Name: specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00
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This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Preparación del péptido Arrays <ol><li> Programación de la secuencias peptídicas <ol><li> Diseñar secuencias de péptidos para la síntesis utilizando el software MultiPep Spotter. Introduzca las secuencias de péptidos en los códigos de una sola letra. Péptido 1: TARKSTGGKA </li><li> Generar alanina o arginina pie bibliotecas con un comando específico (.replace, A) para detectar los aminoácidos importantes que se requieren para el reconocimiento de un sustrato definido. Por ejemplo, en el siguiente...

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

Síntesis SPOT como se describe aquí es un poderoso método para asignar sitios de interacción proteína-proteína e investigar el reconocimiento de sustrato de enzimas peptídicas modificar. Sin embargo, la síntesis SPOT todavía tiene ciertos inconvenientes, porque aunque se informó de los péptidos sintetizados por el método SPOT tener más de 90% de pureza 21 esto es difícil de confirmar en cada caso. Por lo tanto, los resultados tienen que ser reproducida por otros métodos, por ejemplo, el uso de ...

En las últimas dos décadas, varios informes han demostrado la importancia de las modificaciones posteriores a la traducción (PTM) en el desarrollo celular y varias enfermedades como el cáncer, pero recientemente la proteína metilación de la lisina se ha convertido en una otra PTM vital. Mientras histona inicialmente metilación de la lisina se encontró que era una marca esencial de la cromatina, el trabajo más tarde también mostró lisina metilación de varias proteínas no histonas 1-4. La transferencia secuencial de los grupos metilo de la S-adenosil-L-metionina al grupo ε-amino de residuos de lisina es catalizada por una familia de enzimas llamada proteína de lisina methyltransferases (PKMTs) que contiene más de 60 proteínas en el genoma humano. PKMTs fueron descubiertos inicialmente como enzimas histona modificación que metilan residuo de lisina específico, pero informes posteriores demostraron que también podían methylate proteínas no histonas 5. Hasta ahora, se han identificado aproximadamente 5,000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas 6 </shasta&gt;, pero las enzimas responsables de estas modificaciones a menudo no se identifican. Una razón para esto es que la especificidad de la mayoría de PKMTs no ha sido ampliamente estudiado. Por lo tanto, se produce de forma recurrente que los nuevos sustratos de PKMTs se descubren. La falta de un conocimiento detallado de la especificidad de sustrato de PKMTs dificulta la comprensión de su función biológica y el papel. Para estudiar la especificidad de un PKMT en detalle, las tasas de metilación de muchos sustratos peptídicos que difieren en uno o unos pocos aminoácidos deben ser medidos y comparados, que se realiza idealmente utilizando arrays de péptidos. Basándose en los perfiles de especificidad resultantes, potenciales sustratos de PKMTs se pueden identificar que puede ser estudiado más. Arrays de péptidos se utilizan ampliamente herramientas para el análisis bioquímico de anticuerpos, enzimas modificadoras de péptidos y el mapeo de sitios de interacción proteína-proteína (anticuerpo-antígeno, receptor-ligando) 7-9. Se necesitan varios cientos de péptidos para such aplicaciones. Diferentes métodos están disponibles para la síntesis de péptidos, entre ellos Peptide Synthesis sobre resina se utiliza muy comúnmente, pero tiene limitaciones en el rendimiento y es relativamente caro. Estos problemas se resolvieron con la introducción del método de síntesis SPOT por Frank y sus colegas 10. El método de síntesis SPOT permite la síntesis de varios cientos de péptidos en paralelo y en promedio es barato en comparación con la síntesis de resina. Los péptidos sintetizados sobre membrana de celulosa se ​​pueden utilizar ya sea directamente para diversas aplicaciones o péptidos se puede escindir de la membrana y se utiliza como péptidos libres en solución o ensayos para preparar microarrays de péptidos 10-13. Síntesis SPOT es una variante de la síntesis de péptidos en fase sólida, que utiliza una membrana de celulosa como un soporte sólido y emplea el Fmoc-química estándar 10-13. Por lo tanto, la síntesis de cadenas peptídicas comienza en el extremo C-terminal y procede haciael extremo N-terminal en contraste con la síntesis biológica en los ribosomas. Las membranas de celulosa están funcionalizados para la unión de la primera activado ácidos amino (Fig. 1). El método SPOT se basa en la entrega secuencial de aminoácidos activados en una gotita de disolvente a lugares definidos en la membrana usando un sistema de pipeteo automatizado. La gota de líquido se dispensa en la membrana porosa donde forma una mancha de humedad circular, que posteriormente actúa como un reactor abierto para las reacciones químicas en la síntesis de péptidos. El tamaño del punto se determina por el volumen dispensado y la capacidad de absorción de la membrana, múltiplos de tales puntos están dispuestos como arrays. La escala de la síntesis se correlaciona con el tamaño del punto y la capacidad de carga de la membrana. La distancia entre los puntos y la densidad de arrays se gestionan mediante la variación de los tamaños de punto. Membrana de celulosa tiene varias ventajas como fase sólida en la síntesis de péptidos, es barato, tolerante a la chemicals, utilizados en la síntesis de péptidos y estables en soluciones acuosas y fácil de manejar. Además, su naturaleza hidrofílica lo hace adecuado para varios sistemas de ensayo biológico. Síntesis SPOT puede llevarse a cabo de forma manual o automatizado (para 1000s de péptidos) en función del número requerido de péptidos. Un sintetizador SPOT totalmente automatizado desde Intavis (Köln, Alemania) se utiliza para nuestras aplicaciones. Permite la síntesis de péptidos en cantidades diferentes y de diferente longitud. Los péptidos lineales se sintetizaron regularmente con ácido longitud de 15 a 20 amino, en los péptidos de adición de hasta 42 aminoácidos también se pueden preparar por paso a paso la síntesis 14,15. Sin embargo, aumentar el número de aminoácidos conduce a reducciones en los rendimientos de acoplamiento en general, que afecta a la calidad de los péptidos. Debido a la baja cantidad de péptidos por punto, los productos son a menudo difíciles de purificar y la calidad de los péptidos individuales no se pueden evaluar fácilmente. Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de Pept SPOTarrays IDE deben ser confirmadas ya sea con péptidos sintetizados por métodos estándar en mayor escala, que pueden ser purificados y analizados de acuerdo a los estándares en la síntesis de péptidos o por la síntesis de las proteínas que contienen las secuencias de péptidos deseados. Aún así, encontramos la síntesis SPOT ser altamente fiable y resultados generalmente para ser reproducible. Síntesis SPOT no se limita a proteinogenic aminoácidos, varios ácidos disponibles comercialmente aminoácidos modificados también pueden ser utilizados para la síntesis, lo que permite péptidos para ser modificados antes y después de la escisión final del grupo de protección de cadena lateral y, además, también permite la incorporación de aminoácidos fosforilados, metilados o acetilados 11. Bibliotecas de péptidos inmovilizados sintetizados por el método de SPOT se pueden utilizar directamente para muchos ensayos biológicos y bioquímicos. Empleamos arrays de péptidos que comprenden 300-400 péptidos para investigar la especificidad de sustrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatión, las matrices de péptidos se incuban con el respectivo PKMT y etiquetado [metil- 3 H] -AdoMet en un tampón apropiado. La metilación del sustrato respectivo se analizó siguiendo la transferencia enzimática de los grupos metilo de AdoMet marcados radiactivamente en el sustrato péptido mediante autorradiografía (Fig. 3). Por este procedimiento, las matrices de péptidos permiten el estudio de metilación de diferentes sustratos peptídicos al mismo tiempo. Una ventaja importante de este método es que todos los péptidos están metiladas en la competencia, de modo que durante la fase lineal de la cinética de metilación, la metilación relativo de cada péptido es proporcional a la constante de velocidad catalítica dividido por la constante de disociación (k cat / K D) de la enzima por el sustrato peptídico respectiva. Por lo tanto, la cantidad de radiactividad incorporada en cada lugar se correlaciona directamente con la actividad enzimática hacia el péptido particular. Utilizando elresultados de un experimento de metilación matriz de péptido, el perfil de especificidad de la PKMT se pueden definir y basándose en este nuevo sustratos pueden ser afirmados. Arrays de péptidos permiten la validación rápida y eficiente costo de la metilación de nuevos sustratos en el nivel de péptido. Para esto, se preparan las matrices que contienen los nuevos sustratos predichos junto con péptidos modificados que contienen un Ala en lugar de Lys en los sitios diana, así como péptidos de control positivos y negativos. Finalmente, los nuevos sustratos se pueden preparar como proteínas junto con mutantes, en los que el objetivo Lys está reemplazado por Ala y la metilación puede ser confirmada a nivel de proteína. Dependiendo de los resultados, esto es seguido por los estudios biológicos que abordan posibles funciones de la metilación de los sustratos proteicos recién descritos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Metilación de la lisina es una modificación post-traducción emergentes y se ha identificado en varias proteínas histonas y no histonas, donde juega un papel crucial en el desarrollo de células y muchas enfermedades. Aproximadamente se identificaron 5.000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas, que son fijados por unos decenas de lisina methyltransferases proteína. Esto sugiere que cada PKMT methylates múltiples proteínas, sin embargo hasta ahora sólo uno o dos sustratos se han identificado varias de estas enzimas. Analiza la especificidad de sustrato de arreglo péptido Para abordar este problema, hemos introducido de PKMTs. Matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar la especificidad de PKMTs porque metilación de varios sustratos con diferentes secuencias se puede probar en un array. Hemos sintetizado arrays de péptidos en la membrana de celulosa usando un sintetizador Intavis SPOT y analizado la especificidad de los distintos PKMTs. Basándose en los resultados, para varias de estas enzimas, s novelaubstrates pudieron ser identificados. Por ejemplo, para NSD1 mediante el empleo de arrays de péptidos, mostramos que metila K44 de H4 en lugar de la H4K20 informado y además H1.5K168 es el sustrato altamente preferido sobre el H3K36 anteriormente conocido. Por lo tanto, las matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar bioquímicamente los PKMTs.

Arrays de péptidos se utilizaron con éxito para caracterizar bioquímicamente la especificidad de PKMTs, y se identificaron varios novela histonas y no histonas sustratos de PKMT por este enfoque 5,16-19. Definir el espectro de sustrato correcto de una PKMT (o cualquier enzima) es un paso esencial para la comprensión de su mecanismo molecular y funciones celulares. Como un ejemplo de la aplicación del método de matriz de metilación SPOT péptido, se describen los resultados ...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

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Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...