Name: measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Джеффри Фаррелл, Джеймс Ганьон, и Дженнифер Бергманн замечания по рукописи. KWR при поддержке Национального научного фонда аспирантуру Научно-исследовательского стипендий в процессе разработки анализа FDAP. Эта работа была поддержана грантами от NIH к AFS и за счет субсидий из Немецкого исследовательского фонда (Эмми Нётер Program), Общество Макса Планка, и программа в области пограничной науки (премии развития карьеры) до вечера.

1. Создание Photoconvertible слитой конструкции и инъекционных Dechorionated эмбрионов данио рерио <ol><li> Генерирование функциональную конструкцию, содержащую белок, представляющий интерес, слитого с зеленой к красным photoconvertible белка (см обсуждения), затем с помощью транскрипции в пробирк...

Успех эксперимента FDAP опирается на генерацию функциональной photoconvertible слитого белка. Пометка белок может повлиять на его биологическую активность и / или биофизические свойства, в том числе его локализации, растворимости, стабильности и 36-41. Будьте готовы проверить активность ра?...

Уровни белков в клетках и организмах определяется их темпов производства и оформления. Белковые полураспада может составлять от нескольких минут до нескольких дней 1-4. Во многих биологических системах, стабилизация или оформление ключевых белков имеет важные последствия для клеточной активности. Модуляция внутриклеточного стабильности белка требуется для прогрессии клеточного цикла 5,6, Сигнализация развития 7-9 апоптоза 10, и нормальной функции и содержание нейронов 11,12. Внеклеточный стабильность белков влияет на распределение и наличие секретируемых белков, таких как морфогенов 13,14, внутри ткани. За последние несколько десятилетий, стабильность белков в основном были оценены в культуре клеток с помощью радиоактивных пульс-мечение или циклогексимид эксперименты погони 15. В таких импульсов-чейз экспериментов клетки либо временно воздействию &quot;импульс&quot; радиоактивного аминопредшественники кислот, которые включены во вновь синтезированных белков, или они подвергаются циклогексимидом, который ингибирует синтез белка. Культивируемые клетки затем собирают в различные моменты времени, и либо иммунопреципитации с последующим авторадиографии (в экспериментах радиоактивных импульса-чейз) или Вестерн-блоттинга (в циклогексимид экспериментов) используется для количественной оценки зазор белка с течением времени. Обычные анализы стабильности белка имеют ряд недостатков. Во-первых, белки в этих анализах часто не выраженные в их эндогенных среде, а в культуре ткани, а иногда и в клетках из различных видов. Для белков, стабильность зависит от контекста, этот подход является проблематичным. Во-вторых, это не возможно, чтобы следовать зазор белка в отдельных клеток или организмов с течением времени, и данные из этих тестов отражает среднее число различных популяций клеток в различные моменты времени. Так как отдельные клетки, возможно, началис различным количеством белка, возможно, взяли на себя радиоактивную метку или циклогексимид в разное время, или могут иметь различные оформления кинетики, такие совокупные данные могут вводить в заблуждение. Наконец, в случае циклогексимид экспериментов Chase, добавление ингибитора синтеза белка может иметь нежелательные физиологические эффекты, которые могут искусственно изменяют стабильность белка 16-18. Эти недостатки можно избежать с помощью флуоресценции упадок после фотопреобразования (FDAP), техника, которая использует photoconvertible белки для измерения зазора белка динамически в живых организмах 19-25 (см Обсуждение на ограничения метода FDAP). Photoconvertible белки флуоресцентные белки, возбуждения и эмиссии свойства изменяются после воздействия определенных длин волн света 26. Одной из наиболее распространенных вариант Dendra2, &quot;зеленый к красный&quot; photoconvertible белок, который изначально имеет эксЦитирование и выбросов свойствами, аналогичными свойствам зеленого флуоресцентного белка, но после воздействия УФ-СВЕТА &quot;фотопреобразования&quot; -its возбуждение / эмиссионные свойства становятся аналогичными красных флуоресцентных белков 23,27. Важно отметить, что новый белок, вырабатываемый после фотопреобразования не будет иметь те же свойства возбуждения / испускания как photoconverted белка, что позволяет развязку производства и оформления на фотопреобразования и наблюдать только в бассейне photoconverted белка. Маркировка белки, представляющие интерес с photoconvertible белков, таким образом, обеспечивает удобный способ широтно-метки белков в неповрежденных, оптически доступных живых организмов. В FDAP анализа (рис 1а) интерес белок помечен photoconvertible белка и выразил в живом организме (рис 1б). Слитый белок photoconverted, и уменьшение photoconverted сигнала с течением времени контролируется fluorescenCE микроскопии (рис 1С). Затем данные снабжены соответствующей модели, чтобы определить период полураспада слитого белка (фиг 1D). FDAP анализа, описанного здесь был разработан, чтобы определить, внеклеточные полураспада, выделяемых сигнальных белков у эмбрионов данио рерио во время раннего эмбриогенеза 19. Тем не менее, этот подход может быть приспособлен к любому прозрачного модельного организма, что терпит живого изображения, и могут быть использованы для мониторинга зазора любой taggable внутриклеточного или внеклеточного белка. Вариации методике, описанной здесь, были выполнены в культивируемых клетках дрозофилы 20,23 и 22, и 21 мышей эмбрионы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Стабильность белка влияет на многие аспекты биологии и измерения зазора кинетики белков может обеспечить важную информацию в биологических системах. В FDAP экспериментов, очистка белков внутри живых организмов могут быть измерены. Интересующий белок помечен photoconvertible флуоресцентного белка, выраженного в естественных условиях и photoconverted и уменьшение photoconverted сигнала с течением времени контролируется. Затем данные снабжены соответствующей модели зазора определения белка полураспада. Важно отметить, что оформление кинетика населения белка в различных отсеках организма могут быть рассмотрены отдельно, применяя на отсеки маски. Этот подход был использован для определения внутри- и внеклеточного полураспада секретируемых белков сигнализации во данио развития. Здесь мы опишем протокол для FDAP экспериментов у эмбрионов данио рерио. Должна быть возможность использовать FDAP определить зазор кинетикилюбой taggable белка в любой оптически доступной организма.

FDAP был использован для определения полураспада внеклеточных сигнальных белков у эмбрионов данио рерио 19. Один из этих белков, Косой, индуцирует экспрессию генов в процессе эмбриогенеза mesendodermal 34. Косой-Dendra2 активирует экспрессию генов mesendodermal на уровне аналогичных немечено...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Уровни белка в клетках и тканях часто жестко регулируется баланс производства белка и оформления. С помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP), зазор кинетика белков может быть измерена экспериментально в естественных условиях.

Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Эмбрионы

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

После эндокарда ткани движения через ячейки Photoconversion в Zebrafish эмбриона

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Целая гора иммуногистохимия в зебрафиш эмбрионов и ларьков

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...