus der anfänglichen Verletzung verschont später sekundärmetallurgisch axonale Degeneration. Mangel an Wachstumskegel Bildung, Regeneration, und der Verlust von weiteren markhaltigen Axonen Projektionen im Rückenmark stark einschränkt neurologische Erholung nach einer Verletzung. Um zu beurteilen, wie zentral myelinisierten Axone im Rückenmark, um Verletzungen zu reagieren, haben wir eine ex vivo lebenden Rückenmark-Modell unter Verwendung von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Axonen und eine Brenn und hoch reproduzierbare Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen zum Ausdruck bringen, um das Schicksal zu dokumentieren Axone und Myelin (lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nile Red) im Laufe der Zeit mit Zweiphotonenanregung Zeitraffer-Mikroskopie. Dynamische Prozesse wie akute axonale Verletzung, axonale Retraktion und Myelin-Degeneration sind am besten in Echtzeit untersucht. Doch die Nichtschwerpunkt Natur Prellung basierte Verletzungen und Bewegungsartefakte auftretenwährend der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Mikroskopie Herausforderung. Der Ex-vivo-Rückenmark-Modell hier beschriebenen imitiert verschiedene Aspekte der klinisch relevanten Prellung / Kompression induzierte axonalen Pathologie einschließlich axonalen Schwellungen, Sphäroidbildung, axonalen Durchtrennung und peri-axonalen Schwellungen ein nützliches Modell, um diese dynamischen Prozesse in Echtzeit zu studieren. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind ausgezeichnet räumlich-zeitliche Auflösung, die Differenzierung zwischen Primär- Beleidigung, die direkt verletzt Axonen und sekundären Verletzungsmechanismen ermöglicht; kontrollierte Infusion von Reagenzien direkt auf den Perfusat Bade das Kabel; präzise Änderungen der Umgebungsmilieu (zB Calcium, Natriumionen, bekannt Beitrag axonale Verletzung, aber praktisch unmöglich, in vivo zu manipulieren); und Maus-Modelle bieten auch einen Vorteil, da sie die Möglichkeit bieten, zu visualisieren und zumanipulieren genetisch identifizierten Zellpopulationen und subzellulärer Strukturen. Hier beschreiben wir, wie die Isolierung und das lebendige Bild Rückenmark von Mäusen, um die Dynamik der akuten axonalen Verletzungen zu erfassen.

Einzelheiten einer geeigneten Labor einrichten musste isolieren, halten die Lebensfähigkeit und die Bild ex vivo Rückenmark ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Mikroskop muss mit einem abstimmbaren gepulsten Femtosekundenlaser, entsprechende dicroics und Emissionsfiltern und einem wasser ausgestattet werden Eintauchen Objektivlinse mit einer hohen numerischen Apertur (≥1.0). Die Lebensfähigkeit des Rückenmarks während der Präparation zu gewährleisten, sollte das Verfahren in Gegenwart ...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

MÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¼ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Activity-based Training auf einem Laufband mit Rückenmark verletzt Wistar-Ratten

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Automatisierte Gait-Analyse zur Beurteilung der funktionellen Erholung bei Nagetieren mit peripheren Nerven- oder Rückenmarkskontitionsverletzungen

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Establishing a Mouse Contusion Spinal Cord Injury Model Based on a Minimally Invasive Technique

Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Using minimally invasive methods to model spinal cord injury (SCI) can minimize behavioral and histological differences between experimental animals, ...