Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ऐसे सन (Linum usitatissimum) के रूप में कुछ प्रजातियों के पौधे में, सफल संयंत्र परिवर्तन सीमित कर दिया गया है। इससे पहले, सन में परिवर्तन लोग घायल हो गए और सह खेती, biolistic कणों को लागू करने या उत्थान के द्वारा पीछा अल्ट्रासाउंड sonication के, का उपयोग करके एक एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण की आवश्यकता है; लंबी और होने का खतरा है कि दोनों एक प्रक्रिया कई उत्परिवर्तनीय घटनाओं के साथ किया जा रहा है। इसके अलावा, इन तकनीकों में से चयन प्रक्रिया ऐसी केनामाइसिन के रूप में एंटीबायोटिक चयन मार्कर के उपयोग की आवश्यकता है। हालांकि, यह सन एंटीबायोटिक दवाओं 6,9,14 की उच्च सांद्रता से बचने के लिए जाता है के रूप में चयन की इस पद्धति, कई झूठी सकारात्मक पैदा करता है कि साहित्य में उल्लेख किया गया है। सन परिवर्तन में पिछले तकनीकों का एक और नुकसान कम परिवर्तन दरों 2,6 किया गया है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, पुष्प की सूई के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन दिखाया गया था(60% - 50) सन के लिए एक उच्च परिवर्तन की दर में कमी की। Transformants मुख्य और पक्ष शाखाओं से डूबा हुआ है और एकत्र फूलों से प्राप्त किया गया। सकारात्मक transformants की चुनाव में बस से गुजर एंटीबायोटिक चयन का उपयोग करते हैं, धरती पर T1 के पौधों बढ़ रही है और वे अंकुरित के बाद जल्द ही अपने पत्ते स्क्रीनिंग द्वारा किया गया था, एक कदम पहले से अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए फूलों की डुबकी में एक आदर्श के रूप में प्रयोग किया जाता है। पत्तियों का प्रत्यक्ष पीसीआर परीक्षण के प्रदर्शन और उचित टी डीएनए प्राइमरों का उपयोग करके, सकारात्मक transformants तेजी से चुना जा सकता है। इस तकनीक को इस विधि 1,10,12 का उपयोग करते हुए पहले से एराबिडोप्सिस और अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए रिपोर्ट में उन लोगों की तुलना में एक बहुत अधिक परिवर्तन की दर में सरल, सस्ता और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, फिर भी परिणाम है। यह भी सन के लिए उच्चतम रिपोर्ट परिवर्तन की दर है। हालांकि, सबसे अच्छा फूल चरण का चयन और सबसे अच्छा surfactant एकाग्रता सहित प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण कदम है, ताकि वहाँ रहे हैंएग्रोबैक्टीरियम फूल अंगों की हत्या के बिना संयंत्र कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। एक प्रारंभिक कली चरण से अधिक 0.05% की उच्च Silwet-77 एकाग्रता के साथ (2A चित्रा) का इस्तेमाल किया जाता है, तो फूल विकसित और न ही बीज सेट नहीं होगा। परिवर्तन काम हो सकता है, हालांकि देर कली मंच, (चित्रा -2) का इस्तेमाल किया जाता है, तो यह एक बहुत कम दर पर घटित होगा। इसी तरह के परिणाम एराबिडोप्सिस पुष्प डुबकी परिवर्तन 1,4 के साथ प्राप्त किया गया। इस प्रोटोकॉल के लिए, सभी पुष्प चरणों में एक दूसरे की सूई पर, उसके बाद अलग Silwet-77 सांद्रता के साथ परीक्षण किया गया है और सबसे अच्छा मंच पहली सूई के लिए 0.05% पर Silwet-77 के साथ मध्य कली चरण (चित्रा -2) होने के लिए निर्धारित किया गया था 0.03% के एक से थोड़ा कम Silwet-77 एकाग्रता के साथ देर कली चरण (चित्रा -2)। परिवर्तन भी द्वारा पीछा किया, 0.003% की एक कम silwet-77 एकाग्रता के साथ जल्दी कली चरण (2A चित्रा) का उपयोग अच्छी तरह से काम0.05% के उच्च Silwet-77 एकाग्रता में मध्य कली चरण (चित्रा 2 बी) के साथ एक दूसरे की सूई। इस प्रोटोकॉल में, कुछ अन्य मानकों परिवर्तन की दर का अनुकूलन करने का प्रयास किया, लेकिन अंतिम परिणाम पर कोई प्रभाव हो पाए गए। उदाहरण के पौधों को अपने पक्ष में करना और एक दिन से दो दिन के लिए प्लास्टिक में शामिल है कि सूई के बाद समय का विस्तार शामिल है; एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति के लिए अधिक से अधिक 1 के एक आयुध डिपो का उपयोग कर के बजाय, 0.5-1; 15 मिनट के बजाय - 1 - 2 मिनट से 5 सूई समय बढ़ रही है। फिर हम इन रणनीतियों का उपयोग परिवर्तन की दर पर कोई असर नहीं देखा है। सबसे प्रभावी कारक है, फिर भी, सही फूल चरणों में स्वस्थ पौधों का उपयोग कर, और सबसे अच्छा Silwet-77 एकाग्रता का उपयोग किया जाना पाया गया। हम दो सूई अंतराल, एक समय सूई भी काम करता है, भले ही किसी भी तरह से बेहतर है एक बार काम करता है कि देखा। इस प्रोटोकॉल के लिए संशोधन reducin द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैजी दूसरे या तीसरे सूई में के रूप में छोटे 0.003% के रूप में करने के लिए Silwet-77 एकाग्रता। Silwet-77 विषैला होता है के बाद से, फूलों में भी एक उच्च एकाग्रता परिणाम कोई बीज उपज है, जिसके परिणामस्वरूप खराब विकासशील। पौधों स्वस्थ नहीं दिख रहे हैं और कलियों अच्छी तरह से विकसित नहीं कर रहे हैं तो दूसरे या तीसरे घटनाओं का सफाया साथ सूई आवृत्ति, एक को कम किया जा सकता है। इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा सन, प्रत्येक फूल से प्राप्त बीज की सीमित संख्या, और सन के लंबे जीवन चक्र द्वारा उत्पादित फूलों की कम संख्या है। T1 पीढ़ी को पाने के लिए 10 सप्ताह के बाद सूई - पहले की सूई के लिए तैयार प्राथमिक कलियों और एक अतिरिक्त 8 है करने के लिए बीज की बुआई से 8 सप्ताह - यह 6 लेता है। कुल में, 5 की एक श्रृंखला - 6 महीने T1 पीढ़ी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। अन्य प्रजातियों के पौधे के विपरीत, जो फूल किसी भी वर्ष के, वर्ष विशिष्ट समय पर कुछ सन किस्मों के फूल बेहतर है। इस तकनीक के लिए तो विचारशील नियोजन महत्वपूर्ण है। <p clसारांश में गधा = &quot;jove_content&quot;&gt;, दो अलग अलग सन किस्मों के साथ पुष्प डुबकी के हमारे परिणाम: फाइबर सन, Stormont सिरस (संवेदनशील और प्लास्टिक), और तेल सन, (स्थिर और गैर जिम्मेदार) बिथयून, कि एग्रोबैक्टीरियम शो - पुष्प डुबकी के माध्यम से मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन सन परिवर्तन के लिए एक लागू और कारगर तरीका है और सन परिवर्तन के लिए पहले से इस्तेमाल की तकनीक की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में पुष्प डुबकी विधि के संशोधनों के किसी भी अन्य प्रजातियों के पौधे के साथ उपयोग करने के लिए लागू है और सन तक ही सीमित नहीं किया जाएगा।

सन (Linum usitatissimum) ने अपने फाइबर और तेलों के लिए व्यापक रूप से उगाया एक महत्वपूर्ण फसल है। सन जीनोम के परिवर्तन ऐसे लोग घायल हो गए, एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण, और टिशू कल्चर में सह खेती, उत्थान द्वारा पीछा biolistic कणों या अल्ट्रासाउंड sonication के आवेदन के रूप में तकनीक के साथ संभव है। हालांकि, इन तकनीकों कई उत्परिवर्तनीय घटनाओं के लिए झुकाव और ट्रांसजेनिक लाइनों प्राप्त करने के लिए एक विस्तारित समय सहित कई नुकसान है। इन तरीकों में से कुछ भी महंगा हो सकता है और कम वसूली अंकुरों में जिसके परिणामस्वरूप, उपकरणों के कुशल और कुशल हेरफेर की आवश्यकता होती है सकते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन तकनीक अक्सर कम परिवर्तन दरों 2,6 में परिणाम। पुष्प डुबकी के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन ट्रांसजेनिक पौधों उत्पन्न करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका है। यह नियमित रूप से और सफलतापूर्वक ऐसी एराबिडोप्सिस thalian के रूप में कई प्रजातियों के पौधे के लिए इस्तेमाल किया गया हैएक 1,4, Medicago truncatula 11, टमाटर 12, गेहूं 13 और मक्का में 10। हालांकि, यह कारण इस तरह सन द्वारा उत्पादित फूलों की कम संख्या के रूप में कई कारकों को सन परिवर्तन के लिए एक व्यवहार्य तकनीक के रूप में के बारे में सोचा नहीं किया गया है, प्रत्येक फूल, बड़े बीज आकार, और मोटी कोट से प्राप्त बीज की सीमित संख्या, भी इस तरह के आनुवंशिक परिवर्तन की प्रक्रिया के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है। संततियों गैर तब्दील या तो उगना या उगना लेकिन ब्लीच नहीं है, जबकि इसके अतिरिक्त, पुष्प डुबकी तकनीक का चयन खंड, उगना और हरे रहने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर प्रतिष्ठित तब्दील संततियों के साथ एक एंटीबायोटिक, जिसमें एक संयंत्र मीडिया पर तब्दील बीज germinating की आवश्यकता है जल्दी बाहर और मर जाते हैं। वर्तमान साहित्य में, यह जंगली प्रकार सन आधारित झूठी सकारात्मक परिणामों के उत्पादन, और T1 संततियों का चयन कर रही है, एंटीबायोटिक चयन के उच्च एकाग्रता से बचने के लिए जाता है कि उल्लेख किया गया हैएंटीबायोटिक प्रतिरोध पर 6,14 अधिक मुश्किल है। एंटीबायोटिक के एक उच्च एकाग्रता चयन माध्यम से जोड़ा गया था इसके अलावा, जब मनाया परिवर्तन की दर नाटकीय रूप से 9 गिरा दिया। इस प्रोटोकॉल में, हम अपने जीनोम 3,5 बदलकर माहौल में तनाव के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया गया है, जो फाइबर सन, Stormont सिरस (संवेदनशील और प्लास्टिक), की एक लाइन को बदलने के लिए एग्रोबैक्टीरियम और पुष्प डुबकी विधि का इस्तेमाल किया। एंटीबायोटिक भागने समस्या को दूर करने के लिए, हम संयंत्र मीडिया के लिए एंटीबायोटिक जोड़कर बजाय चयन की, T1 के पत्तों से डीएनए के प्रत्यक्ष पीसीआर परीक्षण करने के लिए चुना है। हम उपचार के समय में विशिष्ट फूल ट्रैक करने के लिए सन की साधारण शरीर रचना विज्ञान का फायदा उठाया। यह ट्रैकिंग प्रणाली एंटीबायोटिक जोड़ने के बिना धरती पर विशिष्ट फूल और अंकुरण से बीज के चयन की अनुमति दी। सकारात्मक transformants बस डीएनए तेजी से और कारगर तरीका ओ का उपयोग कर के पत्तों से प्राप्त परीक्षण द्वारा की पहचान की गईएफ प्रत्यक्ष पीसीआर। हमारे परिणाम पुष्प डुबकी विधि सन की इस पंक्ति में बहुत अच्छी तरह से काम किया है और आश्चर्यजनक रूप से एक बहुत ही उच्च परिवर्तन की दर में हुई दिखाना है कि - पहले होने की सूचना मिली थी जो Arabidopsis thaliana, के लिए मनाया उन लोगों की तुलना में अधिक है, (50 से 60%) 0.1-1 % 1, और अन्य प्रजातियों के पौधे 10,12 से भी अधिक है। हम यह भी अलसी (तेल सन) की एक और किस्म है, बिथयून का परीक्षण (स्थिर और गैर जिम्मेदार), और हमारे प्रारंभिक आंकड़ों पुष्प डुबकी भी सन की इस किस्म के लिए काम करता है कि इंगित करता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एग्रोबैक्टीरियम और पुष्प डुबकी ट्रांसजेनिक सन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि दिखाने के लिए है। हम इस तकनीक को सरल, सस्ता, और सन परिवर्तन के अन्य तरीकों की तुलना में जल्दी है कि दिखा। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह सन परिवर्तन 2,6 के अन्य तरीकों की तुलना में एक बहुत अधिक परिवर्तन की दर में यह परिणाम है। कई शाखाओं और फूल है जो Arabidopsis thaliana का शरीर रचना विज्ञान, एमएKES यह मुश्किल डूबा हुआ है और एक ही पौधे पर फूल गैर डूबा भेद करने के लिए। इसलिए, बीज की बड़ी संख्या है, संयंत्र के अनुसार लगभग 20,000 बीज, सकारात्मक transformants 8 की पहचान के लिए जांच की जरूरत है। सन, दूसरे हाथ पर, यह संभव व्यक्तिगत फूल ट्रैक करने के लिए और इस प्रक्रिया स्क्रीनिंग के दौरान विशिष्ट बीज का चयन करने के लिए बनाता है, जो पौधों के अनुसार लगभग 100 बीज, उत्पादन कम शाखाओं (एक मुख्य शाखा और कुछ पक्ष शाखाओं) और कम फूल है। हम पुष्प डुबकी सन के किसी भी संबंधित प्रजातियों, लगभग 200 प्रजातियों में से एक जीनस को बदलने के लिए एक लागू तरीका है कि प्रस्ताव। इस विधि सन परिवर्तन के अन्य तरीकों की तुलना में बहुत अधिक परिवर्तन की दर देता है। हम यह भी T1 के पत्ता डीएनए के प्रत्यक्ष पीसीआर स्क्रीनिंग अक्सर कई झूठी सकारात्मक पैदा करता है कि एंटीबायोटिक प्रतिरोध भागने की समस्या को दूर करने के लिए एक कारगर तरीका है कि प्रस्ताव कर रहे हैं। डायरेक्ट पीसीआर स्क्रीनिंग किसी भी अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए लागू किया जा सकता है और टी सीमित नहीं हैसन ओ। इस प्रोटोकॉल में कार्यरत साधारण बीज ट्रैकिंग तकनीक सन के समान शरीर रचना विज्ञान शाखाओं के साथ किसी भी अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए लागू किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

पुष्प डुबकी के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन संयंत्र परिवर्तन के क्षेत्र में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक है और कई प्रजातियों के पौधे के लिए सफल होने के लिए सूचित किया गया है। हालांकि, पुष्प डुबकी द्वारा सन (Linum usitatissimum) परिवर्तन नहीं बताया गया है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि एग्रोबैक्टीरियम स्थापित करने के लिए है और पुष्प डुबकी विधि ट्रांसजेनिक सन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम इस तकनीक, सरल, सस्ता, कुशल और अधिक महत्वपूर्ण बात, सन परिवर्तन की वर्तमान उपलब्ध तरीकों की तुलना में अधिक परिवर्तन की दर देता है कि पता चलता है। 2 मिनट - सारांश में, सन के पुष्पक्रम 1 के लिए एक द्विआधारी वेक्टर प्लाज्मिड (टी डीएनए टुकड़ा प्लस Linum निवेशन अनुक्रम, एलआईएस -1) ले जाने एग्रोबैक्टीरियम की एक समाधान में डूबा रहे थे। पौधों में 24 घंटे के लिए उनके पक्ष में फ्लैट रखी थी। फिर, पौधों अगले उपचार जब तक सामान्य वृद्धि की शर्तों के तहत बनाए रखा गया। प्रक्रियासूई के बीच 14 दिन के अंतराल - लगभग 10 के साथ 3 बार, - सूई के एस 2 दोहराया गया था। T1 के बीज एकत्र की है और धरती पर अंकुरित कर रहे थे। लगभग दो सप्ताह के बाद, इलाज संततियों प्रत्यक्ष पीसीआर द्वारा परीक्षण किया गया; 2-3 पत्तियों संयंत्र प्लस उपयुक्त टी डीएनए प्राइमरों प्रति इस्तेमाल किया गया। सकारात्मक transformants चयनित और परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे थे। सकारात्मक transformants जा रहा है इलाज किया पौधों से बीज के 60% - परिवर्तन की दर 50 से अप्रत्याशित रूप से उच्च था। इस Arabidopsis thaliana और पुष्प डुबकी परिवर्तन का उपयोग अन्य प्रजातियों के पौधे, के लिए रिपोर्ट में उन लोगों की तुलना में अधिक परिवर्तन की दर है। यह परिवर्तन के लिए अन्य तरीकों का उपयोग सन परिवर्तन के लिए, यह भी अब तक सूचित किया गया है, जो सबसे ज्यादा है।

चित्रा 1-4 प्रोटोकॉल के भीतर कदम से कुछ उदाहरण देकर स्पष्ट करना। आंकड़े 1 और 2, पुष्पक्रम कलियों के आसपास पत्तियों में एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं और प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि विभिन्न कली चरणों के लिए उन्हें बेनकाब करने के लिए काट रहे हैं। तीन सन पुष्प डुबकी की प्रक्रिया से पता चलता है। 4 चित्रा, से पता चलता है एक और पता लगाया पहचाना जा सकता है कि कैसे मुख्य और पक्ष शाखाओं लेबल किया जा सकता है और कैसे अलग-अलग फूलों का उदाहरण है। चित्रा 5 T1 के संततियों एमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित और फिर परिपक्वता के लिए मिट्टी में प्रत्यारोपित किया जा सकता है कि कैसे पता चलता है। चित्रा 6 कैसे wild- दिखाता है प्रकार सन साहित्य 6,9,14 में पिछले निष्कर्ष की पुष्टि, केनामाइसिन की उच्च सांद्रता से बच सकते हैं। चित्रा 7 सकारात्मक T1 के transformants से सीधे पीसीआर प्रवर्धन का एक उदाहरण से पता चलता है। T1 के फूल मीटर से एकत्र किए गए थेएक एकल T0 संयंत्र के ऐन और पक्ष शूटिंग। प्रत्यक्ष पीसीआर से देखा जा सकता है, 8/12 T1 के पौधों पीसीआर द्वारा सकारात्मक परीक्षण और टी डीएनए भर में विभिन्न क्षेत्रों परिलक्षित है। हमारे प्राइमरों भी एलआईएस -1 डालने और कई क्लोनिंग साइटों (चित्रा 7B और सी) के बीच बनाया गया था। हम ऐसे छोड़ सीमा और ओपन स्कूल टर्मिनेटर (नहीं दिखाया डेटा) या सही सीमा और कई क्लोनिंग साइट (चित्रा 7 दिन) के रूप में टी डीएनए के विभिन्न क्षेत्रों, बढ़ाना संयंत्र द्विआधारी वेक्टर से अतिरिक्त प्राइमरों इस्तेमाल किया। एलआईएस -1 डालने के लिए विशिष्ट प्राइमरों भी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया (डेटा) नहीं दिखाया। प्राइमरों की एक सूची तालिका 1 में प्रदान की जाती है। हालांकि, इन प्राइमरों के दृश्यों टी डीएनए संयंत्र द्विआधारी वेक्टर के अनुक्रम और पुष्प डुबकी के लिए इस्तेमाल किया डालने पर निर्भर करता है। हम भी मुख्य और पक्ष शाखाओं से एकत्र फूलों के बीच परिवर्तन की दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर था कि वहाँ का उल्लेख किया। प्राथमिक पुष्पक्रम कलियों के आसपास पत्ते काटना चित्रा 1. Agrobacterim कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए। (ए) कलियों पत्तियों से कवर कर रहे हैं। (बी) के पत्तों उन्हें बेनकाब करने की कलियों के आसपास कटौती की गई है। (सी) संयंत्र से छवि बढ़ाया कलियों का पर्दाफाश करने के काटने के बाद (ए) में। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> चित्रा 2. पुष्प डुबकी के लिए उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा मंच का निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है कि विभिन्न कली चरणों। (ए) के प्रारंभिक चरण कली approxima है<html> tely 2 मिमी। (बी) के बीच मंच कली लगभग 5 मिमी है। (सी) देर से मंच कली लगभग बारे में 1 सेमी है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> चित्रा 3. सन पुष्प सूई की प्रक्रिया। (ए) के प्राथमिक पुष्पक्रम डूबा पौधों अगले दिन तक फ्लैट रखी हैं (सी)। (ए) से बढ़ाया (बी)। एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं से युक्त घुसपैठ मीडिया में डूबा रहे हैं, और डूबा शाखाओं बनाए रखने के लिए प्लास्टिक के साथ कवर कर रहे हैं उच्च आर्द्रता। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> हमेशा &quot;&gt;:&quot; रख-together.within पृष्ठ = के लिए &quot;jove_content <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> । चित्रा 4. T0 इलाज किया पौधों से फूल ट्रैकिंग और बीज संग्रह की प्रक्रिया, (ए) के मुख्य शाखा (बीच में सबसे ऊंची शाखा) के साथ पूरे संयंत्र का एक उदाहरण है और पक्ष शाखाओं (बी - डी)। एक । विभिन्न शाखाओं से फूलों का उदाहरण (ई) अलग-अलग फूलों से एकत्र बीज का एक उदाहरण (एक लेबल - कश्मीर)। मुख्य शाखा से <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> चित्रा 5. T1 के अंकुरों एंटीबायोटिक चयन के बिना हो रहे हैं। (ए) T1 के बीज होते हैंएमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित। (बी) सकारात्मक transformants, प्रत्यक्ष पीसीआर द्वारा निर्धारित रूप में, मिट्टी में प्रत्यारोपित और परिपक्वता के लिए बड़े हो रहे हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> चित्रा 6 एंटीबायोटिक भागने, T1 के चयन के लिए एक समस्या है, प्रत्यक्ष पीसीआर स्क्रीनिंग के द्वारा दूर किया जाता है। एंटीबायोटिक के बिना एमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित (ए) जंगली प्रकार सन बीज। (बी) जंगली प्रकार सन बीज एमएस संयंत्र मीडिया + बढ़ रही सांद्रता पर अंकुरित के केनामाइसिन (200 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, 600 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, 1 मिलीग्राम / एमएल)। जंगली प्रकार सन और T1 से 2 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन। (डी) पीसीआर के साथ एमएस संयंत्र मीडिया पर अंकुरित (सी) जंगली प्रकार सन बीज केनामाइसिन प्राइमरों का उपयोग अंकुर, सभी ampl, सी डीएनए मार्कर, FlaxS, जंगली प्रकार flaxS: EZ1: केनामाइसिन जीन (किंवदंतियों ified गैर डूबा शाखा पर नियंत्रण, मा: फूल से T1 के संतान &#39;ए&#39; मुख्य शाखा से एकत्र, अनुसूचित जाति, एसडी, एसई, एस एफ: पक्ष शाखा, डब्ल्यू से एकत्र विभिन्न फूल &quot;सी, डी, ई, एफ&quot; के T1 के संततियों। कोई-डीएनए) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> चित्रा 7. प्रत्यक्ष पीसीआर विधि का उपयोग T1 के संततियों के सफल पीसीआर amplifications का एक उदाहरण है। संयंत्र द्विआधारी वेक्टर + क्लोन एलआईएस -1 डालने की (ए) आरेख। नीले तीर (Takara से संशोधित) प्रत्यक्ष पीसीआर स्क्रीनिंग में इस्तेमाल पीसीआर प्राइमरों की स्थिति का संकेत। (बी) पीसीआर प्राइमरों M13F साथ + 3 &#39;(सी) पीसीआर के साथ प्राइमरों M13R + 18a <stroएनजी&gt; प्राइमरों सही सीमा (आरबी) और कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) के साथ (डी) पीसीआर ** प्रत्येक लेन व्यक्तिगत सी से एकत्र फूलों से T1 के प्रतिनिधित्व करता है: नियंत्रण शाखा (गैर डूबा हुआ है), एम: मुख्य शाखा फूल एजी, एस: पक्ष शाखा फूल ई.पू. &#39;। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> आगे प्राइमर अनुक्रम स्रोत </td><td> अनुक्रम 5&#39;-3 &#39; </td><td> रिवर्स प्राइमर अनुक्रम स्रोत </td><td> अनुक्रम 5&#39;-3 &#39; </td><td> एनीलिंग temprature (डिग्री सेल्सियस) </td><td> एक्सटेंशन समय (सेकंड) </td><td> उम्मीद आकार (बीपी) </td></tr><tr><td> M13F (टी डीएनए) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(एलआईएस -1 डालने) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18a (एलआईएस -1 डालने) </td><td> TATTTTAACCC <bआर /&gt; TATCTCCCAACAC </td><td> M13R (टी डीएनए) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> एमसीएस (टी डीएनए) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> आरबी (टी डीएनए) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> पौंड (टी डीएनए) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> ओपन स्कूल (टी डीएनए) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (टी डीएनए) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (टी डीएनए) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> तालिका 1. प्रत्यक्ष पीसीआर परीक्षण के लिए इस्तेमाल प्राइमरों के कुछ।

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

सन के पुष्प डुबकी परिवर्तन (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) एक उच्च परिवर्तन दर के साथ ट्रांसजेनिक संततियों उत्पन्न करने के लिए

यहाँ, हम पुष्प डुबकी के माध्यम से एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता संयंत्र परिवर्तन का उपयोग कर सन परिणत करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए सरल और सस्ता है, फिर भी सन परिवर्तन के लिए वर्तमान में उपलब्ध तरीकों की तुलना में एक उच्च परिवर्तन दर अर्जित करता है।

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

पुष्प डुबकी परिवर्तन Arabidopsis thaliana जांच करने के लिए PTSO2:: बीटा glucuronidase रिपोर्टर जीन एक्सप्रेशन

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

ट्रांसजेनिक का सृजन सी. एलिगेंस Biolistic परिवर्तन द्वारा

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

कुशल polyethylene glycol (खूंटी) मॉस की मध्यस्थता परिवर्तन Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Picoeukaryote के जीनोमिक परिवर्तन<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 का उपयोग करके नल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए क्यूलेक्स मच्छरों के भ्रूण तैयार करना और इंजेक्शन लगाना

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता आनुवंशिक परिवर्तन, ट्रांसजेनिक उत्पादन, और चावल में पुरुष प्रजनन विकास के अध्ययन के लिए इसका आवेदन

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

कृन्तकों के सिर पर परिभाषित त्वरण उत्पन्न करने के लिए निष्क्रिय हेड मोशन का अनुप्रयोग

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

प्राकृतिक परिवर्तन, प्रोटीन अभिव्यक्ति, और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम Phormidium lacuna के क्रायोकन्जर्वेक्षण

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

ब्लैक-लेग्ड टिक में जीन संपादन के लिए भ्रूण इंजेक्शन तकनीक, इक्सोड्स स्कैपुलारिस

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स-नैरोलीफ प्लांटेन का आनुवंशिक परिवर्तन

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...