Name: measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. Vækst af gærceller <ol><li> Vælg de relevante gærstammer, der skal udnyttes til mRNA henfaldshastighed målinger. At inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II, bruge gærstammer huser rpb1-1 mutation 1. Opnå dette gærstamme fra et laboratorium, der allerede har en, eller generere den i laboratoriet ved hjælp af standard teknikker, hvis en bestemt genetisk baggrund er påkrævet 9. </li><li> Anvendelse af steril teknik forberede gær med...

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors.">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li><li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li><li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast.">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li><li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMD:+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination.">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li><li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Polymerase+II+subunit+composition,+stoichiometry+and+phosphorylation.">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).</li><li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

Hæmning af mRNA-syntese og overvågning mRNA omsætning i mangel af nye syntese er en metode, der ofte bruges til at måle mRNA henfald satser. I S. cerevisiae, måling af mRNA henfald ved at inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er en af de hyppigst anvendte metoder. Denne metode specifikt inhiberer RNA-polymerase II. De mest kritiske trin til bestemmelse af mRNA henfald ved hjælp af denne teknik er: 1) inden høst gærcellerne sikre, at transskription er blevet ...

Transkription og henfald af specifikke mRNA er afgørende determinanter for genekspression. Satsen for syntese og nedbrydning af specifikke mRNA&#39;er bestemmer steady-state niveau af denne særlige mRNA. Steady state niveauer af mRNA&#39;er regulerer overflod af mRNA&#39;er og bestemme hvor meget af hver mRNA er tilgængelig for proteinsyntese. Målinger af mRNA halveringstider anvendes i udstrakt grad til at bestemme henfaldshastigheden af ​​mRNA&#39;er. Specifikke mRNA&#39;er henfald ved forskellige hastigheder, der er relateret til funktioner af mRNA, funktionen af ​​proteinet kodet af mRNA&#39;en og miljøforhold. Afhængig af teknikken anvendes til at bestemme mRNA henfaldskurverne kan henfaldshastighed målinger bestemmes enten globalt eller for individuelle udskrifter. I gæren S. cerevisiae, de teknikker, der mest almindeligt anvendes til at måle den globale mRNA henfaldskurverne omfatter anvendelse af en gær stamme, der huser den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II og kemisk transcriptional hæmmere såsom thiolutin og 1,10-phenanthrolin 1-5. Disse metoder kan også anvendes til at måle individuelle mRNA henfaldskurverne 4. Andre fremgangsmåder kan også anvendes til at måle mRNA henfaldskurverne. Disse metoder omfatter tilgang til steady state mærkning eller anvendelse af mRNA-molekyler, der er udtrykt fra en reguleret promotor, som kun udtrykkes i udvalgte forhold. Hver af disse teknikker har visse fordele og begrænsninger. Den her beskrevne teknik anvender den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne metode bruger S. cerevisiae som den model, kan men blevet ændret og anvendt i andre systemer ved hjælp af specifikke transkriptionelle hæmning teknikker 6. mRNA halveringstid målinger ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er flittigt brugt til både genom-dækkende og individuelle målinger af mRNA forfald 4-5. Denne teknik kræver anvendelse af et specific gær stamme, der huser et temperaturfølsomt allel af RNA-polymerase II, rpb1-1 1. Begrundelsen for denne teknik er, at eksponeringen af ​​det temperaturfølsomme gærstamme til den ikke-permissive temperatur inhiberer mRNA-syntese. Efterfølgende henfald af forudeksisterende mRNA overvåges på forskellige tidspunkter efter transkription er blevet hæmmet. Forsvinden af ​​forudeksisterende mRNA overvåges ved ekstraktion af RNA fra gærcellerne ved forskellige tidspunkter efter transkription er blevet slukket. De tidspunkter, hvor gærcellerne høstes er forudbestemt af et pilotforsøg, og afhænger af udskrifter og system, der undersøges. Hurtigere tidspunkter bruges til kortvarige udskrifter, mens længere tidspunkter bruges til længere levede udskrifter. Bagefter henfald af mRNA overvåges af enten Northern blot-analyse, kvantitativ PCR eller RNAseq. Måling af mRNA halveringstider ved hjælp af en temperature følsomme allel af RNA-polymerase II har sine fordele. Først denne teknik er nem og ligetil. For det andet, når gærstammen erhverves eller frembringes i laboratoriet mRNA halveringstid målinger kan bestemmes i forskellige vækstbetingelser; muliggør bestemmelse af miljømæssig indflydelse på mRNA forfald. For det tredje kan mRNA henfaldskurverne overvåges genom-dækkende. Anvendelse af andre transskription hæmning teknikker har også fordele og begrænsninger. For eksempel er brugen af ​​en inducerbar promotor kræver subkloning at generere et mRNA, der er under kontrol af den regulerede promotor. Thiolutin er ikke umiddelbart tilgængelig, og er dyrt, når de foreligger. Desuden er thiolutin virkningsmekanisme ikke fuldstændigt forstået, og det er blevet rapporteret at påvirke andre cellulære processer, herunder inhibering mRNA henfald 7. Alternativt 1,10-phenanthrolin, er mere let tilgængelige. Desuden er alle de teknikker, der anvendes til at inhibere transkription kan PertUrb cellulær funktion og kan påvirke forskellige mRNA&#39;er i forskellige måder. En investigator har brug for at bestemme den mest hensigtsmæssige metode til at bruge i deres eksperimentelle betingelser for at opnå de mest pålidelige resultater. At afgøre, hvilken metode der er mest egnet til deres ansøgning, en forsker har brug for at identificere de udskrifter og funktion af proteiner kodet af udskrifter, der undersøges. De mest pålidelige mRNA henfaldshastighed målinger er dem, der bestemmes ved hjælp af flere teknikker og viser samme henfaldshastighed. Ingen enkelt teknik er altid bedst, og den mest hensigtsmæssige teknik afhænger af den specifikke situation. Talrige undersøgelser i S. cerevisiae har målt mRNA henfald satser under forskellige forhold og genetiske baggrunde. De betingelser, mRNA henfaldet er målt i afhænger af den specifikke eksperiment, der undersøges. Måling mRNA henfald satser i forskellige cellulære miljøer, om forudsætningerne erundersøgte fortrinsvis påvirke henfaldet specifikke mRNA&#39;er. Henfaldet af mRNA&#39;er kan også variere afhængigt af gærstammen, der anvendes. For eksempel kan mRNA henfaldskurverne bestemmes i vildtype-gærceller og gærceller med et nonfunktionelt nonsens-medieret mRNA nedbrydning (NMD) pathway. Dette mRNA nedbrydningsvej findes i alle eukaryote organismer, der hidtil er blevet undersøgt, og det udløser nedbrydning af mRNA, der tidligt afslutter translation 8. NMD blev oprindeligt identificeret som en vej, der nedbryder mRNA med præmature termineringskodoner eller nonsens-kodoner, men er nu anerkendt som en vej, der også regulerer ekspressionen af ​​ikke-nonsense med naturlige mRNA&#39;er. mRNA&#39;er, der er mål for forløbet hurtigt nedbrydes i gærceller med en funktionel NMD vej og stabiliseret i gærceller med en nonfunctional NMD vej. Således halveringstider på mRNA, der er direkte mål for denne vej er kortere i vildtype gær cells sammenlignet med gærceller med et nonfunktionelt NMD pathway.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA steady state-niveauerne varierer afhængigt af miljømæssige forhold. Regulering af steady state akkumulerende niveauer af et mRNA sikrer, at den korrekte mængde af protein syntetiseret til cellens specifikke vækstbetingelser. En metode til måling af mRNA henfaldskurverne er hæmmende transkription og efterfølgende overvåge forsvinden allerede er til stede mRNA. Hastigheden af ​​mRNA henfald kan derefter kvantificeres, og en nøjagtig halveringstid kan bestemmes udnytte adskillige teknikker. I S. cerevisiae, protokoller, der måler mRNA halveringstider er blevet udviklet og indbefatter inhibering transkription af mRNA under anvendelse af stammer, der huser en temperaturfølsom allel af RNA-polymerase II, rpb1-1. Andre teknikker til måling af mRNA halveringstider omfatter hæmning transskription med transkriptionelle inhibitorer som thiolutin eller 1,10-phenanthrolin, eller alternativt ved at udnytte mRNA&#39;er, der er under kontrol af en regulerbar promotorsåsom galactose inducerbare promotor og tet-off system. Her beskriver vi måling af S. cerevisiae mRNA henfaldskurverne hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne teknik kan bruges til at måle mRNA henfaldskurverne enkelte mRNA&#39;er eller hele genomet.

<html> Evnen af ​​denne protokol til nøjagtigt at måle mRNA henfaldskurverne afhænger hæmning af transskription, høst af gærceller på passende tidspunkter, og udnyttelse af RNase gratis teknikker, mens udvinding RNA og Northern blotting. Sondering for to kontrol mRNA kendt for at være ustabil og stabil, henholdsvis giver tillid til, at forsøget virkede. For eksempel kan dette opnås ved at probe med en probe, der detekterer både CYH2 præ-mRNA og mRNA. Figur 2B viser forsvinden af ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Måling af mRNA henfaldskurver i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Brug<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Stammer

Steady state-niveau af specifikke mRNA&#39;er er bestemt af hastigheden af ​​syntese og nedbrydning af mRNA. Genom-dækkende mRNA nedbrydning satser eller henfaldet specifikke mRNA&#39;er kan måles ved at bestemme mRNA halveringstider. Denne protokol fokuserer på måling af mRNA henfald satser i Saccharomyces cerevisiae.

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Koblede Analyser for Monitoring Proteingenfoldningstrin i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPJ Overvåget Redox Titrering af cofaktorerne af<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Hurtig identifikation af kemiske genetisk samspil i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Instrueret Evolution Method i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotek Creation og Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Cycloheximid Chase Analyse af proteinnedbrydning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...