Name: a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord
Uploaded: 2014-12-03T15:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#956;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:+Al+2+O+3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#956;m in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier.</a> Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).</li><li>Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo,+Deep+Tissue+Three-Photon+Imaging+at+the+1700-nm+Spectral+Window.">In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window.</a> Biomedical Optics. 7 (3), (2012).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Lichtman, J. W., DENK, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Big+and+the+Small:+Challenges+of+Imaging+the+Brain's+Circuits.">The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits.</a> Science. 334 (6056), 618-623 (2011).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake,+Mobile+Mice.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Imaging+of+Neural+Activity+in+Awake,+Head-Restrained+Mice.+.">Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. .</a> Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).</li><li>Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats).">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats).</a> Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).</li><li>Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clustering+of+Neurons+in+Motor+Cortex+Determined+by+Cellular+Resolution+Imaging+in+Awake+Behaving+Mice.">Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice.</a> Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).</li><li>Ylera, B., Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-Injured+Adult+Sensory+Neurons+Gain+Regenerative+Competence+upon+a+Lesion+of+Their+Peripheral+Axon.">Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon.</a> Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).</li><li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord.">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS.">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> Plos One. 6 (3), 17910 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nature Communications. 3, 1227 (2012).</li><li>Dibaj, P., Steffens, H., Zsch&#252;ntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

Методика продемонстрирована здесь позволяет повторного замедленной, в естественных изображений в спинной мыши SC из многих недель после операции, без необходимости последующих хирургических процедур. Эта процедура представляет собой существенное улучшение по сравнению с повтор-хирургии визуальных исследований или над portmortem гистологических подходов, когда теряется информация о клеточной динамики. Напомним, ранее 30 продемонстрировали ценность этого метода для изучения SCI патологии в естественных условиях. Максимальная продольная протяженность визуализации был обусловлен увеличением плотной волокнистой ткани над спинной поверхности КА. Со временем, этот рост привел к потере контраста и разрешающей способности изображения. Этот рост был также замечен в альтернативных хирургических препаратов 31. Занимательно, что мы обнаружили, что этот рост может быть сведено к минимуму путем тщательного промывания дорсальной поверхности SC, чтобы удалить продукты крови, уплотнение поверхностьвырезать кости с цианоакрилату, герметизации краев камеры также с силиконового эластомера, и свести к минимуму промежуточного пространства между спинной СК и покровного стекла. Недавно другой подход совпадает с нашим использованием поликарбоната камеру была продемонстрирована 32. Использование поликарбоната имеет преимущество, поскольку он совместим с рентгеновским и условий Акустоскопия, что не дело для наших деталей из нержавеющей стали. Тем не менее, с теперь уже повсеместно технологии 3D принтеров, камера части могут быть изготовлены из самых разнообразных материалов, в соответствии с конкретными потребностями. Мы недавно напечатаны все наши детали в ясной фотополимера. Одним из ключевых недостатков закрытой камере неспособность управлять повторных доз препаратов или экзогенных красителей, пригодных для SC изображений 34. Однако, спекулируя на механической стабильности нашей нынешней системе, мы уже использовали нашу нынешнюю камеру, чтобы успешноLY якорь интратекальный катетер, соединенный с имплантировали подкожно инъекции порт, который позволил доставки наркотиков в различные моменты времени даже в закрытой системе камеры (неопубликованная работа). Кроме того, из-за модульной природы верхней пластины, будущие версии этого препарата будет включать в себя закрывающийся камеру, чтобы позволить для повторного применения обоих терапевтических агентов и флуоресцентных меток. Можно также представить себе верхние пластины с креплениями для записи электроды, оптические вставки, и порты для доставки лекарственных средств. Такие добавки, вероятно, будет более сложным для реализации, используя более минималистский систему Fenrich и др. 31. В заключение, наша камера обеспечивает шлюз платформу, на которой может быть основано различные эксперименты.

Покадровый в естественных условиях микроскопии в интактных организмов позволяет прямую визуализацию сложных биологических процессов, которые недоступны для традиционного анализа точки одноразовые, таких как иммуногистохимии. В частности, многофотонной микроскопии (MPM) 1 позволяет изображений в ткани рассеяния, например, в коре головного мозга грызунов, где изображения до 2,3 и свыше 4 1 мм была достигнута. В сочетании с хирургическими препаратов 5-7, в котором одна процедура позволяет оптический доступ к мозгу в течение нескольких недель до нескольких месяцев, эти микроскопические подходы были использованы для изучения динамических процессов в мозге здоровых и больных государств 8-11. Кроме того, протоколы были разработаны 12,13, которые обеспечивают для работы с изображениями в естественных условиях у бодрствующих (то есть, не под наркозом) животных, что позволяет функциональной визуализации сотовой резолюции, в ходе поведенческих тестах. Эти протоколы были использованы для comparisДополнения коррелированных нейронной активности 14, астроцитов кальция сигнализации 15 под наркозом и активных животных, определение конкретных задач нейронных кластеров 16, а способность нейронов к дискриминации Расположение объекта на усов стимуляции 17. Учитывая потенциал этого подхода для выяснения здоровых и патологических механизмов замедленной в естественных изображений была применена к мыши спинного мозга (SC), что позволяет для идентификации острой дегенерации аксонов (AAD) в качестве механизма болезни 18. Последующие исследования исследовали эффекты периферийных поражений на спинальных ганглиях (DRG) регенерации аксонов 19, роль кровеносных сосудов в аксонов регенерации 20, глиальных хемотаксис в ответ на повреждения 21, миграция Т-клеток в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) 22, деятельности микроглии 23,24 и астроциты 25 в ответ на amyotrophIC латеральный склероз (ALS), роль STAT-3, в аксонов после травмы SC (SCI) 26, и механизм потери аксонов и восстановления в EAE 27. Несмотря на успех этих подходов, все эти исследования были ограничены либо одной сессии изображений, тем самым ограничивая исследования для краткосрочных динамики, либо требуется повторное хирургическое отверстия животного в каждый момент времени визуализации точки, ограничивая количество точек время доступных и увеличивая вероятность смешанных экспериментальных артефактов. Протоколы для этих операций были опубликованы ранее 28,29. Недавно мы опубликовали методику 30 для имплантации хронической спинного камеры, что позволило покадровой MPM изображений в мыши СУ в течение нескольких недель без необходимости повторных операций. Короче говоря, это хирургическая подготовка входило проведение ламинектомию в нижней грудного отдела позвоночника и имплантацию четырех частей камеры. Палата, втри специально обработанные детали из нержавеющей стали, что зажатые позвонков вокруг ламинектомию, и покровного стекла, расположенную над СК и крепится с помощью силиконового эластомера. Этот метод позволил рутинной изображений для более чем 5 недель после операции у здоровых и раненых государств без необходимости повторных операций. Число изображений моменты времени было ограничено только частоты, на которой животное может переносить обезболивающий индукции. Срок службы изображений был ограничен ростом плотной волокнистой ткани на поверхности КА. Кроме того, мы убедились, что хирургическое имплантата не было долгосрочный эффект на моторные функции. С нашей первой публикации, альтернативные подходы также дают возможность долгосрочного изображений в СК были описаны в других 31-33. Этот протокол демонстрирует нашу процедуру имплантации в спинной камеру мы разработали.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Следуя описанной выше процедуры, каждая стадия операции должны имитировать результаты на каждом этапе операции, описанной на рисунке 2. Особое внимание должно быть принято при применении силиконового эластомера для устранения воздушных пузырей под стеклом или по крайней мере убедиться, что они расположен на периферии области интереса (рис 2L). Для опытного хирурга, хирургические осложнения, требующие эвтаназии либо во время операции или в течение первых 24 ч послеоперационные встречаются приблизительно в 20% операций. Эти осложнения чаще возникают от чрезмерного кровотечения мягких тканей или неудачи, чтобы надежно прикрепить камеру к позвоночному столбу. Успешно имплантированных камер, окно, как правило, остается оптически прозрачным для нескольких недель (Рисунок 3). Несмотря на все усилия, непрозрачный, волокнистая, новообразований часто образует в течение нескольких дней, в результате чего частичной Obscuriнг окне (рис 3С - F, черный пунктир). Люминесцентные структуры трудно увидеть с помощью 2PEF микроскопии под этим фиброзной ткани. Мы находим двойное распределение результатов, с примерно 50% успешно внедренных окон оставаясь ясно более 5 недель после операции, и примерно 50% становятся затемненный в течение 1 - 3 недель. Для окон, которые остаются четкие, большинство мест в пределах обзорным окном опыта только умеренной степенью неоваскуляризации или выше твердой мозговой оболочки (рис 3D - F, зеленый звездочки), который не мешает изображений 2PEF. Наши предыдущие исследования 30 показали увеличение микроглии, но не плотность астроцитов под окном и смежными позвонками, что указывает на умеренное воспаление, аналогичное тому, которое наблюдалось в черепных окно препаратов 5. У трансгенных мышей, экспрессирующих желтый флуоресцентный белок (YFP) в подгруппе задних корешков GanglIA (DRG) нейронов (YFPH линии; Jackson Labs), аксоны были четко различимы в течение нескольких недель после операции (фиг.4А и б), и до тех пор, четыре месяца у одного животного (данные не показаны). Кровеносные сосуды (фиг.4А и Б) были сделаны видимыми ретро-орбитально инъекционных флуоресцентного Texas Red декстран помечены в плазме крови. Микроглия также визуализируется в мышей, экспрессирующих GFP в CX3CR1 стучать в мышь (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) подошел к YFPH линии (рис 4C). Контраст и разрешение ухудшается с течением времени незначительно (фиг.4С) в связи с формированием волокнистого разрастание ранее описанного 30. Мы регулярно отображаемого в течение 3 ч в течение одной сессии без смертности и так часто, как каждые 12 часа. Продолжительность сеанса и частота ограничена толерантности животного для индукции анестезии, сопутствующих с этическими соображениями, сопровождающих боль и страдания лабораторных животных. &lt;<html> P CLASS = &quot;jove_content&quot; FO: Keep-together.within-страницу = &quot;всегда&quot;&gt; <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Рисунок 1. Пользовательских хирургическое люкс облегчает доставку камеры во время имплантации и стабилизирует камеру во время последующих сеансов изображений. Двух боковых полосы, и верхняя пластина (А) собраны (В) с помощью небольших винтов в спинной камеры (C). Столы с выдвижной должностей (D) позволяет для доставки и зажима побочных баров позвонков через контакты Holding (E). Последующие сеансы визуализации использовать вместо внутренней резьбой сообщения прикрепить к камере с помощью установочных винтов на крыльях имплантата (F). Панель В этой фигуры была изменена с Фаррар и др., Methods природа, 2012 30 с разрешения издательской группы Nature.96 / 52196fig1large.jpg &quot;TARGET =&quot; _ пустое &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. <img alt="Фиг.2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Рисунок 2. Спинной ламинэктомию выполняется и хронический изображения камеры имплантируется, чтобы обеспечить оптический доступ к спинному мозгу. Эта процедура описана в монтаже. Во-первых, кожи (панели, B; разделах протокола 3,1 - 3,4) и мышц (C; 3,5) убираются выставить три основной позвонков. Ткани, покрывающий эти три позвонка удаляют (D, E, F, 3,6 - 3,10) и боковые процессы соскабливают чистым, прежде чем они зажаты с обеих сторон (G, H, 3,12). Осторожно, спинной пластинки центральной позвонка удаляют, а края кости запечатаны (I </stronг&gt;; 4. 6). Верхняя пластина применяется (J; 5,1) и болты закреплены в положении (K; 5,3), чтобы закрепить камеру перед закрытием камеру с силиконового эластомера и покровного стекла (L; 5,5). После штифты доставки удаляются (М; 5,8), кожа приклеена к сторонам камеры (M, N; 5,8) и установочные винты вставлены в крылья (O; 5,9). Наконец, винтовых шлицев запечатаны стоматологическим акриловым (Р; 5,10). И мышь помещали в чистую клетку, чтобы восстановить <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Рисунок 3. хронический спинного камера остается оптически прозрачного овэ несколько недель. Белые светлые образы спинного мозга, начиная от нескольких минут (А) до трех недель после операции (F). Сосудистые достопримечательности могут быть идентифицированы во всех временных точках (желтые стрелки). Небольшое изменение видно в один день послеоперационные (B). Плотной волокнистой разрастание (С - F, ограниченную пунктирной линией на нижний правый) присутствует уже через три дня и приводит к частичной запутывания области формирования изображения. Мягкий новых сосудов (D, E, F, зеленые звездочки) также присутствует, но не заслонять оригинальный сосудистую в белом свете или изображений 2PEF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Рисунок 4. хронический спинного камера позволяет для повторного изображений многофотонной без необходимости повторных операций. Повторное изображений трансгенных мышей, экспрессирующих YFP в подгруппе DRG аксонов (зеленый) в спинной Funiculi спинного шнур и сосудистой (красный) помечены инъекции внутрисосудистого красителя (A, B). Деятельность микроглии (лиловый), также можно отслеживать с течением времени в Thy1-YFP / CX3CR1-GFP дважды трансгенных мышей (C). В то время как аксоны и микроглии остаются видимыми, контрастность и разрешение снижение скромно с течением времени (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

В этом видео мы опишем процедуру имплантации хронический оптического изображения камеры на спинной спинного мозга живую мышь. Камера, хирургическая процедура, и хронический изображений пересматриваются и продемонстрировал.

Процедура имплантации спинного палату для продольных<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализация мозга мыши спинного

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Распространение изображений в спинном мозге крыс шейки матки

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

В естественных условиях Дуэт цветной метод для визуализации сосудистой динамика после тупыми спинного мозга

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...