Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

У некоторых видов растений, таких как лен (Linum Usitatissimum), успешная трансформация завод был ограничен. Ранее преобразования в льна потребовало Agrobacterium-инфекции путем ранение и Совместное культивирование с применением баллистической частиц или с помощью ультразвуковой обработки ультразвуком с последующей регенерацией; процесс, который является как длинные и склонны к сопровождается многих мутационных событий. Кроме того, процесс отбора из этих методов предполагает использование антибиотиков селективных маркеров, таких как канамицин. Тем не менее, было отмечено в литературе, что этот метод отбора производит много ложных срабатываний, как лен, как правило, чтобы избежать высоких концентраций антибиотиков 6,9,14. Другим недостатком предыдущих методов в трансформации льна был низкий уровень трансформации 2,6. В методике, описанной здесь, Agrobacterium опосредованной трансформации растений с помощью цветочно-погружением было показаночтобы привести к высокой скорости преобразования для льна (50 - 60%). Трансформанты были получены из цветов ближнего и собранных из главных и боковых ветвей. Выбор положительных трансформантов просто сделать, растет T1 растения на почву и сеанс листья вскоре после того, пророщенные, минуя использование отбора антибиотиков, шаг ранее использовались в качестве нормы в цветочный погружения для других видов растений. При выполнении прямого ПЦР тестирование листьев, и с использованием соответствующих праймеров Т-ДНК, положительные трансформанты могут быть отобраны быстро. Этот метод является простой, недорогой и простой для выполнения, но результаты в гораздо более высокими темпами трансформации, чем ранее сообщалось Arabidopsis и других видов растений, используя этот метод 1,10,12. Это также Максимальные скорости превращения льна. Тем не менее, существуют критические шаги в процедурах в том числе в выборе лучшего цветка стадии и лучшей концентрации поверхностно-активного вещества, так чтоAgrobacterium может проникнуть в клетки растений, не убивая цветочные органы. Если ранняя стадия бутон используется (рис 2а) с высоким Silwet-77 концентрации более 0,05%, цветок не будет развиваться ни установить семена. Если поздней стадии бутона используется (рис 2С), хотя преобразование может работать, это произойдет в гораздо меньшей степени. Аналогичные результаты были получены с Arabidopsis цветочный погружения трансформации 1,4. Для этого протокола, все цветочные этапы были протестированы с различными Silwet-77 концентрации и лучший этап был определен как стадия среднего бутона (фиг.2С) с Silwet-77 в количестве 0,05% для первого погружения, с последующим вторым погружением в поздней стадии почки (фиг.2С) со слегка пониженной концентрации Silwet-77 0,03%. Преобразование также хорошо работает с использованием ранней стадии бутонов (фиг.2А) с низкой Silwet-77 концентрации 0,003%, с последующимвторой этап погружения с среднего бутона (фиг.2В) при более высокой Silwet-77 концентрации 0,05%. В этом протоколе, некоторые другие параметры, пытаясь оптимизировать скорость преобразования, но не нашел, не имеют никакого влияния на конечный результат. Примеры включают в себя увеличение времени после погружения, что растения лежали на их стороне, и покрыты пластиком от одного дня до двух дней; используя наружный диаметр больше, чем 1 для Agrobacterium культуры, а 0,5 - 1; увеличивая время погружения до 5 - 15 мин вместо 1 - 2 мин. Опять мы не заметили какого-либо влияния на скорость преобразования с использованием этих стратегий. Наиболее эффективные факторы, однако, были уличены в использовании здоровые растения на правильных этапах цветок, и с использованием лучших концентрацию Silwet-77. Мы заметили, что два погружных интервалы, работает как-то лучше, чем один раз, хотя одно время погружения тоже работает. Модификация этого протокола может быть достигнуто путем reducinг концентрация Silwet-77 до всего лишь 0,003% во втором или третьем погружения. Поскольку Silwet-77 является токсичным, слишком высокая концентрация приводит цветов разработки слабо, что приводит к отсутствию урожая семян. Частота погружения могут быть сведены к одному, со второй или третьей события устраняется, если растения не здоровый вид и почки не развиваются хорошо. Основным недостатком этого метода является низкое число цветках, произведенных льна, недостаточное количество семян, полученных из каждого цветка, и длительный срок службы льна. Она занимает 6 - 8 недель от посева семян иметь первичные почки готовы к первому погружения и дополнительный 8 - 10 недель после погружения, чтобы добраться до поколения T1. В целом, диапазон 5 - 6 месяцев необходимо получить генерацию T1. В отличие от других видов растений, которые цветок в любое время года, некоторые льна сорта цветов лучше в определенное время года. Так продуманное планирование для этой техники очень важно. <p clосел = &quot;jove_content&quot;&gt; Таким образом, наши результаты цветочным падения с двух разных сортов льна: льна-долгунца, Stormont Cirrus (отзывчивы и пластик), и масло льна, Бетюн (стабильны и не реагируют), показывают, что Agrobacterium - опосредованной трансформации растений с помощью цветочно-провала применимо и эффективный способ трансформации льна и может быть использовано для замены ранее использовались методы трансформации льна. Модификации метода цветочно-погружением в настоящем Протоколе будет применяться для использования с любыми другими видами растений и не ограничивается льна.

Лен (Linum Usitatissimum) является важной культурой выросла широко за ее волокон и масла. Преобразование льна генома можно с методами, такими как ранения, Agrobacterium-инфекции, и совместного культивирования в культуре ткани, применяя баллистической частицы или ультразвуковое ультразвуком с последующей регенерацией. Тем не менее, эти методы имеют много недостатков, в том числе склонность ко многим мутационных событий и длительного времени для получения трансгенных линий. Некоторые из этих методов также может быть дорогостоящим и требует квалифицированных и эффективное манипулирование инструментов, что приводит к низким рассады восстановления. Самое главное, это техника часто приводит к низкому уровню трансформации 2,6. Agrobacterium опосредованной трансформации растений с помощью цветочно-провала простой и эффективный подход для создания трансгенных растений. Он был постоянно и успешно используется для многих видов растений, таких как Arabidopsis Thalian1,4, Medicago truncatula 11, помидоры 12, пшеница 13 и кукуруза 10. Тем не менее, он не был рассматривать как жизнеспособного техники для трансформации льна-за нескольких факторов, таких как низкий уровень числа цветках, произведенных льна, ограниченное количество семян, полученных от каждого цветка, большой размер семян, а толстый слой, который также может быть проблематичным для такого генетического процесса трансформации. Кроме того, выбор сегмента техники цветочно-погружением требуется прорастающих семян трансформированных растений на среде, содержащей антибиотик, с трансформированных потомства определяют на основе их способности к прорастанию и остается зеленым, в то время как нетрансформированных потомства либо не прорастают или прорастают, но отбеливателя быстро и умереть. В современной литературе, было отмечено, что дикого типа льна, как правило, чтобы избежать высокой концентрации антибиотика выборов, получения ложных положительных результатов, и сделать выбор на основе T1 потомстваоб устойчивости к антибиотикам сложнее 6,14. Кроме того, при высокой концентрации антибиотика добавляют к селекционной среде, скорость наблюдаемого трансформации резко упала 9. В этом протоколе, мы использовали Agrobacterium и метод цветочно-погружением, чтобы преобразовать линию волокна льна, Стормонт перистых (гибкой и пластик), который, как было показано в ответ на напряжений в среде, изменяя его геном 3,5. Чтобы преодолеть антибиотик проблему выхода мы выбрали, чтобы сделать прямые ПЦР тестирование ДНК из T1 листьев, вместо выбора, добавив антибиотик растительного СМИ. Мы воспользовались простой анатомии льна отслеживать конкретные цветы на время лечения. Эта система слежения позволила выбор семян из конкретных цветов и прорастания на почве без добавления антибиотиков. Положительные трансформанты просто определить путем тестирования ДНК получают из листьев, используя быстрый и эффективный способ выводаF прямой ПЦР. Наши результаты показывают, что метод цветочно-погружением работал очень хорошо в этой линии льна и удивительно привело к очень высокой скоростью преобразования (50 - 60%) выше, чем тех, которые ранее наблюдались Arabidopsis THALIANA, который был представлен 0,1 - 1 % 1, а также выше, чем у других видов растений 10,12. Мы также протестировали еще одна разновидность льняного (льна масличного), Бетюн (стабильны и не реагируют), и нашим предварительным данным показывает, что цветочно-погружением также работает для этого сорта льна. Целью этого протокола является показать, что Agrobacterium и цветочно-погружением может быть использован для создания трансгенного льна. Мы покажем, что этот метод является простым, недорогим и быстрее, чем другие методы преобразования льна. Что еще более важно это приводит к более высокой скорости превращения, чем у других методов льна трансформации 2,6. Анатомия Arabidopsis THALIANA, который имеет много ветвей и цветов, маКЭС трудно отличить ближнего и не опускают цветы на том же заводе. Таким образом, большое количество семян, примерно 20 000 семян с одного растения, нужно пройти обследование, чтобы определить положительные трансформантов 8. Лен, с другой стороны, имеет меньше филиалов (один основной ветви и несколько боковых ответвлений) и меньше цветов, производя около 100 семян на растениях, что делает возможным отслеживать отдельные цветы и выбрать конкретные семена во время процесса скрининга. Мы полагаем, что цветочно-провал применимый метод для преобразования любых родственных видов льна, род около 200 видов. Этот метод дает гораздо более высокую скорость преобразования по сравнению с другими методами трансформации льна. Мы также предлагаем, что прямой ПЦР скрининг T1 листьев ДНК эффективный способ преодолеть проблему устойчивости к антибиотику побега, который часто производит много ложных срабатываний. Прямая скрининга ПЦР могут быть применены к любым другим видам растений и не ограничивается тО лен. Простой метод отслеживания семян используют в данном протоколе могут быть применены к любым другим видам растений с ветвлением анатомии, аналогичную льна.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Agrobacterium опосредованной трансформации растений с помощью цветочные погружением является широко используемым методом в области трансформации растений и, как сообщалось, будет успешным для многих видов растений. Тем не менее, не было сообщено льна (Linum Usitatissimum) преобразование цветочными погружения. Целью этого протокола является установить, что Agrobacterium и способ цветочно-погружением может быть использован для создания трансгенного льна. Мы покажем, что этот метод является простым, недорогим, эффективным и, что более важно, дает более высокую скорость преобразования, чем имеющихся в настоящее время методов преобразования льна. Таким образом, соцветия льна погружали в раствор Agrobacterium, несущей бинарный вектор плазмиды (фрагмент Т-ДНК в сочетании с введением последовательности Linum, LIS-1) в течение 1 - 2 мин. Растения в горизонтальном положении на боку в течение 24 ч. Затем растени выдерживают в нормальных условиях роста до следующего лечения. В процесх погружения был повторен 2 - 3 раза, с примерно 10 - 14-дневными интервалами между погружения. Семена T1 собирают и проращивают на почве. После приблизительно двух недель, обработанные потомства были испытаны путем прямого ПЦР; 2 - 3 листья были использованы на заводе вместе с соответствующими праймерами T-ДНК. Положительные трансформанты отбирали и выращивали до зрелости. Скорость превращения неожиданно высоким, с 50 - 60% семян от обработанных растений, находящихся положительные трансформантов. Это выше скорость превращения, чем показатели по Arabidopsis THALIANA и других видов растений, используя преобразование цветочно-погружением. Это также самый высокий, который, как сообщалось до сих пор, для преобразования льна с использованием других методов трансформации.

Рисунок 1 - 4 иллюстрируют некоторые из этапов в протоколе. На рисунках 1 и 2, листья вокруг соцветия почки разрезают, чтобы выставить их на Agrobacterium клеток и на разных стадиях почки, которые были использованы для разработки протокола. Рисунок 3 показывает процесс льна цветочным погружения. Рисунок 4 показывает, пример того, как основные и боковые ветви могут быть помечены, и как отдельные цветы могут быть отслежены и определены. Рисунок 5 показывает, как потомства T1 может быть проращивают на MS средах растений, а затем пересаживают в почву для зрелости. 6 иллюстрирует, как дикого Тип льна можно избежать высоких концентраций канамицин, подтверждающие ранее сделанные выводы в литературе 6,9,14. На фиг.7 показан пример прямого ПЦР-амплификации с положительными трансформантов T1. Цветки T1 собирали из мАйн и боковые побеги одного T0 завода. Как можно видеть из прямого ПЦР, 8/12 T1 растений дали положительный результат с помощью ПЦР и амплифицированный различные зоны через Т-ДНК. Наши праймеры также разработаны между LIS-1 вставки и нескольких сайтов клонирования (7В и С). Мы использовали дополнительные праймеры из растительного бинарного вектора для амплификации различные сегменты Т-ДНК, такие как левой границы и терминатора NOS (данные не показаны) или правой границы и множественный клонирующий сайт (фиг 7D). Праймеров, специфичных к ЛИС-1 вставки были также использованы в данном протоколе (данные не показаны). Список праймеров приведены в таблице 1. Тем не менее, в последовательности этих праймеров, зависит от последовательности растительной Т-ДНК бинарного вектора и вставки, используемой для цветочно-погружением. Мы также отметили, что не было никакого существенного различия в скорости трансформации между цветами, собранных из главных и боковых ветвей. Рисунок 1. Резка листья вокруг первичных почек соцветия подвергать их клеток Agrobacterim. () Почки покрыты листьями. (B) Листья были вырезаны вокруг почек чтобы разоблачить их. (C) увеличенное изображение от завода в (А) после резки, чтобы разоблачить рецепторы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Фиг.2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Рисунок 2. Различные этапы бутон, которые были использованы в данном протоколе, чтобы определить наилучший сцену, чтобы использовать для цветочного падения. () На ранней стадии почка approxima<html> ДЕТАЛЬ 2 мм. (B) средняя стадия бутона примерно 5 мм. (C) Поздняя стадия бутона составляет примерно около 1 см. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Рисунок 3. Процесс льна цветочно-погружением. (А) Первичная соцветия погружают в инфильтрации СМИ, содержащих Agrobacterium клетки. (B) Увеличенная из (А). (C) Ближний свет растения не прилегают до следующего дня, и ближний ветви покрыты пластиком для поддержания высокая влажность. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> jove_content &quot;FO: Keep-together.within-страницу =&quot; всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Рисунок 4. Процесс отслеживания цветок и коллекций семян, из T0 необработанными растениями () пример целого растения с основной ветвью (по высоте филиала в центре) и боковые ветви (B - D). An . Пример цветы из разных отраслей (E) пример семян, собранных из отдельных цветов (помечены - K). от главной ветви <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Рисунок 5. растений Т1 выращивают без выбора антибиотиков. (A) семена T1 являютсяпроросшие на MS растений СМИ. (B) Положительные трансформанты, как определено путем непосредственного ПЦР, пересаживают в почву и выращивают до погашения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Рисунок 6. Антибиотик побег, проблема выбора Т1, преодолевается путем прямого скрининга ПЦР. (A) дикого типа семян льна прорастают на MS растений СМИ без антибиотика. (B) дикого типа семян льна проращивают на MS растений СМИ + Повышение концентрации канамицина (200 мкг / мл, 600 мкг / мл, 1 мг / мл). (C) дикого типа проросшие семена льна на MS средах с завода 2 мг / мл канамицина. (D) PCR от дикого типа льна и T1 Рассада с помощью канамицину праймеров, все Amplманьяков генные канамицин (легенды: EZ1: ДНК-маркера, FlaxS, flaxS дикого типа, C: управлять прочими смоченной ветку, Ма: T1 потомство от цветка &quot;&quot; собирали из основной ветви, Sc, Sd, Se, Sf: T1-потомства разных цветов &quot;C, D, E, F&quot;, собранных из боковой ветви, Вт:. Нет-ДНК) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Рисунок 7. Пример успешных ПЦР амплификации Т1 потомства с использованием прямого метода ПЦР. () Схема двоичного вектора растений + клонированного LIS-1 вставки. Синие стрелки указывают положение ПЦР-праймеров, используемых в ПЦР прямого скрининга (модифицированной от Takara). (Б) ПЦР с праймерами M13F + 3 &#39;(С) ПЦР с праймерами M13R + 18а <stroнг&gt; (D) ПЦР с праймерами правой границы (RB) и сайт множественного клонирования (MCS) ** Каждая дорожка представляет T1 от отдельных цветов, собранных из C: управления филиала (не ближний), M: главная отрасль цветок AG, S: боковая ветвь цветок BC &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Источник последовательность Прямой праймер </td><td> Последовательность 5&#39;-3 &#39; </td><td> Обратный источник праймера </td><td> Последовательность 5&#39;-3 &#39; </td><td> Отжиг Temprature (° C) </td><td> Расширение Время (сек) </td><td> Ожидаемый размер (BP) </td></tr><tr><td> M13F (Т-ДНК) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 вставка) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18а (LIS-1 вставка) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (Т-ДНК) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (Т-ДНК) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> РБ (Т-ДНК) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (Т-ДНК) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (Т-ДНК) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (Т-ДНК) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (Т-ДНК) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Некоторые из праймеров, используемых для прямого тестирования ПЦР.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Цветочные DIP-трансформация льна (<em&gt; Linum Usitatissimum</em&gt;) Для создания трансгенных потомство с высоким трансформации Оценить

Здесь мы приводим протокол для преобразования лен с помощью Agrobacterium опосредованной трансформации растений с помощью цветочным погружения. Этот протокол является простым для выполнения и недорогой, но дает более высокую скорость, чем преобразование текущих доступных методов трансформации льна.

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

Цветочные погружением Преобразование Arabidopsis thaliana, Чтобы изучить PTSO2:: β-глюкуронидазы Reporter экспрессии генов

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

Эффективное полиэтиленгликоля (ПЭГ) Опосредованное Преобразование Мосс Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Геномная Трансформация Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Тельца</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Опосредованная генетическая трансформация, трансгенное производство и его применение для изучения репродуктивного развития мужчин в рисе

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Применение пассивного движения головы для генерации определенных ускорений на головах грызунов

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Естественная трансформация, экспрессия белка и криоконсервация нитевидной цианобактерии Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Agrobacterium tumefaciens - опосредованная генетическая трансформация подорожника узколистного

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...