Name: reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. إعداد الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 مل من &quot;عازلة SUV&quot; تحتوي على 5 ملي بوكل، 1 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو تريس (7.5 درجة الحموضة)، و 2 ملي طرهالوز. تصفية المخزن المؤقت مع فلتر حقنة 0.2 ميكرون وتقسيمها إلى 1 مل مأخوذة التي يمكن تخزينها في -20 ?...

<ol>
	<li>Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Synthetic+Biology:+Engineering+in+a+Tinkerer&#8217;s+World.">Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer&#8217;s World.</a> Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Shape+Modulates+Transmembrane+Protein+Distribution.">Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution.</a> Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).</li><li>Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+controls+dynamin+polymerization.">Membrane curvature controls dynamin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).</li><li>Domanov, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+in+geometrically+confined+membranes.">Mobility in geometrically confined membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).</li><li>Sorre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature-driven+lipid+sorting+needs+proximity+to+a+demixing+point+and+is+aided+by+proteins.">Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).</li><li>Faris, M. D. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Lowering+Induced+by+Protein+Activity.">Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity.</a> Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).</li><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+reconstituted+in+GUVs:+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading.">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+approaches+to+protein-induced+membrane+deformations+in+trafficking.">Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li><li>Reeves, J. P., Dowben, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+properties+of+thin-walled+phospholipid+vesicles.">Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles.</a> Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).</li><li>Angelova, M. I., Sol&#233;au, S., M&#233;l&#233;ard, P., Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).</li><li>Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Unilamellar+Vesicle+Electroformation.">Giant Unilamellar Vesicle Electroformation.</a> Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).</li><li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in.">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in.</a> Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).</li><li>Campillo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+Membrane+Dynamics+Unveiled+by+Membrane+Nanotube+Extrusion.">Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion.</a> Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).</li><li>Kwok, R., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoelasticity+of+large+lecithin+bilayer+vesicles.">Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles.</a> Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).</li><li>Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+and+physical+properties+of+giant+phospholipid+vesicles+prepared+in+the+presence+of+an+AC+electric+field.">Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field.</a> Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-Assisted+Formation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles.</a> Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles+via+peptide-induced+fusion.">Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion.</a> Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).</li><li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles.">Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li><li>Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+or+Active+Fluctuations+in+Membranes+Containing+Proteins.">Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins.</a> Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).</li><li>Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Lipids+in+VDAC+Oligomerization.">The Role of Lipids in VDAC Oligomerization.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+voltage-dependent+K++channel.">X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reconstitution+of+a+Voltage-Gated+Potassium+Channel+in+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles.</a> PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+Kv+Channel+into+Lipid+Membranes+for+Structural+and+Functional+Studies.">Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+and+Structure+of+the+Patch+and+the+Gigaseal.">Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal.</a> Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).</li><li>Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+KvAP+unitary+conductance+and+gating+by+1-alkanols+and+other+surface+active+agents.">Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents.</a> Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).</li><li>Schmidt, D., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+K++channel+gating+and+voltage+sensor+toxin+sensitivity+depend+on+the+mechanical+state+of+the+lipid+membrane.">Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).</li><li>Quemeneur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+matters+in+protein+mobility+within+membranes.">Shape matters in protein mobility within membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).</li><li>Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;S1-casein,+which+is+essential+for+efficient+ER-to-Golgi+casein+transport,+is+also+present+in+a+tightly+membrane-associated+form.">&#945;S1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form.</a> BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).</li><li>Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Voltage+Dependent+Proteins+with+Giant+Unilamellar+Vesicles+in+a+&#8220;Whole+Cell&#8221;+Configuration.">Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a &#8220;Whole Cell&#8221; Configuration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).</li><li>Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

نظم نموذج المحاكاة البيولوجية هي أداة هامة لدراسة خصائص وتفاعلات البروتينات والأغشية. مقارنة بأنظمة أخرى مثل إعادة تشكيل BLMs أو الأغشية الدهنية المعتمدة، GUV النظم القائمة الحالية عدة فرص بما في ذلك سيطرة كبيرة من تكوين الغشاء والتوتر والهندسة، فضلا عن كونه حقا خالية...

عند دراسة المبادئ الفيزيائية التي تحكم الأنظمة الحية، ونهج من أسفل إلى أعلى تسمح للالتجريبي للسيطرة على تكوين النظام وغيرها من المعالم التي لم يتم التلاعب بها بسهولة في النظم القائمة على خلية 1. للعمليات التي تعتمد على الأغشية، العملاق Unilamellar الحويصلات (GUVs، قطر ~ 1-100 ميكرون) وقد ثبت أن نظام بيوميمتيك مفيدة جدا 2-7 كما هي مناسبة تماما للدراسات الفحص المجهري والمجهرية 8-10. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات المختلفة لإنتاج GUVs، ومعظم تقع في فئتين - مستحلب أساس النهج 11،12 والتقنيات التي تعتمد على إعادة إماهة فيلم الدهون 13-16. في الأساليب المستندة إلى مستحلب، يتم تجميع النشرات الداخلية والخارجية من الأغشية GUV بالتتابع من الطبقات الوحيدة الدهون في واجهات المياه / النفط. هذا النهج هو المثالي لتغليف البروتينات القابلة للذوبان معفي GUVs، وتشكيل GUVs مع غير المتماثلة تكوين النشرة الدهون. ومع ذلك، يمكن GUVs تشكلت من المستحلبات تحتفظ آثار مذيب أن تغيير خصائص الغشاء والميكانيكية 17، والنهج ليس وخاصة مناسبة تماما لالعابرة للغشاء البروتين إعادة. طرق معالجة الجفاف الفيلم تعتمد على حقيقة أن تجفيف (الجفاف) يسبب العديد من خليط الدهن لتشكيل كومة متعددة رقائقي من الأغشية. إذا ثم يتم وضع هذا المكدس في اتصال مع وجود مخزن مؤقت مائي، والأغشية في المكدس تتحرك التدفقات بصرف النظر المذيبات فيما بينها وعلى سطح المكدس، يمكن الأغشية الفردية فصل لتشكيل GUVs 13،18 (وكذلك حديقة حيوانات حقيقية ل الأجسام شحمي أخرى). ومع ذلك، حتى بالنسبة المثلى العازلة والدهون التراكيب، وهذا &quot;تورم عفوية&quot; الكلاسيكية الأسلوب لديه العائد المنخفض نسبيا من GUVs خالية من العيوب. واحد الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لزيادة العائد من GUVs خالية من العيوب هو &quot;electroformation221 ؛، التي يتم تطبيق (AC) الحقل التيار المتردد خلال فيلم الإماهة. في حين لا تزال الآلية غير مفهومة، &quot;electroformation&quot; يمكن أن تعطي عوائد GUV مذهلة (&gt; 90٪ في الظروف مواتية) لمخازن تركيز الملح منخفضة (&lt;5 ملم) 14،19، ويمكن أن تعمل حتى في مخازن الفسيولوجية (~ 100 ملم) باستخدام تردد أعلى (500 هرتز مقابل 10 هرتز) AC المجال وأقطاب البلاتين 15. نهج بديل لزيادة العائد من GUVs خالية من العيوب هو &quot;بمساعدة هلام تورم&quot;، الذي وتودع الحل الدهون على هلام الركيزة البوليمرية بدلا من السلبي (على سبيل المثال، والزجاج، PTFE) ركائز المستخدمة في الكلاسيكية &quot;تورم العفوي &quot;. عندما يتم ممهى الناتجة الفيلم الدهون / هلام، يمكن GUVs تشكل بسرعة حتى لمخازن الفسيولوجية 16،20. ويمكن لجميع هذه الأساليب تنتج GUVs-الدهون الوحيد الذي يمكن استخدامه لدراسة غشاء المرتبطة الظواهر مثلالتفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان والأغشية. ومع ذلك، لإدراج البروتين العابر للغشاء في GUVs، هناك حاجة إلى تعديلات كبيرة لضمان أن البروتين لا يزال في حالة وظيفية في جميع أنحاء الإجراء إعادة. في حين حلول الدهون في المذيبات العضوية (على سبيل المثال، والكلوروفورم، الهكسان الحلقي) مثالية لإنتاج الأفلام الدهون والبروتينات عبر الغشاء وعادة ما تكون مستقرة فقط عندما يتم تضمين مسعور المجال الخاص بها عبر الغشاء في طبقة ثنائية الدهون، أو محاطة مذيلة المنظفات ( على سبيل المثال، خلال تنقية البروتين). وهكذا، فإن المواد بدءا من أجل إعادة هي عادة الأغشية الأم، البروتين النقي في حل المنظفات، أو الحويصلات التي تحتوي على البروتين unilamellar صغيرة (PROTEO-سيارات الدفع الرباعي) و / أو حويصلات متعددة رقائقي (PROTEO-MLVs) التي شكلتها إزالة المنظفات في وجود الدهون. معظم طرق لدمج هذه البروتينات الغشاء إلى GUVs تقع في ثلاث فئات. مغرز مباشرةن: يتم خلط عبر غشاء البروتين معلقة في المنظفات مع، الدهون فقط، GUVs تذوب المنظفات أقل ما يقال شكلت مسبقا، والمنظفات ثم إزالة باستخدام biobeads 21. في حين بسيطة من الناحية المفاهيمية، يتطلب هذا الأسلوب مراقبة دقيقة من تركيز المنظفات، وتركيز عالية جدا المنظفات يمكن أن يحل GUVs في حين منخفضة جدا تركيز يمكن أن يسبب البروتين لتتكشف أو مجموع المباراتين. يتم الجمع بين البروتين في PROTEO-سيارات الدفع الرباعي مع شكلت مسبقا، الدهون فقط GUVs ويتم تسهيل الاندماج مع الببتيدات fusogenic الخاصة 22 أو المنظفات 21: GUV / PROTEO-SUV فيوجن. وعادة ما مدى الانصهار ومحدودة يؤدي إلى GUVs مع انخفاض كثافة البروتين. الجفاف / الإماهة: يتم تشكيل لفيلم الدهون التي تحتوي على البروتين بسبب الجفاف الجزئي لPROTEO-SUV (أو PROTEO-MLV) حل وGUVs يتم بعد ذلك نمت كما لفيلم الدهن النقي. التحدي الواضح هو حماية البروتين خلال dehydrati جزئيعلى الخطوة 23، ولكن الأسلوب وقد استخدم بنجاح لإعادة البروتينات العابرة للغشاء مثل رودوبسين جرثومي، الكالسيوم أتباز، إنتغرين وVDAC إلى GUVs 7،23 - 25. توضح هذه المقالة بروتوكولات الجفاف / الإماهة لجعل GUVs تحتوي على قناة الجهد بوابات البوتاسيوم، KvAP، من فرط حرارة الأركيا، Aeropyrum pernix. KvAP لديه درجة عالية من التماثل إلى الجهد حقيقية النواة قنوات البوتاسيوم تعتمد 26 والتركيب البلوري المعروف 27 ، مما يجعلها نموذجا جيدا لدراسة آلية الجهد النابضة. وقد وصفت إنتاج PROTEO-سيارات الدفع الرباعي بالتفصيل سابقا وليس جزءا من هذا البرنامج التعليمي 26،28،29. الأهم من ذلك، KvAP PROTEO-سيارات الدفع الرباعي لا يجب أن يتم إنتاجها لكل إعداد GUV، لأنها يمكن خزنها في صغيرة (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر) aliquots في -80 ° C لفترات طويلة من الزمن (&gt; 1 سنة). Electroformationأو بمساعدة هلام تورم ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لزراعة GUVs من KvAP PROTEO-سيارات الدفع الرباعي (أو PROTEO-MLVs). ويوضح الخطوات الرئيسية لبروتوكول electroformation في الشكل 1. تترسب قطرات من محلول سيارات الدفع الرباعي التي تحتوي على البروتين على أسلاك البلاتين (كما هو موضح في الشكل 2). الجفاف الجزئي للتعليق SUV يؤدي إلى تشكيل لفيلم البروتين الدهني من خلال مزيج من سيارات الدفع الرباعي. أثناء الإماهة، يتم تطبيق حقل AC إلى الأقطاب لمساعدة طبقات الدهون لdelaminate وتشكيل GUVs. حقل 10 هرتز يعمل بشكل جيد عند استخدام &quot;قليل الملح&quot; (&lt;5 مم) الإماهة عازلة 28 و GUVs يستغرق عدة ساعات لتنمو. في المقابل، مخازن الفسيولوجية (التي تحتوي على ~ 100 ملم الملح) تعمل بشكل جيد مع الجهد أقل، 500 هرتز AC المجال ولكن تحتاج إلى فترات طويلة (~ 12 ساعة) مدة 15 التورم. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول سابق باستخدام الشرائح ITO 24، ولكن يستخدم تابع غرفة مخصصةaining اثنين من الأسلاك البلاتين كما هو مبين في الشكل 2 (انظر مناقشة للحصول على تفاصيل تصميم واقتراحات لبساطة وبدائية غرف). ويوضح الشكل (3) طريقة تورم بمساعدة هلام. بروتوكول يعمل بشكل جيد مع مخازن مع تركيز الملح الفسيولوجية، سريع، وينتج GUVs مع توزيع البروتين أكثر تجانسا. ومع ذلك، فإن العائد من معزولة، GUVs المجانية عيب، على ما يبدو (أي الغشاء GUV موحد في موازين طول البصرية ولا أرفق أي كائنات) هو أقل من ذلك، على الرغم من أنها توفر عدد كاف لالتصحيح، المشبك والتجارب الصغيرة التلاعب . واستند هذا الأسلوب على البروتوكول باستخدام هلام الاغاروز لإنتاج الدهون الوحيد GUVs 16 ويتطلب معدات متخصصة أقل من الطريقة electroformation. يوصف توصيف GUVs مع مضان المجهري، وكذلك الإجراءات باستخدام معيار التصحيح، المشبك مجموعة المتابعة لقياس النشاط KvAP في &quot;الداخل إلى الخارج&quot; رفعه بقع الغشاء. يمكن المتزايدة GUVs التي تحتوي على البروتين أن يكون أكثر صعوبة من GUVs-الدهون الوحيد. على وجه الخصوص، يمكن أن العائد GUV النهائي يعتمد على بحساسية بالضبط كيف وتودع الحل SUV والمجففة لتشكيل كومة الغشاء. لشخص دون أي خبرة سابقة مع GUVs، قد يكون من المفيد أن ينمو أولا GUVs-الدهون الوحيد التالية بروتوكول التقليدي 15،16 في الذي يتكون الفيلم الغشاء عن طريق إيداع الدهون من المذيبات العضوية. وبمجرد أن البروتوكول التقليدي يعمل بشكل جيد، SUV ترسب والجفاف الجزئي ويمكن بعد ذلك أن يتقن استخدام سيارات الدفع الرباعي-الدهون فقط، التي هي أيضا مفيدة جدا عند ضبط بروتوكول لتكوين الدهون الجديد. عندما تنمو GUVs موثوق من سيارات الدفع الرباعي-الدهون فقط، وعندها فقط خطوة صغيرة لإنتاج GUVs التي تحتوي على البروتين من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

عملاق Unilamellar الحويصلات (GUVs) هي نظام بيوميمتيك شعبية لدراسة الظواهر المرتبطة الغشاء. ومع ذلك، وتستخدم عادة بروتوكولات لتنمو يجب أن يتم تعديل GUVs من أجل تشكيل GUVs تحتوي على البروتينات عبر الغشاء وظيفية. توضح هذه المقالة طريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation وبمساعدة هلام تورم - لتشكيل GUVs تحتوي على قناة البوتاسيوم الجهد بوابات، KvAP. في كلتا الطريقتين، وهو حل من الحويصلات التي تحتوي على البروتين unilamellar صغيرة هو المجففة جزئيا لتشكيل كومة من الأغشية، والتي يتم بعد ذلك يسمح للتضخم في منطقة عازلة الإماهة. للتعرف على طريقة electroformation، وتودع الفيلم على أقطاب البلاتين بحيث يمكن تطبيق حقل AC خلال فيلم الإماهة. في المقابل، يستخدم الأسلوب بمساعدة هلام تورم هلام الركيزة الاغاروز لتعزيز فيلم الإماهة. ويمكن لكل من طرق إنتاج GUVs في (على سبيل المثال، 100 ملم) تركيزات منخفضة (على سبيل المثال، 5 ملم) والفسيولوجية الملح. وتتميز GUVs الناتجة عن طريق المجهر مضان، وظيفة من القنوات أعيد قياسها باستخدام التكوين التصحيح، المشبك من الداخل إلى الخارج. في حين تورم في وجود حقل كهربائي متناوب (electroformation) يعطي عالية الغلة من GUVs خالية من العيوب، وتنتج طريقة بمساعدة هلام تورم توزيع البروتين أكثر تجانسا ويتطلب أي معدات خاصة.

نمو GUVs يمكن تقييمها بسرعة عن طريق فحص غرفة النمو تحت المجهر. لelectroformation، وGUVs تميل إلى النمو في عناقيد على طول الأسلاك البلاتين، كما هو مبين في الشكل (4). وخلال بمساعدة هلام تورم، وتظهر GUVs عن الهياكل الكروية التي تنمو وتلتحم مع بعضها (الشكل 5) بسرعة. <p c...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

ويتجلى إعادة تشكيل البروتين الغشاء، KvAP، إلى الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) للطريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation، وبمساعدة هلام التورم. في كلتا الطريقتين، وتنصهر الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتين معا لتشكيل GUVs التي يمكن بعد ذلك دراستها من قبل المجهري مضان والتصحيح، المشبك الكهربية.

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

دراسة BCL-2 وظيفة الأسرة مع حويصلات كبيرة Unilamellar

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...