Name: specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00
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This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

ペプチド配列の調製<ol><li>ペプチド配列のプログラミング<ol><li> MultiPepスポッターソフトウェアを使用して合成するためのペプチド配列を設計します。 1文字のコードでペプチド配列を入力してください。 ペプチド1：TARKSTGGKA </li><li>定義された基板の認識に必要な重要なアミノ酸をスクリーニングするために特定のコマンド（.replace、A）とアラニン又はアルギニン散歩ライブラリを生成?...

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. 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F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

SPOT合成ここに記載されるように、タンパク質 - タンパク質相互作用部位をマッピングし、ペプチド修飾酵素の基質認識を調査するための強力な方法である。 SPOT法により合成されたペプチドは、これは、各インスタンスに確認することが困難であり、90％を超える純度21を有することが報告されているが、しかし、SPOT合成は、依然として、いくつかの欠点を有している。した...

過去20年間、いくつかの報告は、細胞の発達および癌のようないくつかの疾患において、翻訳後修飾（PTM）の重要性を実証したが、最近、タンパク質のリジンのメチル化は、他の重要なPTMとして浮上している。最初にヒストンリジンのメチル化は、本質的なクロマチンマークであることが見出されたが、後の研究は、いくつかの非ヒストンタンパク質1~4のリジンのメチル化を示した。リジン残基のεアミノ基へのS-アデノシル-L-メチオニンからのメチル基の連続的な移動は、ヒトゲノム中に60以上のタンパク質を含むタンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼ（PKMTs）と呼ばれる酵素のファミリーによって触媒される。 PKMTsは、最初に特定のリジン残基をメチル化、ヒストン修飾酵素として発見されたが、後の報告は、これらはまた、非ヒストンタンパク質5をメチル化できることを実証した。現在までに、約5000リジンメチル化部位は、異なるタンパク質上で同定された6 </sアップ&gt;が、これらの変更に関与する酵素は、多くの場合、特定されていません。その理由の一つは、最もPKMTsの特異性が広く研究されていないことである。そのため、反復的にPKMTsの新規基質が発見されていることを発生する。 PKMTsの基質特異性の詳細な知識の欠如は、それらの生物学的機能と役割の理解を妨げる。詳細PKMTの特異性を研究するために、1若しくは数個のアミノ酸が異なる多くのペプチド基質のメチル化率を測定する必要があり、理想的には、ペプチドアレイを用いて行われる、比較。得られた特異性プロファイルに基づいて、PKMTsの潜在的基質をさらに研究することができることを同定することができる。 ペプチド配列は、抗体の生化学分析のために広く使用されているツールは、ペプチド修飾酵素およびタンパク質-タンパク質相互作用部位（抗体-抗原、受容体-リガンド）のマッピング7-9である。ペプチドの数百SUCのために必要とされるHアプリケーション。別の方法は、それらの間で樹脂上でのペプチド合成は、非常に一般的に使用され、ペプチド合成のために利用可能であるが、それは、スループットに制限があり、それが比較的高価である。これらの問題は、フランクと同僚10によるSPOT合成法の導入により解決された。 SPOT合成法は、並行して、数百のペプチドの合成を可能にし、平均して、樹脂の合成に比べて安価である。セルロース膜上に合成されたペプチドは、膜から切断し、溶液アッセイにおいて、またはペプチドマイクロアレイ10-13を調製するための遊離ペプチドとして使用することができ、様々なアプリケーションまたはペプチドのいずれかのために直接使用することができる。 SPOT合成は、固体支持体としてのセルロース膜を使用し、標準的なFmoc化学10-13を用いる固相ペプチド合成の変異体である。したがって、ペプチド鎖の合成は、C末端から始まりに向かって進行するリボソームにおける生物学的合成とは対照的に、N末端。セルロース膜は、第一の活性化アミノ酸（ 図1）の取付けのために官能化される。 SPOT法は、自動化ピペッティングシステムを用いて膜上の規定のスポットへの溶媒の液滴中の活性化されたアミノ酸の逐次的送達に基づいている。液体の液滴は、それが後でペプチド合成における化学反応のためのオープンな反応器として機能する円形のウェットスポットを形成し、多孔質膜上に分配される。スポットサイズは​​体積分注し、膜の吸収能力によって決定され、そのようなスポットの倍数は、アレイとして配置されている。合成のスケールは、スポットサイズ、膜の積載量と相関する。スポットのアレイの密度との間の距離は、スポットサイズを変化させることによって管理されている。セルロース膜はchemicに耐性は、安価で、ペプチド合成において固相として、いくつかの利点を有する水溶液中で安定であり、取り扱いが容易で、ペプチド合成に使用するals。また、その親水性の性質は、いくつかの生物学的アッセイシステムに適しています。 SPOT合成は、ペプチドの必要数に応じて、（ペプチドの1000など）を手動で行うか、自動化することができる。 Intavis（ケルン、ドイツ）から完全に自動化されたSPOT合成は、我々の用途に用いられる。これは、異なる量および異なる長さのペプチドの合成を可能にする。また、段階的合成14,15によって調製することができる線状ペプチドは、定期的に、最大42個のアミノ酸の付加ペプチドが、15〜20アミノ酸長で合成される。しかしながら、アミノ酸の数を増加させることは、ペプチドの品質に影響を与える全体的なカップリング収率の低下につながる。なぜならスポットあたりのペプチドの量が少ないと、製品はしばしば精製が困難であり、個々のペプチドの品質を容易に評価することはできない。したがって、結果は、SPOT PEPTから得IDEの配列のいずれかのペプチドの合成において、所望のペプチド配列を含むタンパク質を合成することによって基準に従って精製し、分析することができる大規模で標準的な方法によって合成されたペプチドを確認しなければならない。それでも、我々は高い信頼性がSPOT合成を見つけ、再現性があることが一般に生じる。 SPOT合成は、いくつかの市販の修飾アミノ酸はまた、合成のために使用することができ、タンパク質構成アミノ酸に制限ペプチドは、側鎖保護基の最終的な切断の前と後に修正されることを可能にし、さらに、それはまた、組み込むことを可能にされていない、リン酸化されたメチル化またはアセチル化アミノ酸は11。 SPOT法により合成固定化ペプチドライブラリーは、直接、多くの生物学的および生化学的アッセイのために使用することができる。我々はPKMTsの基質特異性を調べるために300-400ペプチドを含むペプチドアレイを用いた。酵素によるMODIFIのために陽イオンは、ペプチド配列は、それぞれPKMTと共にインキュベートされ、適切な緩衝液中に[メチル- 3 H]標識-AdoMet。それぞれの基質のメチル化は、オートラジオグラフィー（ 図3）を介して、ペプチド基質へのAdoMetから放射性標識されたメチル基の酵素的転移を下記によって分析される。この手順によって、ペプチドアレイは、同時に異なるペプチド基質のメチル化の研究を可能にする。この方法の1つの重要な利点は、メチル化動態の線形位相の間に、各ペプチドの相対的なメチル化は、解離定数（k 猫 / Kで割った触媒速度定数に比例するように、すべてのペプチドは、競争においてメチル化されていることであるそれぞれのペプチド基質に対する酵素のD）。したがって、各スポットに取り込まれた放射活性の量は、直接特定のペプチドに向かって酵素活性と相関している。使い方ペプチド配列のメチル化実験の結果、PKMTの特異性プロファイルが定義され、この新規基質に基づくこ​​とができるが前提とすることができる。ペプチド配列は、ペプチドレベルでの新規基質のメチル化の迅速かつ費用効率的な検証を可能にする。このために、アレイは、標的部位でのLysのAlaの代わりにを含む修飾されたペプチド、ならびに陽性および陰性対照ペプチドと共に予測新規基質を含有する調製される。最後に、新規基質は一緒にターゲットのLysがAlaに変更され、メチル化は、タンパク質レベルで確認することができる変異体を有するタンパク質として調製することができる。結果に応じて、これは、新たに記載されるタンパク質基質のメチル化の潜在的な役割に対処する生物学的研究が続いている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

リジンのメチル化は、新たな翻訳後修飾であり、それは細胞の発達および多くの疾患において重要な役割を果たしているいくつかのヒストンおよび非ヒストンタンパク質、上で同定された。約5000リジンメチル化部位は、タンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼの数十によって設定された異なるタンパク質、上で同定された。これは、各PKMTしかし今は、1つまたは2つの基板は、これらの酵素のいくつかのために同定されているまで、複数のタンパク質をメチル化することを示唆している。この問題に取り組むために、我々が導入しているペプチドアレイベースの基質特異性はPKMTsの分析。異なる配列を有するいくつかの基板のメチル化は1アレイ上でテストすることができるので、ペプチドアレイはPKMTsの特異性を特徴づけるための強力なツールです。我々はIntavis SPOT合成機を用いてセルロース膜上にペプチド配列を合成し、様々なPKMTsの特異性を分析した。これらの酵素のいくつかのために、その結​​果に基づいて、新規のubstratesを同定することができた。例えば、ペプチドアレイを用いることによりNSD1ために、我々はそれがH4のK44の代わりに報告H4K20のメチル化と加えH1.5K168は以前から知​​られているH3K36上非常に好ましい基質であることを示した。したがって、ペプチド配列は、生化学的にPKMTsを特徴付けるための強力なツールです。

ペプチドアレイが正常生化学PKMTsの特異性を特徴付けるために使用し、PKMTのいくつかの新規なヒストンおよび非ヒストン基質は、このアプローチ5,16-19によって同定した。 PKMT（または任意の酵素）の正確な基質スペクトルを定義すると、その分子機構と細胞機能の理解に向けて不可欠なステップである。 ペプチドSPOTアレイメチル化法の適用例として、NSD1 PKMT <sup...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

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Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

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リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

多重ケモスタットアレイの設計および使用

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...