Name: measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

De auteurs willen graag Jeffrey Farrell, James Gagnon, en Jennifer Bergmann bedanken voor commentaar op het manuscript. KWR werd gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program tijdens de ontwikkeling van de FDAP test. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH aan AFS en door subsidies van de Duitse Stichting voor Onderzoek (Emmy Noether Program), het Max Planck Instituut en het Human Frontier Science Program (Career Development Award) naar PM.

1. Het genereren van een photoconvertible Fusion Construct en het injecteren van dechorionated zebravis embryo&#39;s <ol><li> Genereer een functionele construct dat het eiwit van interesse gefuseerd aan een groen naar rood photoconvertible eiwit (zie bespreking), vervolgens in vitro transcriptie capped mRNA genereren coderend voor het fusie-eiwit volgens Muller et al., 2012 19. </li><li> Gebruik pronase de chorions ongeveer 30 zebravis embryo verwijderen aan het ene-cellig...

Het succes van een FDAP proef berust op het genereren van een functioneel photoconvertible fusieproteïne. Tagging een eiwit kan zijn biologische activiteit en / of biofysische eigenschappen, zoals de lokalisatie, oplosbaarheid en stabiliteit 36-41 beïnvloeden. Wees bereid om de activiteit van verschillende fusieconstructen testen om een ​​die actief is te vinden. Wij hebben gevonden dat de positie van de photoconvertible eiwit ten opzichte van het eiwit van interesse of met meer linkers (bijvoorbeel...

De niveaus van proteïnen in cellen en organismen worden bepaald door de productiesnelheden en klaring. Eiwit halfwaardetijden kan variëren van enkele minuten tot dagen 1-4. In veel biologische systemen, de stabilisatie of klaring van belangrijke eiwitten heeft belangrijke gevolgen voor de cellulaire activiteit. Modulatie van intracellulair eiwit stabiliteit vereist voor celcyclusprogressie 5,6, ontwikkelings signalering 7-9, apoptose 10 en normale functie en onderhoud van neuronen 11,12. Extracellulaire proteïne stabiliteit beïnvloedt de verdeling en de beschikbaarheid van uitgescheiden eiwitten zoals morfogenen 13,14 binnen een weefsel. In de afgelopen decennia heeft eiwitstabiliteit vooral beoordeeld in celkweek met behulp van radioactieve pulse-labeling of cycloheximide chase experimenten 15. In dergelijke pulse-chase experimenten worden cellen hetzij tijdelijk blootgesteld aan een &quot;puls&quot; van radioactieve aminozuurvoorlopers die zijn opgenomen in nieuw gesynthetiseerde eiwitten of ze worden blootgesteld aan cycloheximide, die eiwitsynthese remt. Gekweekte cellen worden dan verzameld op verschillende tijdstippen, en hetzij immunoprecipitatie gevolgd door autoradiografie (radioactieve pulse-chase experimenten) of western blotting (in cycloheximide experimenten) wordt gebruikt om de klaring van eiwit kwantificeren tijd. Conventionele eiwitstabiliteit assays meerdere tekortkomingen. Eerst eiwitten in deze assays worden vaak niet uitgedrukt in hun endogene omgevingen, maar in weefselkweek en soms van verschillende species. Voor eiwitten waarvan de stabiliteit is contextafhankelijk deze benadering problematisch. Ten tweede is het niet mogelijk om eiwitten speling in individuele cellen of organismen te volgen in de tijd en de gegevens van deze testen geeft een gemiddelde van verschillende populaties van cellen op verschillende tijdstippen. Aangezien individuele cellen kan zijn begonnenmet verschillende hoeveelheden eiwit, mogen hebben de radioactieve merker of cycloheximide op verschillende tijdstippen, of kunnen verschillend klaringskinetiek, zoals geaggregeerde gegevens misleidend kunnen zijn. Tenslotte, bij cycloheximide chase experimenten toevoeging van de eiwitsyntheseremmer kan onbedoelde fysiologische effecten die kunstmatig eiwit stabiliteit 16-18 kunnen veranderen hebben. Deze gebreken kunnen worden vermeden door gebruik fluorescentievervaltijd Na Photoconversion (FDAP), een techniek die gebruik maakt photoconvertible eiwitten proteïne klaring dynamisch meten levende organismen 19-25 (zie bespreking beperkingen van de FDAP techniek). Photoconvertible eiwitten zijn fluorescerende eiwitten waarvan excitatie en emissie-eigenschappen veranderen na blootstelling aan specifieke golflengten van het licht 26. Een vaak gebruikte variant is Dendra2, een &quot;groen-to-rode&quot; photoconvertible eiwit dat in eerste instantie heeft excitatie en emissie eigenschappen vergelijkbaar groen fluorescerende eiwitten, maar na blootstelling aan UV licht- &quot;fotoconversie&quot; -haar excitatie- / emissie-eigenschappen worden vergelijkbaar met die van rode fluorescente proteïnen 23,27. Belangrijk is dat nieuwe eiwit geproduceerd na photoconversion niet hetzelfde excitatie / emissie-eigenschappen als de photoconverted eiwit, waardoor ontkoppeling van de productie en de klaring na photoconversion en observatie van slechts een pool van photoconverted eiwit. Tagging eiwitten van belang met photoconvertible eiwitten biedt dus een handige manier om de pulse-label eiwitten in intacte, optisch toegankelijke levende organismen. In FDAP assays (figuur 1A), is een eiwit van belang gelabeld met een photoconvertible eiwit en uitgedrukt in een levend organisme (Figuur 1B). Het fusie-eiwit wordt photoconverted en de daling photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd door fluorescence microscopie (figuur 1C). De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt model om de halfwaardetijd van het fusie-eiwit (figuur 1D) te bepalen. De FDAP assay beschreven is ontworpen om het extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten in zebravisembryo bepalen tijdens de vroege embryogenese 19. Echter, kan deze benadering worden aangepast aan elke transparante modelorganisme dat live beeldvorming tolereert, en kunnen worden gebruikt om de klaring van taggable intracellulair of extracellulair eiwit controleren. Variaties van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd in gekweekte cellen 20,23 en Drosophila 22 en muis 21 embryo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Eiwitstabiliteit invloed op vele aspecten van de biologie, en het meten van de klaringskinetiek van eiwitten kan belangrijke inzichten verschaffen in biologische systemen. In FDAP experimenten, kan de klaring van eiwitten in levende organismen worden gemeten. Een eiwit van belang wordt gelabeld met een photoconvertible fluorescent eiwit expressie in vivo en photoconverted, en de daling van de photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd. De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt klaringsmodel de halfwaardetijd van het eiwit te bepalen. Belangrijk is dat de klaringskinetiek eiwit populaties in verschillende compartimenten van het organisme worden afzonderlijk door toepassing compartimentele maskers onderzocht. Deze benadering is gebruikt om de intra- en extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten bepaalt gedurende ontwikkeling van de zebravis. We beschrijven hier een protocol voor FDAP experimenten in de zebravis embryo&#39;s. Het moet mogelijk zijn om FDAP om de kinetiek van de klaring bepalenelke taggable eiwit in elk optisch toegankelijke organisme.

FDAP is gebruikt om de halfwaardetijden van extracellulaire signaaleiwitten bepalen zebravisembryo 19. Een van deze eiwitten, Scheel, induceert expressie van genen gedurende embryogenese mesendodermal 34. Scheel-Dendra2 activeert expressie van mesendodermal genen op een niveau dat vergelijkbaar is met niet-gecodeerde Scheel, zoals aangetoond door qRT-PCR en in situ hybridisatie assays 19. Embryo&#39;s werden co-geïnjecteerd met Alexa488-dextran en mRNA coderend Scheel-Dendra2 e...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo&#39;s

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...