Name: generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly
Uploaded: 2015-02-09T14:00:00
Duration: 10 min 18 s
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हम उदारता से उपलब्ध कराने pcDNA 3.1 MYC-उनका (ए) और hEF1α प्रमोटर युक्त plasmids के लिए, टेक्सास टेक विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र, Lubbock, टेक्सास और Mladen Yovchev पिट्सबर्ग मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में, पिट्सबर्ग में पीए माइकेला Jansen शुक्रिया अदा करना चाहूँगा । इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या (सीसीएम) के R01HD037109 के तहत बाल स्वास्थ्य और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के मानव विकास की Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। अतिरिक्त सहायता महिलाओं के स्वास्थ्य के लिए (सीसीएम और PNG के लिए) लौरा बुश संस्थान से था। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

<ol>
	<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature methods. 7, 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+to+haemopoietic+stem+cells+by+recombinant+retroviruses.">Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses.</a> Molecular biology &amp; medicine. 4, 229-250 (1987).</li><li>Challita, P. M., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+from+a+retroviral+vector+after+transduction+of+murine+hematopoietic+stem+cells+is+associated+with+methylation+in+vivo.">Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).</li><li>Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+incorporating+the+immunoglobulin+heavy+chain+enhancer+and+matrix+attachment+regions+provide+position-independent+expression+in+B+lymphocytes.">Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes.</a> Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).</li><li>Meilinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Np95+interacts+with+de+novo+DNA+methyltransferases,+Dnmt3a+and+Dnmt3b,+and+mediates+epigenetic+silencing+of+the+viral+CMV+promoter+in+embryonic+stem+cells.">Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells.</a> EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).</li><li>Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-level+stable+transgene+expressing+human+embryonic+stem+cell+lines+using+Chinese+hamster+elongation+factor-1+alpha+promoter+system.">Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system.</a> Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).</li><li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+different+promoter+systems+for+efficient+transgene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem cells. 20, 139-145 (2002).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PloS one. 5, e10611 (2010).</li><li>Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+human+elongation+factor+1alpha+genes:+EEF1A+maps+to+chromosome+6q14+and+EEF1A2+to+20q13.3.">Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3.</a> Genomics. 36, 359-361 (1996).</li><li>Wallace, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+forms+of+the+64,000+Mr+protein+of+the+cleavage+stimulation+factor+are+expressed+in+mouse+male+germ+cells.">Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).</li><li>MacDonald, C. C., McMahon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mechanisms+of+alternative+polyadenylation:+testis,+brain,+and+beyond.+Wiley+interdisciplinary+reviews.">Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+the+CPSF73+endonuclease+and+other+polyadenylation+factors+associates+with+U7+snRNP+and+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+for+3'-end+processing.">A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing.</a> Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).</li><li>Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Sequencing+of+RNA+Isolated+by+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(HITS-CLIP)+to+Determine+Sites+of+Binding+of+CstF-64+on+Nascent+RNAs.">High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs.</a> Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).</li><li>Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CstF-64+supports+pluripotency+and+regulates+cell+cycle+progression+in+embryonic+stem+cells+through+histone+3'+end+processing.">CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing.</a> Nucleic acids research. , (2014).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS one. 3, e3647 (2008).</li><li>Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bacterial+cell+controlled+by+a+chemically+synthesized+genome.">Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome.</a> Science. 329, 52-56 (2010).</li></ol>

Open Access publication and production fees were supplied by New England BioLabs Inc.

जीए क्लोनिंग के सफल प्रयोग हमेशा पूरा निर्माण (चित्रा 2 और चित्रा 3) के एक सावधान डिजाइन से पहले किया जाना चाहिए। प्राइमर पीढ़ी के उपकरण द्वारा डिजाइन प्राइमर दृश्यों की सावधानी से सत्यापन भी अत्यधिक की सिफारिश की है। जीए के लिए प्राइमर प्राइमर पीढ़ी के उपकरण के उपयोग के बिना उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, उपकरण के उपयोग यह प्रक्रिया सरल है क्योंकि अत्यधिक की सिफारिश है। आम तौर पर, जीए क्लोनिंग के लिए प्राइमर दो कार्यात्मक विभिन्न दृश्यों के लिए होना चाहिए। पहले अनुक्रम डीएनए टुकड़ा-विशिष्ट है, और पीसीआर का उपयोग टुकड़ा का प्रवर्धन की अनुमति देता है। दूसरी अनुक्रम जीए विधानसभा के लिए आवश्यक है जो आसन्न टुकड़ा, साथ ओवरलैप। एक ठेठ डीएनए टुकड़ा-विशिष्ट अनुक्रम लंबाई में 18-22 NT होगा। एक ही डीएनए बढ़ाना इस्तेमाल डीएनए टुकड़ा विशिष्ट दृश्यों इसी तरह पिघलने तापमान और जीसी सामग्री होनी चाहिए। ओवरलैपिंग अनुक्रम होना चाहिए 15 के कम से कमNT कम से कम 48 डिग्री सेल्सियस के तापमान के पिघलने के साथ लंबाई में। अधिक से अधिक 4 डीएनए टुकड़े की विधानसभा में कम से कम 20 NT होने के लिए अतिव्यापी अनुक्रम की आवश्यकता होगी। लंबे समय तक overlaps के अधिक ठीक से इकट्ठे डीएनए टुकड़े में जिसके परिणामस्वरूप annealing की वृद्धि की विशिष्टता की अनुमति देगा। यह विषम दृश्यों उचित डीएनए विधानसभा समझौता हो सकता है, क्योंकि उनके जीसी में या अतिव्यापी दृश्यों को विकसित करने में सामग्री पर टेढ़ी कर रहे हैं कि दृश्यों से बचने के लिए सिफारिश की है। हम भी किसी भी दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया कालोनियों, एक जीए प्रतिक्रिया में वेक्टर रीढ़ की हड्डी के लिए इसी सिर्फ डीएनए टुकड़ा का उत्पादन नहीं किया जाना चाहिए जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने का सुझाव। वैकल्पिक रूप से, &quot;आवेषण&quot; जिसमें डीएनए टुकड़े में से एक भी कोई दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया कालोनियों में परिणाम चाहिए जो जीए प्रतिक्रिया से हटाया जा सकता है। एक compl की विधानसभा में प्रस्तुत करना होगा जो कोई कालोनियों आसन्न डीएनए टुकड़े की ओवरलैपिंग सिरों की कमी हो जाएगा विकसित होगा कारण,ETE प्लाज्मिड। प्रोटोकॉल में वर्णित में, क्योंकि इस्तेमाल किया डीएनए टुकड़े की संख्या (चित्रा 3) की, NT प्राइमर सेट का इस्तेमाल किया गया उत्पन्न करने के लिए 25 के दृश्यों अतिव्यापी। 6 डीएनए टुकड़े - प्राइमर पीढ़ी के उपकरण वेबसाइट की सिफारिश 4 इकट्ठा करने के लिए कम से कम 20 NT अतिव्यापी दृश्यों का उपयोग करने के लिए है (उपकरण की तालिका देखें)। इसके अलावा, अब डीएनए किस्में के उचित complementation सुनिश्चित करेंगे अनुक्रम ओवरलैपिंग सही रूप में इकट्ठे उत्पादों की संख्या बढ़ रही है (चित्रा 1 देखें)। वर्तमान में, निर्बाध क्लोनिंग के लिए कई सिस्टम उपलब्ध हैं। हालांकि, इन पद्धतियों में से कुछ अभी भी (यानी, गोल्डन गेट 18 क्लोनिंग) प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करें। दूसरों को एक ही जैविक स्रोत 19 से चेचक वायरस डीएनए पोलीमरेज़ और एकल कतरा डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के आधार पर एंजाइमों के मालिकाना मिश्रणों का उपयोग करें। दोनों प्रणालियों शोर से जीए की तुलना में सीमित कर रहे हैंदृश्यों ओवरलैपिंग के आतंकवाद की लंबाई। छोटे अतिव्यापी दृश्यों समस्याग्रस्त 23 से अधिक डीएनए टुकड़े के समुचित विधानसभा प्रतिपादन आसन्न डीएनए टुकड़े की annealing कदम है, के लिए पर्याप्त विशिष्टता प्रदान नहीं हो सकता है। इन कमियों को जीए प्रणाली में मौजूद नहीं हैं। (लंबाई में यानी, कम से कम 8 KBP) पीसीआर द्वारा मज़बूती amplifiable आकार से अधिक नहीं इतनी के रूप में परिलक्षित हो डीएनए टुकड़े का आकार भी विचार किया जाना चाहिए। यहां तक ​​कि पिछले 10 साल में डीएनए पीसीआर के समारोह में सुधार के साथ, बड़े डीएनए टुकड़े कम क्षमता और सटीकता के साथ परिलक्षित होगा। यदि आवश्यक हो, बड़ा डीएनए टुकड़े प्लाज्मिड अलगाव और प्रतिबंध एंजाइमों के साथ उचित डीएनए पाचन द्वारा, जैसे पीसीआर के लिए वैकल्पिक अन्य स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है। विशेष रूप से, वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, हमारे पीसीआर उपयोग करने के लिए तर्कसंगत से सभी कम थे जो उपलब्ध डीएनए टुकड़े के आकार के आधार पर किया गया था5 KBP। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा की पहचान की एक से अधिक पीसीआर उत्पाद है, तो वांछनीय टुकड़ा आकार की जेल शुद्धि उपलब्ध आणविक जीव विज्ञान तकनीक या उचित किट के किसी भी उपयोग की सिफारिश की है। वर्तमान प्रोटोकॉल में एक थर्मास्टाइबल डीएनए पोलीमरेज़ (सामग्री की तालिका देखें) किया जाता है। हालांकि उच्च निष्ठा और उपज प्रदान करने के लिए किसी भी डीएनए पोलीमरेज़ इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा। प्रोटोकॉल में वर्णित की तुलना में अलग उच्च निष्ठा डीएनए पीसीआर उपलब्ध हैं, तो संबंधित पुस्तिकाओं में वर्णित के रूप में, की स्थापना की शर्तों का उपयोग करें। वर्तमान प्रोटोकॉल में, रासायनिक सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं जीए किट के साथ आपूर्ति की जाती है कि इस्तेमाल किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, रासायनिक या विद्युत सक्षम ई ऐसे DH5α या DH10B के रूप में कोलाई उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 2x मास्टर मिश्रण क्लोनिंग विधानसभा न्यूनतम हाथों पर समय के साथ प्रयोग करने में आसान है। हालांकि, सटीक pipetting के पूर्वोत्तर क्योंकि छोटे संस्करणों के लिए जरूरी हैeded एक साथ मिलाया जा सके। गुड आणविक जीव विज्ञान तकनीक के रूप में अच्छी तरह से हर समय पर प्रयोग करने की आवश्यकता है। जीए क्लोनिंग अब आकार में तीन KBP से कर रहे हैं, जो डीएनए टुकड़े, प्लास्मिड और वैक्टर, के निर्माण के लिए असीमित संभावनाएं प्रदान करता है। यह उदाहरण के लिए, संश्लेषण और विधानसभा की अनुमति देता है, क्योंकि इसके अलावा यह एक पूरे जीवाणु (माइकोप्लाज्मा mycoides) जीनोम या एक खमीर (Saccharomyces cerevisiae) गुणसूत्र 20,21, सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक व्यापक प्रभाव पड़ता है। पारंपरिक क्लोनिंग सहज निर्माणों को उत्पन्न करने की जरूरत के लिए तकनीक भी लागू है। अंत में, जीए क्लोनिंग पारंपरिक डीएनए क्लोनिंग की प्रक्रिया को तेजी से, विश्वसनीय और लचीला विकल्प प्रदान करता है।

परम्परागत डीएनए क्लोनिंग प्रक्रियाओं को एक साथ डीएनए टुकड़े शामिल होने के लिए डीएनए और डीएनए ligase फोड़ना करने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग पर भरोसा करते हैं। अलग डीएनए टुकड़े युक्त कस्टम अभिव्यक्ति निर्माणों की पीढ़ी के एक और / या एकाधिक प्रतिबंध endonucleases और बंधाव के माध्यम से डीएनए टुकड़े के बाद प्रविष्टि के साथ डीएनए की दरार भी शामिल है कि एक अनुक्रमिक प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया की बड़ी खामी असंभव ब्याज की पूर्ण लंबाई प्रोटीन के सफल डीएनए क्लोनिंग प्रतिपादन (यानी, कई दरार साइटों हो सकता है) डीएनए टुकड़े में से एक के लिए उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइमों की पहचान करना मुश्किल हो सकता है। इसलिए, कस्टम अभिव्यक्ति की पीढ़ी अनुकूलित प्रोटीन-टैग के साथ कुशल सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों की ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के तहत constructs बहुत सावधान डिजाइन की आवश्यकता है। यह भी एक समय और श्रम लेने वाली तकनीक है। हाल ही में, कई रिपोर्टों multip को इकट्ठा करने के तरीके में वर्णितप्रतिबंध के उपयोग के बिना एक या दो कदम प्रतिक्रियाओं दोनों में एक ही समय में एक सतत अनुक्रम में Le अलग सिंथेटिक डीएनए टुकड़े 1-3 एंजाइमों। एक कदम क्लोनिंग प्रतिक्रिया (सभी तैयारी के चरण को छोड़कर), डीएनए exonuclease, डीएनए पोलीमरेज़, डीएनए ligase 2,3 और डीएनए टुकड़े के अतिव्यापी समाप्त होता है (चित्रा 1) का एक मिश्रण के उपयोग पर निर्भर करता है। प्रतिबंध एंजाइमों का कोई फायदा नहीं है, किसी भी आकार और (अत्यधिक दोहराए दृश्यों को छोड़कर) अनुक्रम रचना की डीएनए टुकड़े एक सहज निर्माण में आपस में जुड़े हुए किया जा सकता है। हाल ही में, एक वाणिज्यिक किट (गिब्सन विधानसभा; GA) के एक कदम क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के लिए उपलब्ध हो गया। इस किट अनुकूलित प्रमोटरों और प्रोटीन टैग के साथ एक एकल वेक्टर में किसी भी डीएनए टुकड़े के तेजी से और लागत प्रभावी विधानसभा की अनुमति देता है। स्तनधारी सेल संस्कृति मॉडल में बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल व्यापक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर ट्रांसक्रिप्शनल reg के तहत अक्सर होते हैंवायरल cytomegalovirus (सीएमवी) या बंदर का वायरस 40 (SV40) प्रमोटरों की आबादी। ये वायरल प्रमोटरों स्तनधारी सेल संस्कृति आधारित मॉडल के बहुमत में बहिर्जात प्रोटीन की मजबूत क्षणिक अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं। हालांकि, stably बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त सेल लाइनों की पीढ़ी क्योंकि स्थापना प्रक्रिया 4,5 दौरान सीएमवी या SV40 प्रमोटरों की ट्रांसक्रिप्शनल मुंह बंद करने के अक्सर असफल है। इसके अलावा, SV40 और सीएमवी वायरल प्रमोटरों पर्याप्त ल्य्म्फोइड वंश या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 6,7 से कोशिकाओं में बहिर्जात प्रोटीन की अभिव्यक्ति का प्रचार नहीं करेंगे। वायरल प्रमोटरों के निहित सीमा का हल मजबूत विधान गैर वायरल प्रमोटरों 8-10 उपयोग करने के लिए है। मानव मूल के एक अच्छी तरह से विशेषता मजबूत विधान गैर वायरल प्रवर्तक (hEF1α राइबोसोम से 11 अमीनोएसिल-टीआरएनए की जीटीपी निर्भर एसोसिएशन के कटैलिसीस में शामिल है) बढ़ाव कारक 1α (hEF1α) प्रमोटर है। हालांकि,hEF1α प्रमोटर युक्त अभिव्यक्ति वैक्टर विशेष रूप से लोगों को भी ब्याज की प्रोटीन के अमीनो टर्मिनल अंत में 3 × झंडा युक्त, प्लास्मिड युक्त वायरल-प्रमोटर के रूप में के रूप में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। 64,000 मेगावाट दरार उत्तेजना कारक प्रोटीन (CstF-64) प्रतिकृति निर्भर हिस्टोन mRNAs 14,15 सहित सबसे mRNAs 12,13, के 3 &#39;अंत प्रसंस्करण में शामिल है। CstF-64 सब दैहिक ऊतकों 12 में व्यक्त किया है। अपने आरएनए मान्यता आकृति दरार और polyadenylation साइट 16 के बहाव के नवजात टेप पर गुजरात युक्त आरएनए दृश्यों को बांधता है। CstF-64 पूर्व mRNA के लिए के बंधन इस नवजात प्रतिलेख के कुशल endonucleolytic दरार को बढ़ावा देता है। इधर, एक प्रोटोकॉल डीएनए टुकड़े की पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग करता है वर्णन किया गया है, (रासायनिक सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं शामिल है) एक गिब्सन विधानसभा क्लोनिंग किट 3xFLAG टैग मीटर की कस्टम वैक्टर का उत्पादन करने के लिएouse CstF-64 या उत्परिवर्ती CstF-64 hEF1α प्रमोटर एक की अभिव्यक्ति के तहत अपने अमीनो टर्मिनल अंत करने के लिए।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

गिब्सन विधानसभा (जीए) क्लोनिंग पारंपरिक डीएनए क्लोनिंग तरीकों के लिए एक तेजी से, विश्वसनीय, और लचीला विकल्प प्रदान करता है। हम माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बहिर्जात जीन (mESCs) की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित प्लास्मिड बनाने के लिए जीए इस्तेमाल किया। SV40 या मानव cytomegalovirus के प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत बहिर्जात जीनों की अभिव्यक्ति mESCs में अभिकर्मक के बाद जल्दी से कम हो। इस कम अभिव्यक्ति के लिए एक उपाय जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए मानव बढ़ाव कारक-एक अल्फा (hEF1α) प्रमोटर उपयोग करने के लिए है। HEF1α युक्त प्लाज्मिड वैक्टर SV40- या सीएमवी युक्त प्लास्मिड, खासकर उन लोगों के भी युक्त एन टर्मिनल 3xFLAG-टैग के रूप में के रूप में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल hEF1α प्रमोटर के expressional विनियमन के तहत झंडा टैग CstF-64 और CstF-64 उत्परिवर्ती व्यक्त प्लास्मिड बनाने के लिए एक तेजी से विधि है। जीए संभव डीएनए टुकड़े के सिरों ओवरलैपिंग की क्लोनिंग बनाने के लिए डीएनए exonuclease, डीएनए पोलीमरेज़ और डीएनए ligase का एक मिश्रण का उपयोग करता है।हम उपलब्ध था टेम्पलेट DNAs के आधार पर, हम अपने निर्माणों एक भी दृश्य में इकट्ठा किया जा करने के लिए बनाया गया है। हमारे डिजाइन चार डीएनए टुकड़े का इस्तेमाल किया: pcDNA 3.1 वेक्टर रीढ़ की हड्डी, hEF1α प्रमोटर भाग 1 (एक डबल असहाय सिंथेटिक डीएनए टुकड़ा के रूप में खरीदा 3xFLAG टैग निहित है), और या तो CstF-64 या विशिष्ट CstF-64 उत्परिवर्ती hEF1α प्रमोटर भाग 2। इन टुकड़ों के दृश्यों डीएनए टुकड़े पैदा करने के लिए उपयुक्त पीसीआर प्राइमरों डिजाइन करने के लिए एक किताब पीढ़ी के उपकरण पर अपलोड किया गया। पीसीआर के बाद, डीएनए टुकड़े चयनात्मक मार्कर और जीए क्लोनिंग प्रतिक्रिया युक्त वेक्टर इकट्ठा किया गया था के साथ मिलाया गया। व्यक्तिगत तब्दील बैक्टीरियल कालोनियों से प्लास्मिड अलग थे। Plasmids के प्रारंभिक स्क्रीन अनुक्रमण द्वारा पीछा किया, प्रतिबंध पाचन द्वारा किया गया था। अंत में, जीए हमें स्क्रीन और सत्यापन का निर्माण सहित 5 दिनों में जीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित प्लास्मिड बनाने के लिए अनुमति दी।

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Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

प्लास्मिड वैक्टर की पीढ़ी गिब्सन विधानसभा का उपयोग मानव बढ़ाव फैक्टर-1α प्रमोटर के विनियमन के तहत झंडा टैग प्रोटीन व्यक्त

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

प्लास्मिड डीएनए के ई. कोलाई में परिवर्तन हीट शॉक विधि का प्रयोग

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

प्राथमिक संस्कृति और Corti के murine अंग के प्लाज्मिड electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

मानव परिधीय रक्त से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का प्रयोग STEMCCA lentiviral वेक्टर पीढ़ी

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

थ्रोम्बिन इलाज में आरएनए - seq Transcriptomes का विश्लेषण और नियंत्रण मानव फेफड़े Microvascular endothelial कोशिकाओं

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

तरीके वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग और murine Bcrp1 की Transcriptional नियमन डिस्कवर के लिए

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

PgR ब्लू प्लाज्मिड और गोल्डन गेट विधानसभा का उपयोग Terminators का तेजी से सत्यापन

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

कैप्रेशेसी: प्लिमिड रिकवरी एंड प्रतिबंध एन्जाइम साइट इनर्सरेशन द्वारा कल्पना विधानसभा

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

पौध प्रवर्तक विश्लेषण: आम बीन में मूल पिंडी विशिष्ट प्रवर्तक की पहचान और लक्षण वर्णन

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

सह immunoprecipitation परख कोशिकाओं से अंतर्जात परमाणु प्रोटीन का उपयोग Hypoxic शर्तों के तहत संस्कृति

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...