Name: measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Jeffrey Farrell, James Gagnon, og Jennifer Bergmann for kommentarer til manuskriptet. KWR ble støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under utviklingen av den FDAP analysen. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH til AFS og med tilskudd fra det tyske Research Foundation (Emmy Noether Program), Max Planck Society, og Human Frontier Science Program (Career Development Award) til PM.

1. Generere en Photoconvertible Fusion Konstruer og Injisering Dechorionated Sebrafisk embryo <ol><li> Generere en funksjonell konstruksjon inneholdende proteinet av interesse fusjonert til en grønn-til-rød photoconvertible protein (se Diskusjon), og deretter bruke in vitro transkripsjon for å generere avkortet mRNA som koder for fusjonsproteinet som i Muller et al., 2012 19. </li><li> Bruk pronase for å fjerne chorions fra ca 30 sebrafisk embryoer ved en-cellestadiet....

Suksessen til en FDAP eksperiment er avhengig av dannelsen av en funksjonell photoconvertible fusjonsprotein. Tagging et protein kan påvirke sin biologiske aktivitet og / eller biofysiske egenskaper, herunder dets lokalisering, oppløselighet, og stabilitet 36-41. Vær forberedt på å teste aktiviteten av flere ulike fusjonskonstruksjoner for å finne en som er aktiv. Vi har funnet at å endre posisjonen av photoconvertible protein i forhold til proteinet av interesse, eller ved å bruke lengre kopiere ...

Nivåene av proteiner i celler og organismer er bestemt av deres produksjonshastigheter og klaring. Protein halveringstider kan variere fra minutter til dager 1-4. I mange biologiske systemer, har stabilisering eller klarering av viktige proteiner viktige effekter på celleaktivitet. Modulering av intracellulær proteinstabilitet er nødvendig for cellesyklusprogresjon 5,6, utviklingssignale 7-9, apoptose 10, og normal funksjon og vedlikehold av neuroner 11,12. Ekstracellulært proteinstabilitet påvirker fordelingen og tilgjengeligheten av utskilte proteiner, som for eksempel morphogens 13,14, i en vev. I løpet av de siste tiårene, har protein stabilitet hovedsakelig blitt vurdert i cellekultur ved hjelp av radioaktiv puls-merking eller Cycloheximide jage eksperimenter 15. I slike puls-chase eksperimenter ble cellene enten forbigående utsettes for en &quot;puls&quot; av radioaktiv aminosyresyreforløpere som blir innlemmet i de nylig syntetiserte proteiner, eller de er utsatt for cykloheksimid, som inhiberer proteinsyntese. Dyrkede celler ble deretter oppsamlet ved forskjellige tidspunkter, og enten etterfulgt av immunoutfelling autoradiografi (i radioaktive puls-chase eksperimenter), eller Western blotting (i cykloheksimid forsøk) blir brukt til å kvantifisere klaring av protein over tid. Konvensjonelle analyser protein stabilitet har flere svakheter. Først blir proteiner i disse analyser ofte ikke uttrykt i deres endogene miljøer, men heller i vevskultur, og noen ganger i celler fra forskjellige arter. For proteiner hvis stabilitet er kontekstavhengig, er denne tilnærmingen problematisk. For det andre er det ikke mulig å følge proteinet klaring i de enkelte celler eller organismer over tid, og dataene fra disse analysene reflekterer et gjennomsnitt av forskjellige populasjoner av celler ved forskjellige tidspunkter. Siden individuelle celler kan ha startetmed forskjellige mengder protein, kan ha tatt opp radioaktivt etikett eller cykloheksimid til forskjellige tider, eller kan ha ulike klareringskinetikk, slike aggregerte data kan være misvisende. Endelig, i tilfellet med cykloheksimid chase eksperimenter, kan tilsetningen av proteinsynteseinhibitor ha uønskede fysiologiske effekter som kunstig kunne forandre proteinstabilitet 16-18. Disse mangler kan unngås ved å bruke fluorescens Råte Etter Photoconversion (FDAP), en teknikk som utnytter photoconvertible proteiner for å måle protein klaring dynamisk i levende organismer 19-25 (se diskusjon for begrensninger av FDAP teknikk). Photoconvertible proteiner er fluorescerende proteiner som eksitasjon og utslipps egenskaper endre seg etter eksponering for bestemte bølgelengder av lys 26. En vanlig brukt variant er Dendra2, en &quot;grønn-til-rød&quot; photoconvertible protein som i utgangspunktet har exsitering og utslipps egenskaper som ligner på grønne fluorescerende proteiner, men etter eksponering for UV lys-&quot;photoconversion&quot;-dens eksitasjon / emisjonsegenskapene blir lik de røde fluorescerende proteiner 23,27. Viktigere, vil nytt protein som produseres etter photoconversion ikke har de samme eksitasjon / emisjonsegenskaper som photoconverted protein, tillater frakobling av produksjon og klaring ved photoconversion og observasjon av bare en pool av photoconverted protein. Tagging proteiner av interesse med photoconvertible proteiner gir dermed en praktisk måte å pulsere-label proteiner i intakte, optisk tilgjengelige levende organismer. I FDAP analyser (Figur 1a), er et protein av interesse merket med en photoconvertible protein og uttrykkes i en levende organisme (figur 1B). Fusjonsproteinet photoconverted, og nedgangen i photoconverted signal over tid overvåkes av fluorescence mikroskopi (figur 1C). Dataene blir deretter utstyrt med en egnet modell for å bestemme halveringstiden til fusjonsproteinet (figur 1D). Den FDAP analysen beskrevet her er designet for å bestemme de ekstracellulære halveringstider på utskilles signalanlegg proteiner i sebrafisk embryo under tidlig embryogenese 19. Imidlertid kan denne tilnærmingen tilpasses enhver gjennomsiktig modell organisme som tåler direkte avbildning, og kan brukes til å overvåke clearance av noen taggable intracellulært eller ekstracellulært protein. Variasjoner av teknikken beskrevet her er utført i dyrkede celler 20,23 og Drosophila 22 og mus 21 embryoer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Protein stabiliteten påvirker mange aspekter av biologi, og måle klaring kinetikk av proteiner kan gi viktig innsikt i biologiske systemer. I FDAP eksperimenter, kan clearance av proteiner i levende organismer måles. Et protein av interesse er merket med en photoconvertible fluorescerende protein, uttrykt in vivo og photoconverted, og reduksjonen i photoconverted signal over tid blir overvåket. Dataene blir deretter utstyrt med en passende klaring modell for å bestemme protein halveringstid. Viktigere, kan klaringskinetikk protein populasjoner i ulike avdelinger av organismen undersøkes separat ved å bruke compartment masker. Denne fremgangsmåten har blitt brukt for å bestemme de intra- og ekstracellulære halveringstider på utskilte signaleringsproteiner under sebrafisk utvikling. Her beskriver vi en protokoll for FDAP eksperimenter i sebrafisk embryoer. Det bør være mulig å bruke FDAP å bestemme klareringskinetikkennoen taggable protein i noen optisk tilgjengelig organisme.

FDAP har blitt brukt til å bestemme halveringstider på ekstracellulære signalproteiner i sebrafisk embryo 19. En av disse proteinene, myse, induserer uttrykk for mesendodermal gener under embryogenese 34. Myse-Dendra2 aktiverer uttrykk for mesendodermal gener på nivåer tilsvarende ukodet myse, som demonstrert av QRT-PCR og in situ hybridiseringsanalyser 19. Embryoene ble ko-injisert med Alexa488-dekstran og mRNA som koder for myse-Dendra2 og underkastet FDAP analysen. En re...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Proteinnivåer i celler og vev er ofte strengt regulert av balansen av proteinproduksjon og klaring. Ved hjelp av fluorescens Decay Etter Photoconversion (FDAP), kan klaringskinetikk av proteiner bli eksperimentelt målt in vivo.

Måling Protein Stabilitet på Living Sebrafisk embryo med fluoresens Decay Etter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk Vessel Injury i sebrafisk embryo

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Ved hjelp av lys Sheet Fluorescensmikroskopi til bilde Sebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potensial i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Lys Sheet-basert Fluorescensmikroskopi of Living eller fikseres og farges<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryoet

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende Endocardial vev bevegelser via celle Photoconversion i sebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...