Name: measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Författarna vill tacka Jeffrey Farrell, James Gagnon, och Jennifer Bergmann för kommentarer på manuskriptet. KWR stöddes av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under utvecklingen av FDAP analysen. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH AFS och med bidrag från den tyska Research Foundation (Emmy Noether Program), Max Planck Society, och Human Frontier Science Program (Career Development Award) till PM.

1. Generera en Photoconvertible Fusion Konstruera och injektion dechorionated Zebrafish embryon <ol><li> Generera en funktionell konstruktion innehållande proteinet av intresse smält till en grön-till-röd photoconvertible protein (se Diskussion), sedan använda in vitro-transkription för att generera capped mRNA som kodar för fusionsproteinet som i Muller et al., 2012 19. </li><li> Använd pronas att ta bort chorions från cirka 30 zebrafisk embryon vid en cellstadie...

Framgången för en FDAP experiment bygger på alstringen av en funktionell photoconvertible fusionsprotein. Märka ett protein kan påverka dess biologiska aktivitet och / eller biofysiska egenskaper, inklusive dess lokalisering, löslighet och stabilitet 36-41. Var beredd på att testa aktiviteten av flera olika fusionskonstruktioner för att hitta en som är aktiv. Vi har funnit att ändra läget på den photoconvertible proteinet i förhållande till proteinet av intresse eller användning av längre link...

Nivåerna av proteiner i celler och organismer bestäms av deras produktionshastigheter och clearance. Proteinhalveringstider kan variera från minuter till dagar 1-4. I många biologiska system, stabilisering eller clearance av nyckelproteiner har viktiga effekter på cellulär aktivitet. Modulering av intracellulär proteinstabilitet krävs för cellcykelprogression 5,6, utvecklings signalering 7-9, apoptos 10, och normal funktion och underhåll av nervceller 11,12. Extracellulär proteinstabilitet påverkar fördelningen och tillgången av utsöndrade proteiner, såsom morfogener 13,14, i en vävnad. Under de senaste decennierna har proteinstabilitet främst bedömts i cellkultur med hjälp radioaktiv puls-märkning eller cykloheximid chase experiment 15. I sådana puls chase experiment, celler antingen transient utsatt för en &quot;puls&quot; av radioaktivt aminosyraprekursorer som införlivas i nysyntetiserade proteiner, eller de är utsatta för cykloheximid, som inhiberar proteinsyntes. Odlade celler samlas sedan vid olika tidpunkter, och antingen immunoprecipitation följt av autoradiografi (i radioaktiva puls chase experiment) eller western blotting (i cykloheximid experiment) används för att kvantifiera clearance av proteinet över tid. Konventionella proteinstabilitetsanalyser har flera brister. Först, är proteiner i dessa analyser ofta inte uttryckta i sina endogena miljöer, utan snarare i vävnadskultur och ibland i celler från olika arter. För proteiner vars stabilitet är kontextberoende, är detta synsätt problematisk. För det andra är det inte möjligt att följa proteinet clearance i enskilda celler eller organismer över tiden, och data från dessa analyser avspeglar ett genomsnitt av olika populationer av celler vid olika tidpunkter. Eftersom enskilda celler kan ha börjatmed olika mängder protein, kan ha tagit upp den radioaktiva märkningen eller cykloheximid vid olika tidpunkter, eller kan ha olika clearance kinetik, sådana aggregerade data kan vara missvisande. Slutligen när det gäller cykloheximid chase experiment, kan tillsats av proteinsynteshämmare har oavsiktliga fysiologiska effekter som på konstgjord väg kunde ändra proteinstabilitet 16-18. Dessa brister kan undvikas genom att använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP), en teknik som utnyttjar photoconvertible proteiner för att mäta protein clearance dynamiskt i levande organismer 19-25 (se diskussion om begränsningar av FDAP tekniken). Photoconvertible proteiner är fluorescerande proteiner vars excitation och emissionsegenskaper förändras efter exponering för specifika våglängder av ljus 26. En vanligt använd variant är Dendra2, en &quot;grön-till-röda&quot; photoconvertible protein som initialt har excitation och emissionsegenskaper liknande gröna fluorescerande proteiner, men efter exponering för UV-ljus- &quot;photoconversion&quot; -dess excitation / emissionsegenskaper blir liknar dem hos röda fluorescerande proteiner 23,27. Viktigt kommer nya protein som produceras efter photoconversion inte samma excitation / emissionsegenskaper som photoconverted protein, vilket gör frikoppling av produktion och avslut på photoconversion och observation av endast en pool av photoconverted protein. Märka proteiner av intresse med photoconvertible proteiner ger därmed ett bekvämt sätt att pulsmärkes proteiner i intakta, optiskt åtkomliga levande organismer. I FDAP analyser (Figur 1A), är ett protein av intresse taggade med photoconvertible protein och uttrycks i en levande organism (Figur 1B). Fusionsproteinet photoconverted, och minskningen i photoconverted signalen över tiden övervakas av fluorescence mikroskopi (Figur 1C). Uppgifterna är sedan försedd med en lämplig modell för att bestämma halveringstiden för fusionsproteinet (figur 1D). Den FDAP analys som beskrivs här var utformad för att bestämma de extracellulära halveringstider på utsöndrade signalproteiner i zebrafisk embryon under tidig embryogenes 19. Däremot kan anpassas denna inställning till något transparent modellorganism som tål levande avbildning, och kan användas för att övervaka clearance av varje märkningsbara intracellulär eller extracellulär protein. Variationer av den teknik som beskrivs här har utförts i odlade celler 20,23 och Drosophila 22 och mus 21 embryon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Protein stabilitet påverkar många aspekter av biologi och mäta klare kinetik proteiner kan ge viktiga insikter i biologiska system. I FDAP experiment, kan clearance av proteiner inom levande organismer mätas. Ett protein av intresse är märkt med ett photoconvertible fluorescerande protein, uttryckt in vivo och photoconverted, och minskningen i den photoconverted signalen över tiden övervakas. Data sedan utrustad med en lämplig clearancemodellen att bestämma protein halveringstid. Viktigt kan clearance kinetiken av proteinpopulationer i olika fack i organismen undersökas separat genom att tillämpa kompartment-masker. Detta tillvägagångssätt har använts för att bestämma de intra- och extracellulära halveringstider utsöndrade signalproteiner under zebrafisk utveckling. Här beskriver vi ett protokoll för FDAP experiment i zebrafiskembryon. Det bör vara möjligt att använda FDAP att bestämma clearance skinetiken förvarje märkningsbara protein i någon optiskt åtkomlig organism.

FDAP har använts för att bestämma de halveringstider av extracellulära signalerande proteiner i zebrafiskembryon 19. En av dessa proteiner, kisa, inducerar uttryck av mesendodermal gener under foster 34. Kisa-Dendra2 aktiverar uttryck av mesendodermal gener på nivåer som liknar otaggad Squint, vilket framgår av QRT-PCR och in situ hybridisering analyser 19. Embryon samar injicerades med Alexa488-dextran och mRNA som kodar Squint-Dendra2 och utsattes för FDAP analysen. En...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein nivåer i celler och vävnader är ofta hårt reglerad av balansen mellan produktionen och clearance-protein. Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP), kan släppnings kinetiken av proteiner experimentellt mätas in vivo.

Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk Vessel Skada i zebrafiskembryon

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analysera<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migration använder Cell Transplantationer och Time-lapse avbildning i Zebrafish embryon

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Ljus Sheet-baserade fluorescensmikroskopi av levande eller fixeras och färgas<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryon

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Följande endokardiella vävnad rörelser via Cell Photoconversion i zebrafiskar embryot

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hela mount immunohistokemi i zebrafisk embryon och larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...