Name: proteomic profiling of macrophages by 2d electrophoresis
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00
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This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).

プロトコルは、私たちの機関人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。健康なヒトのドナーからのバフィーコートは、地域輸血センター（リール、フランス）から入手した。軟膜から得られた試​​料は、INSERMコレクション（N°DC2010-1209）として宣言されています。 1.材料と文化メディアの準備<ol><li> 1×PBSを取得するために滅菌蒸留水に10×リン酸緩衝生理食...

<ol>
	<li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes:+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion.">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li><li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+switching:+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation.">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li><li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages.">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li><li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptors:+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines.">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li><li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages.">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li><li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR&#947;+and+LXR&#945;+pathways.">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPAR&#947; and LXR&#945; pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li><li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology.">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li><li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes.">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li><li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages.">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li><li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome.">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li><li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis.">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li><li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics:+clinical+implications.">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li><li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proinflammatory+CD68+MR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans.">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li></ol>

本明細書中に記載されるプロトコルは、マクロファージ、M1（炎症誘発性）およびM2（抗炎症性）の2つのサブタイプの種々の刺激の影響を分析するための方法を詳述する。以前に公開され7 M1及びM2マクロファージの初代培養物は、単球の分化から得た。 2D DIGEゲル電気泳動の手順は、Cy3およびCy5の励起/発光波長で2回ゲルを走査するために、SDS-PAGEのために、低蛍?...

マクロファージは、異なる機能の表現型を獲得することができる異種の、プラスチック細胞である。 インビボでの、これらの細胞は、微生物産物、サイトカインなど 1とマイクロ環境signalssuch多種多様に応答する。 インビトロ 、炎症誘発性表現型（M1）マクロファージのリポ多糖（LPS）およびインターロイキン4（IL-4）などのいくつかのサイトカインによる抗炎症性表現型（M2）によって誘導することができる。また、マクロファージは特定の信号2時には逆にM2表現型に活性化したM1から切り替え、することができます。 表現型に依存して、マクロファージは、異なる機能を有することになる。 M1マクロファージは、微生物または腫瘍細胞3を殺すために、例えば、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症誘発性サイトカインを産生する細胞である。対照的に、M2マクロファージは、抗inflammatorを生成することによって創傷治癒および線維症のように、これらの炎症性反応を防ぐそのようなTGF-β-3,4-としてyの要因。 以前Boyum 6から適合技術を使用して5に記載のように、健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞を、Ficoll密度勾配遠心分離によって単離した。培養中のマクロファージは、初代培養7の6日後、M1またはM2表現型に分化させることができる。 タンパク質発現またはそのような宿主または病原微生物毒素などの様々な制御された刺激の下でマクロファージ2つのサブタイプ間のタンパク質の変化の分析は、プロ - および抗炎症性マクロファージの機能を解読するために役立つであろう。 プロテオミクスは、具体的に上方または様々な刺激の下でヒト培養マクロファージにおけるダウンレギュレートされたタンパク質の直接監視のためのユニークなツールです。蛍光色素は、低感度画像解析8 &lt;ように、2Dゲル電気泳動の制限のいくつかを解決した<html> / SUP&gt;。システイン残基と反応染料は、リジン残基9との反応に比べ、検出感度が増加している。以前の研究では、古典的な銀染色した2D電気泳動11に比べて少ない試料10の分析のためのDIGE飽和標識化の有用性を実証した。この技術は、急速にマクロファージの2サブタイプ間または同じサブタイプからの未処理および処理マクロファージ間のタンパク質修飾を分析するのに役立ちます。 このプロテオミクス手法の利点は、2Dゲル12を分析することによって、タンパク質のサイズおよび翻訳後修飾の情報へのアクセスを行っている。これは分析することができるサンプルの数を制限し、高スループット技術ではないことを考慮すべきである。最近13日のように、質量分析に基づくハイスループットアッセイの開発は、これを改善することができる。 _contentは &quot;&gt;ここでは、等電点電気泳動、電気泳動の過程を経て培養されたマクロファージのタンパク質抽出から2D DIGE解析を実行する方法を提示し、SDS-PAGE、ならびに適切な2Dソフトウェアの有用性に関する情報。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="472">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:208px;"><a name="RANGE!A1:C43">Name</a></td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RPMI 1640</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31870-074</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PBX 10 X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-083</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-glutamine-200mM-100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">gentamycin 10 mg/mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15710-049</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">human serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ficoll d=1,077</td>
			<td>ATGC</td>
			<td>L6115</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Leucosep</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>16760</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#160;6-wells plate PRIMARIA&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353846</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IL-4</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>B-61410</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2654</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Giemsa</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>48900</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">EDTA MM372,2</td>
			<td>Research Organics&#160;</td>
			<td>3.00E+01</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter 0,22&#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPTORE</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100 mL cylinder</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430182</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TCEP</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>UP242214</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bradford reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cy3+Cy5-reactive dye</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-8009-83</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IPG strip 3-10 24cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-6002-44</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protean IEF cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-4000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Low-melting agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ettan-Daltsix system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6485-08</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ettan DIGE Imager scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Progenesis Samespot</td>
			<td>Non linear dynamics</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">50 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">15 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CHAPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5070</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ur&#233;e</td>
			<td>Merk</td>
			<td>108484-500</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Thiour&#233;e</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7875</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DTT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610611</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">APS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tris HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pharmalytes 3-10</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0456-01</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3773</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114391</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acrylamide 40%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0148</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2D clean Up</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>80-6454-51</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dim&#233;thylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22705-6</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">electrode wicks</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-4071</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proteomic profiling of macrophages by 2d electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

適切な差動プロテオーム解析を実行するために、分析される試料の処理は、検証されるべきである。 示した例では、マクロファージの細胞培養物の品質は、以前に公開された5として形態学的および分子の側面に必要とされる。マクロファージ培養物の均質性への単球の分化は、位相顕微鏡検査を行った。 図1は、M1とM2マクロファージの一次培養物の...

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Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

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