Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في بعض الأنواع النباتية، مثل الكتان (LINUM usitatissimum)، كان ناجحا تحول النبات محدود. سابقا، والتحول في الكتان ويتطلب وجود عدوى الأجرعية التي كتبها جرح وزراعة المشترك، تطبيق الجسيمات biolistic أو باستخدام الموجات فوق الصوتية صوتنة، تليها تجديد. عملية في آن معا منذ فترة طويلة وعرضة للأن يرافقه العديد من الأحداث طفرية. وعلاوة على ذلك، فإن عملية اختيار هذه التقنيات تتطلب استخدام علامات اختيار المضادات الحيوية مثل الكانامايسين. ومع ذلك، فقد لوحظ في الأدب أن هذا الأسلوب في اختيار تنتج العديد من ايجابيات كاذبة، كما يميل الكتان للهروب تركيزات عالية من المضادات الحيوية 6،9،14. وكان ثمة عيب آخر من التقنيات السابقة في التحول الكتان انخفاض معدلات التحول 2،6. في بروتوكول الموصوفة هنا، وقد تبين الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار غمسأن يؤدي إلى معدل التحول عالية لالكتان (50 - 60٪). وقد تم الحصول على Transformants من الزهور انخفض والتي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. وقد تم اختيار transformants إيجابية ببساطة عن طريق زراعة النباتات T1 على التربة وفحص أوراقها قريبا بعد أن نبتت، واستخدام المضادات الحيوية-اختيار المارة، وهي خطوة المستخدمة سابقا كقاعدة في الأزهار وتراجع للأنواع النباتية الأخرى. عن طريق إجراء اختبار PCR المباشر من الأوراق، وباستخدام بادئات T-DNA المناسبة، transformants إيجابية يمكن اختيار بسرعة. هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وسهلة لأداء، ولكن النتائج في معدل التحول أعلى بكثير من تلك التي ذكرت سابقا لنبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى باستخدام هذه الطريقة 1،10،12. بل هو أيضا أعلى معدل التحول الإبلاغ عنها من الكتان. ومع ذلك، هناك خطوات حاسمة في الإجراءات بما في ذلك اختيار أفضل مرحلة زهرة وأفضل تركيز بالسطح، بحيثوالأجرعية يمكن أن تخترق الخلايا النباتية دون قتل أجهزة زهرة. إذا تم استخدام مرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع ارتفاع تركيز Silwet-77 أكثر من 0.05٪، وزهرة لم تتطور ولا تعيين البذور. إذا تم استخدام مرحلة أواخر برعم (الشكل 2C)، على الرغم من أن التحول قد عمل، وسوف تحدث بمعدل أقل من ذلك بكثير. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع نبات الأرابيدوبسيس تراجع الأزهار التحول 1،4. لهذا البروتوكول، تم اختبار جميع المراحل الأزهار مع مختلف Silwet-77 تركيزات وتم تحديد أفضل مرحلة لتكون المرحلة برعم المتوسط ​​(الشكل 2C) مع Silwet-77 في 0.05٪ لغمس الأول، تليها غمس الثاني في المرحلة الراحل برعم (الشكل 2C) مع انخفاض طفيف تركيز Silwet-77 من 0.03٪. كما عملت التحول جيدا باستخدام المرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع تركيز منخفض silwet-77 من 0.003٪ تلاهغمس الثاني مع مرحلة برعم المتوسط ​​(الشكل 2B) في أعلى Silwet-77 تركيز 0.05٪. في هذا البروتوكول، وقد حاول بعض المعالم الأخرى لتحسين معدل التحول، ولكن وجد أن له أي آثار على النتيجة النهائية. وتشمل الأمثلة يمتد الوقت بعد غمس أن النباتات تكمن في جانبهم وغطت في البلاستيك من يوم واحد إلى يومين. باستخدام OD أكثر من 1 للثقافة الأجرعية، بدلا من 0،5-1. زيادة الوقت غمس 5 - 15 دقيقة بدلا من 1 - 2 دقيقة. مرة أخرى نحن لم نلحظ أي تأثير على معدل التحول باستخدام هذه الاستراتيجيات. العوامل الأكثر فعالية، ومع ذلك، وجدت أن استخدام النباتات الصحية في المراحل زهرة الصحيحة، واستخدام أفضل تركيز Silwet-77. لاحظنا أن اثنين من فترات غمس، ويعمل بطريقة أو بأخرى الوقت أفضل من واحد، على الرغم من واحد غمس الوقت يعمل أيضا. لا يمكن أن يتحقق تعديل على هذا البروتوكول من قبل reducin<html> ز تركيز Silwet-77 إلى أقل من 0.003٪ في غمس الثاني أو الثالث. منذ Silwet-77 غير سامة، وارتفاع جدا نتائج تركيز في الزهور النامية على نحو رديء، مما يؤدي إلى أي محصول البذور. يمكن الحد من وتيرة غمس إلى واحد، مع الأحداث الثانية أو الثالثة القضاء إذا النباتات لا يبحثون صحي والبراعم لا تتطور بصورة جيدة. وهناك أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية هو انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، وعدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، ودورة حياة طويلة من الكتان. يستغرق 6-8 أسابيع من بذر البذور لديها براعم الأولية جاهزة لغمس أول وإضافية 8-10 أسابيع بعد غمس-للوصول الى جيل T1. في المجموع، ومجموعة من 5 - هناك حاجة إلى 6 أشهر للحصول على الجيل T1. على عكس الأنواع النباتية الأخرى، والتي زهرة في أي وقت من السنة، وبعض أصناف الكتان زهرة أفضل في أوقات محددة من السنة. تخطيط مدروس جدا لهذا الأسلوب هو المهم. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; وباختصار، نتائجنا من تراجع الأزهار مع اثنين من أصناف الكتان مختلفة: الكتان من الألياف، ستورمونت سيروس (البلاستيك استجابة و)، وزيت الكتان، بيتون (مستقر وغير المراعية)، تبين أن الأجرعية - بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق وفعالة للتحول الكتان، ويمكن استخدامها لتحل محل التقنيات المستخدمة سابقا للتحول الكتان. فإن إدخال تعديلات على طريقة الأزهار وتراجع في هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق للاستخدام مع أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس على سبيل الحصر الكتان.

الكتان (LINUM usitatissimum) هو المحصول المهم نمت على نطاق واسع للألياف والزيوت. التحول من الجينوم الكتان هو ممكن مع تقنيات مثل إصابة أو عدوى الأجرعية، وشارك في زراعة في زراعة الأنسجة، وتطبيق الجسيمات biolistic أو صوتنة الموجات فوق الصوتية تليها التجدد. ومع ذلك، هذه التقنيات لها عيوب كثيرة، بما في ذلك الميل إلى العديد من الأحداث طفرية وتمديد الوقت للحصول على خطوط المعدلة وراثيا. يمكن أيضا أن تكون بعض من هذه الطرق مكلفة وتتطلب معالجة المهرة وكفاءة الصكوك، مما أدى إلى انتعاش الشتلات منخفضة. الأهم من ذلك، هذه التقنية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات التحول 2،6. الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو نهج بسيطة وفعالة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. تم بشكل روتيني وبنجاح استخدامه للعديد من الأنواع النباتية مثل نبات الأرابيدوبسيس thalianعلى 1،4، فصة برميلية 11، الطماطم 12، 13 القمح والذرة 10. ومع ذلك، لم يعتقد أنه من كتقنية قابلة للتحول الكتان بسبب عدة عوامل، مثل انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، عدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، وحجم البذور واسع، ومعطف سميك، والتي يمكن أيضا أن يكون مشكلة لمثل هذه عملية التحول الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، والجزء اختيار تقنية الأزهار وتراجع يتطلب الإنبات بذور حولت على وسائل الاعلام النباتات التي تحتوي على مضاد حيوي، مع السلالات تحولت حاليا على أساس قدرتها على الإنبات والبقاء الأخضر، في حين أن السلالات غير حولت إما لا تنبت أو تنبت ولكن التبييض بسرعة ويموت. في الأدب الحالي، وقد لوحظ أن من النوع البري الكتان يميل إلى الهروب تركيز عال من الاختيارات للمضادات الحيوية، وإنتاج نتائج إيجابية كاذبة، وجعل اختيار السلالات T1 مقرهاعلى مقاومة المضادات الحيوية أكثر صعوبة 6،14. أيضا، عندما أضيف على نسبة عالية من المضادات الحيوية إلى وسيلة الاختيار، ومعدل التحول الملحوظ انخفض بشكل كبير 9. في هذا البروتوكول، استخدمنا الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع لتحويل خط من ألياف الكتان، ستورمونت المعلاق (استجابة والبلاستيك)، وهو ما ثبت للرد على الضغوط في البيئة عن طريق تغيير الجينوم 3،5. للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية، اخترنا أن تفعل اختبار PCR المباشر من الحمض النووي من أوراق T1، بدلا من اختيار طريق إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام النبات. ونحن قد استفادت من تشريح بسيط من الكتان لتتبع الزهور محددة في وقت العلاج. يسمح هذا النظام تتبع اختيار البذور من الزهور محددة والإنبات في التربة دون إضافة المضادات الحيوية. وقد تم تحديد transformants إيجابية ببساطة عن طريق اختبار DNA الحصول عليها من الأوراق باستخدام طريقة سريعة وفعالة سو PCR المباشر. وتظهر نتائجنا أن طريقة الأزهار وتراجع عملت بشكل جيد جدا في هذا الخط من الكتان ونتج من المستغرب في معدل التحول عالية جدا (50 - 60٪)، وهي نسبة أعلى من تلك التي لوحظت من قبل لthaliana نبات الأرابيدوبسيس، الذي تشير التقارير إلى أن 0،1-1 ٪ 1، وأعلى أيضا من الأنواع النباتية الأخرى 10،12. نحن أيضا اختبار صنف آخر من بذر الكتان (الكتان النفط)، بيتون (مستقر وغير مستجيبة)، وتشير البيانات الأولية لدينا أن الأزهار وتراجع يعمل أيضا لهذا التنوع من الكتان. والهدف من هذا البروتوكول هو إظهار أن الأجرعية والأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة، وأسرع من غيرها من أساليب التحول الكتان. والأهم من ذلك أنه يؤدي إلى معدل التحول أعلى بكثير من غيرها من أساليب التحول الكتان 2،6. تشريح نبات الأرابيدوبسيس thaliana، التي لديها العديد من الفروع والزهور، يا أماهKES من الصعب التمييز تراجع والزهور غير مغموسة على نفس النبات. لذلك، فإن أعدادا كبيرة من البذور، وحوالي 20،000 البذور للنبات، تحتاج إلى فحص لتحديد transformants إيجابية 8. الكتان، من ناحية أخرى، لديها عدد أقل من الفروع (فرع رئيسي واحد وعدد قليل من فروع جانبية) وعدد أقل من الزهور، وتنتج ما يقرب من 100 البذور في النباتات، مما يجعل من الممكن لتتبع الزهور الفردية واختيار البذور محددة خلال عملية الفرز. ونقترح أن الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق لتحويل أي نوع من الأنواع ذات الصلة من الكتان، وهو جنس من حوالي 200 نوع. هذه الطريقة يعطي أعلى بكثير معدل التحول من الأساليب الأخرى للتحول الكتان. نحن نقترح أيضا أن فحص PCR المباشر من T1 ورقة DNA هو وسيلة فعالة للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية المقاومة التي غالبا ما تنتج العديد من ايجابيات كاذبة. فحص PCR المباشر يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس ر يقتصرس الكتان. تقنية تتبع البذور بسيطة العاملين في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى مع المتفرعة التشريح مماثلة لالكتان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع في مجال تحول النبات وتم الإبلاغ عن أن تكون ناجحة للعديد من الأنواع النباتية. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ الكتان (LINUM usitatissimum) التحول من الأزهار وتراجع. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات أن الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وفعالة، والأهم من ذلك، يعطي معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان. وباختصار، فقد انخفض النورات من الكتان في حل من الأجرعية تحمل البلازميد ثنائي الموجه (جزء T-DNA بالإضافة إلى إدراج تسلسل LINUM، LIS-1) ل1 - 2 دقيقة. كانت قد وضعت النباتات شقة على جانبهم لمدة 24 ساعة. ثم، تم الحفاظ على النباتات في ظل ظروف النمو الطبيعي حتى علاج المقبلة. بروسسوتكررت الصورة من غمس 2-3 مرات، مع ما يقرب من 10-14 فترات اليوم بين غمس. تم جمع بذور T1 ونبتت على تربة. بعد ما يقرب من أسبوعين، تم اختبار السلالات تعامل من قبل PCR المباشر؛ واستخدمت 3 الأوراق للنبات بالإضافة إلى الاشعال T-DNA المناسبة - 2. تم اختيار transformants إيجابية ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. وكان معدل التحول عالية بشكل غير متوقع، مع 50 - 60٪ من البذور من النباتات المعاملة يجري transformants إيجابية. هذا هو معدل التحول أعلى من تلك التي ذكرت لthaliana نبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى، وذلك باستخدام التحول الأزهار وتراجع. بل هو أيضا أعلى، والتي تم الإبلاغ حتى الآن، للتحول الكتان باستخدام طرق أخرى للتحول.

الشكل 1-4 توضيح بعض الخطوات ضمن البروتوكول. في أرقام 1 و 2، ويترك في جميع أنحاء براعم الإزهار يتم قطع لفضح لهم الخلايا الأجرعية والمراحل برعم المختلفة التي استخدمت لتطوير بروتوكول الشكل يظهر 3 عملية الكتان الأزهار وتراجع الشكل 4، يظهر مثال عن كيفية الفروع الرئيسية والجانبية يمكن أن يكون المسمى وكيف الزهور فرد يمكن تتبع وتحديد الشكل 5 يبين كيف يمكن نبتت على السلالات T1 على وسائل الإعلام مصنع MS ومن ثم زرعها في التربة لنضج الشكل يوضح كيف 6 wild- نوع الكتان يمكن الهروب تركيزات عالية من الكانامايسين، مؤكدا النتائج السابقة في الأدب 6،9،14. ويبين الشكل 7 مثال PCR التضخيم مباشرة من transformants T1 إيجابية. تم جمع الزهور T1 من م<html> عين والجانب يطلق النار على محطة T0 واحد. كما يمكن أن يرى من PCR المباشر، واختبارها 8/12 النباتات T1 الإيجابية التي PCR ولقد ضخمت في مناطق مختلفة في جميع أنحاء T-DNA. تم تصميم الاشعال لدينا أيضا بين LIS-1 إدراج والمواقع استنساخ متعددة (الشكل 7B وC). كنا الاشعال إضافية من متجه ثنائي مصنع لتضخيم شرائح مختلفة من الحمض النووي T، مثل الحدود الأيسر وفاصل NOS (لا تظهر البيانات) أو الحد الأيمن وموقع استنساخ متعددة (الشكل 7D). واستخدمت بادئات محددة لإدراج LIS-1 أيضا في هذا البروتوكول (لا تظهر البيانات). وهناك قائمة من الاشعال في الجدول 1. ومع ذلك، فإن تسلسل هذه الاشعال تعتمد على سلسلة من متجه ثنائي محطة T-DNA وإدراج المستخدمة لوتراجع الأزهار. لاحظنا أيضا أنه لم يكن هناك اختلاف كبير في معدل التحول بين الزهور التي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. ف together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" /> الشكل 1. قص الأوراق حول براعم الإزهار الأولية ليعرضهم للخلايا Agrobacterim. (A) وتغطي براعم بواسطة إجازات. وقطعت (B) أوراق حول البراعم لفضح لهم. (C) تضخيم صورة من المصنع في (A) بعد قطع لفضح البراعم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> الشكل 2. مراحل برعم المختلفة التي استخدمت في هذا البروتوكول لتحديد أفضل مرحلة لاستخدامه في تراجع الأزهار. (A) المرحلة برعم المبكر هو approxima<html> tely 2 مم. (B) المرحلة برعم المتوسط ​​حوالي 5 ملم. (C) المرحلة برعم المتأخر هو ما يقرب من حوالي 1 سم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> الشكل 3. عملية الكتان الأزهار غمس. وانخفض (A) والنورات الأولية في وسائل الإعلام تسلل تحتوي على خلايا الأجرعية. (B) مكبر من (A). (C) وضعت النباتات انخفض شقة حتى اليوم التالي، ويتم تغطية فروع انخفض مع البلاستيك للحفاظ على الرطوبة العالية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> jove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . الشكل 4. إن عملية تتبع الزهور والبذور مجموعات من النباتات T0 تعامل (A) مثال على مصنع كامل مع الفرع الرئيسي (أطول فرع في الوسط) والجانب فروع (B - D). إن . مثال الزهور من مختلف فروع (E) مثال من البذور التي تم جمعها من الزهور الفردية (المسمى ل- ك). من الفرع الرئيسي <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> تزرع الشتلات الشكل 5. T1 دون اختيار المضادات الحيوية. (A) البذور T1 هينبتت على وسائل الإعلام مصنع MS. (B) transformants إيجابية، على النحو الذي يحدده PCR المباشر، يتم زرعها في التربة ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> والتغلب على الشكل 6. الهروب المضادات الحيوية، وهي مشكلة لT1 اختيار، من خلال فحص PCR المباشر. (A) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS دون المضادات الحيوية. (B) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS + زيادة تركيزات من الكانامايسين (200 ميكروغرام / مل، 600 ميكروغرام / مل، 1 ملغ / مل). (C) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على MS سائل الإعلام المصنع مع 2 ملغ / مل الكانامايسين. (D) PCR من النوع البري الكتان وT1 الشتلات باستخدام بادئات كانامايسين، كل AMPLified والكانامايسين الجين (الأساطير: EZ1: علامة DNA، FlaxS، من النوع البري flaxS، C: السيطرة غير مغموسة فرع، ما: T1 ذرية من زهرة &quot;أ&quot; التي تم جمعها من الفرع الرئيسي، SC، SD، سي، SF: السلالات T1 من الزهور المختلفة &quot;ج، د، ه، و&quot; التي تم جمعها من فرع الجانب، W: لا DNA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> الرقم 7. مثال على التكبير PCR ناجحة من السلالات T1 باستخدام طريقة PCR المباشر. (A) رسم تخطيطي لناقلات ثنائي مصنع + والمستنسخة LIS-1 إدراج. الأسهم الزرقاء تدل على موقف الاشعال PCR تستخدم في فحص PCR المباشر (معدلة من تاكارا). (ب) PCR مع الاشعال M13F + 3 &quot;(C) PCR مع الاشعال M13R + 18A <stroنانوغرام&gt; (D) PCR مع الاشعال الحدود الأيمن (RB) ومتعددة الموقع الاستنساخ (MCS) ** كل حارة يمثل T1 من الزهور الفردية التي تم جمعها من C: فرع التحكم (غير مغموسة)، M: الرئيسي AG فرع الزهور، S: الجانب على فرع زهرة قبل الميلاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مصدر تسلسل التمهيدي إلى الأمام </td><td> تسلسل 5&#39;-3 &quot; </td><td> العكسي مصدر تسلسل التمهيدي </td><td> تسلسل 5&#39;-3 &quot; </td><td> الصلب تيمبراتوري (° C) </td><td> الوقت تمديد (ثانية) </td><td> حجم المتوقعة (بي بي) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &quot;(LIS-1 إدراج) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18A (LIS-1 إدراج) </td><td> TATTTTAACCC <bص /&gt; TATCTCCCAACAC </td><td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. بعض من الاشعال المستخدمة لاختبار PCR المباشر.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية

هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

تطبيق حركة الرأس السلبية لتوليد تسارع محدد عند رؤوس القوارض

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

تقنية حقن الأجنة لتحرير الجينات في القراد ذو الأرجل السوداء ، Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Agrobacterium tumefaciens- التحول الوراثي بوساطة لسان الحمل ضيق الأوراق

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...