Name: reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies
Uploaded: 2015-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

1. Preparación de la solución <ol><li> Preparar 5 ml de búfer SUV &#39;que contiene 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), y la trehalosa 2 mM. Filtrar el tampón con un filtro de jeringa de 0,2 micras y se dividen en alícuotas de 1 ml que se pueden almacenar a -20 ° C. NOTA: Los detalles adicionales de los reactivos e instrumentos se dan en la lista de materiales. </li><li> Preparar 40 ml de &#39;Crecimiento Buffer&#39; GUV que llenará el GUV interior durante la rehidratación película. Para un ...

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	<li>Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Synthetic+Biology:+Engineering+in+a+Tinkerer&#8217;s+World.">Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer&#8217;s World.</a> Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Shape+Modulates+Transmembrane+Protein+Distribution.">Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution.</a> Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).</li><li>Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+controls+dynamin+polymerization.">Membrane curvature controls dynamin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).</li><li>Domanov, Y. 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Sistemas de modelos biomiméticos son una herramienta importante para el estudio de las propiedades e interacciones de proteínas y membranas. En comparación con otros sistemas reconstituidos como BLM o membranas de lípidos compatibles, GUV sistemas basados ​​presentes varias oportunidades incluyendo considerable control de la composición de la membrana, la tensión y la geometría, así como ser verdaderamente libre de aceite. Sin embargo, la incorporación de proteínas transmembrana, como KvAP, en GUVs requier...

Al estudiar los principios físicos que rigen los sistemas vivos, los enfoques ascendentes permiten un experimentalista para controlar la composición del sistema y otros parámetros que no son fácilmente manipulables en sistemas basados ​​en células 1. Para los procesos basados ​​en membranas, vesículas unilamelares gigantes (GUVs, diámetro ~ 1-100 micras) han demostrado ser un sistema muy útil biomimético 2 - 7 ya que son muy adecuado para estudios de microscopía y micromanipulación 8 - 10. Si bien hay muchos protocolos diferentes para producir GUVs, la mayoría caen en dos categorías - emulsión a base aproxima 11,12 y técnicas basadas en la rehidratación de una película lipídica 13-16. En los métodos basados ​​en emulsión, las láminas interior y exterior de las membranas GUV se ensamblan secuencialmente a partir de monocapas de lípidos en las interfases agua / aceite. Este método es ideal para la encapsulación de proteínas solubles conen los GUVs, y para la formación de GUVs con composición lipídica valva asimétrica. Sin embargo, GUVs formados a partir de emulsiones pueden retener trazas de disolvente que cambian las propiedades mecánicas de la membrana 17, y el enfoque no es especialmente adecuado para la reconstitución de proteínas trans-membrana. Métodos de rehidratación de película se basan en el hecho de que el secado (deshidratación) causa muchas mezclas de lípidos para formar una pila multi-lamelar de las membranas. Si esta pila se coloca entonces en contacto con un tampón acuoso, las membranas de la pila se moverán flujos separados como disolvente entre ellos y en la superficie de la pila, las membranas individuales pueden separar para formar GUVs 13,18 (así un verdadero zoológico de otros objetos lipídicos). Sin embargo, incluso para las composiciones de amortiguación y de lípidos óptimos, este método clásico &quot;inflamación espontánea&quot; tiene un rendimiento relativamente bajo de GUVs libres de defectos. Un método muy utilizado para aumentar el rendimiento de GUVs sin defectos es &quot;electroformation221 ;, en el que se aplica un campo de corriente alterna (AC) durante la rehidratación de la película. Mientras que el mecanismo sigue siendo poco conocida, &quot;electroformation&quot; puede dar rendimientos GUV espectaculares (&gt; 90% en circunstancias favorables) para los búferes de baja concentración de sal (&lt;5 mM) 14,19, e incluso se puede trabajar en tampones fisiológicos (~ 100 mM) usando una mayor frecuencia (500 Hz frente a 10 Hz) de campo de CA y electrodos de platino 15. Un enfoque alternativo para aumentar el rendimiento de GUVs libres de defectos es &quot;gel asistida inflamación&quot;, en el que se deposita la solución de lípidos sobre un sustrato de gel polimérico en lugar de la pasiva sustratos (por ejemplo, vidrio, PTFE) utilizado en &quot;inflamación espontánea clásica &quot;. Cuando se rehidrata la película de lípido / gel resultante, GUVs pueden formar rápidamente incluso para tampones fisiológicos 16,20. Todos estos métodos pueden producir GUVs lípidos sólo que se pueden utilizar para estudiar los fenómenos asociadas a la membrana tales como lala interacción entre las proteínas y las membranas solubles. Sin embargo, para incorporar una proteína trans-membrana en GUVs, se necesitan modificaciones importantes para asegurar que la proteína permanece en un estado funcional durante todo el procedimiento de reconstitución. Mientras que las soluciones de lípidos en disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo, ciclohexano) son ideales para la producción de películas de lípidos, las proteínas trans-membrana son típicamente sólo es estable cuando su dominio trans-membrana hidrófoba se incorpora en una bicapa lipídica, o rodeado por una micela detergente ( por ejemplo, durante la purificación de proteínas). Por lo tanto, el material de partida para una reconstitución es típicamente membranas nativas, proteína purificada en una solución de detergente, o pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas (Proteo-SUVs) y / o vesículas multilamelares (proteo-MLV) formado por la eliminación del detergente en el presencia de lípidos. La mayoría de los métodos para incorporar estas proteínas de membrana en GUVs se dividen en tres categorías. Insertio directon: Trans-proteína de membrana suspendida en el detergente se mezcla con, de sólo lípidos, GUVs solubilizadas ligeramente detergentes preformadas, y el detergente elimina a continuación usando Biobeads 21. Si bien conceptualmente simple, este método requiere un control preciso de la concentración de detergente, como una concentración demasiado alta de detergente puede disolver los GUVs mientras que una concentración demasiado baja puede causar la proteína se despliegue o agregado. GUV / Proteo-SUV Fusión: La proteína en Proteo-SUV se combina con preformadas, lípidos sólo para GUVs y fusión se facilita con péptidos de fusión especiales 22 o detergente 21. Normalmente la extensión de la fusión es limitada llevando a GUVs con baja densidad de proteínas. La deshidratación / rehidratación: Una película de lípidos que contiene proteína está formada por deshidratación parcial de un proteo-SUV (o proteo-MLV) solución y GUVs se cultivan como para una película lipídica pura. El reto es obvio para proteger a la proteína durante la dehydrati parcialen el paso 23, pero el método se ha utilizado con éxito para reconstituir proteínas trans-membrana tales como bacteriorodopsina, calcio-ATPasa, integrina y VDAC en GUVs 7,23 - 25. Este artículo describe protocolos de deshidratación / rehidratación para hacer GUVs que contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP, desde el Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termófilo. KvAP tiene un alto grado de homología con los canales de potasio dependientes de voltaje eucariota 26 y una estructura cristalina conocida 27 , por lo que es un buen modelo para estudiar el mecanismo de compuerta de voltaje. La producción de los proteo-SUV ha sido descrito en detalle anteriormente y no es parte de este tutorial 26,28,29. Es importante destacar que, KvAP Proteo-SUVs no tienen que ser producidos para cada preparación GUV, ya que pueden ser almacenados en pequeñas alícuotas (por ejemplo, 10 l) a -80 ° C durante largos períodos de tiempo (&gt; 1 año). Electroformationo hinchazón gel asistida se puede usar entonces para crecer GUVs de los proteo-SUVs KvAP (o proteo-MLV). Los pasos clave para el protocolo electroformation se ilustran en la Figura 1. Gotitas de una solución de SUVs que contienen la proteína se depositan sobre alambres de platino (que se muestran en la Figura 2). Deshidratación parcial de la suspensión de SUV conduce a la formación de una película de lípidos y proteínas a través de la fusión de SUVs. Durante la rehidratación, un campo de corriente alterna se aplica a los electrodos para ayudar a las capas de lípidos a la delaminación y formar GUVs. Un campo de 10 Hz funciona bien cuando se utiliza &quot;bajo en sal&quot; (&lt;5 mM) rehidratación de amortiguación 28 y GUVs tardan varias horas para crecer. En contraste, los tampones fisiológicos (que contiene ~ 100 mM de sal) trabajar bien con un voltaje más bajo, campo 500 Hz AC pero requieren un prolongado (~ 12 h) hinchazón período 15. Este método se basa en un protocolo anterior usando ITO se desliza 24, pero utiliza un cont cámara de encargoaining dos alambres de platino, como se muestra en la Figura 2 (ver la discusión de los detalles de diseño y sugerencias para la más simple, cámaras improvisado). La Figura 3 ilustra el método hinchazón gel asistida. El protocolo funciona bien con tampones con concentraciones fisiológicas de sal, es rápida, y produce GUVs con una distribución más homogénea de proteínas. Sin embargo, el rendimiento de GUVs, aparentemente sin defectos aislados (es decir, la membrana GUV es uniforme en la longitud de las escalas ópticas y no encierra ningún objeto) es menor, a pesar de que ofrece un número suficiente de patch-clamp y experimentos de micro-manipulación . Este método se basa en un protocolo usando gel de agarosa para producir GUVs lípidos sólo 16 y requiere un equipo menos especializado que el método electroformation. La caracterización de GUVs con microscopía de fluorescencia se describe, así como los procedimientos que utilizan un estándar de patch-clamp set-up amedir la actividad KvAP en &quot;dentro-fuera&quot; extirpados parches de membrana. Cultivo GUVs que contienen proteínas pueden ser más difícil que GUVs lípidos solamente. En particular, el rendimiento GUV final puede depender sensiblemente de exactamente cómo la solución SUV se deposita y se deshidrata para formar la pila de membranas. Para alguien sin ninguna experiencia previa con GUVs, puede ser útil para crecer primero GUVs lípidos sólo siguiendo un protocolo convencional de 15,16 en el que la película de membrana se forma mediante el depósito de lípidos en un disolvente orgánico. Una vez que el protocolo convencional funciona bien, SUV deposición y deshidratación parcial luego se pueden dominar el uso de los SUV de lípidos sólo, que también son muy útiles cuando se ajusta el protocolo para una nueva composición de los lípidos. Cuando GUVs crecen de forma fiable de los SUV de lípidos sólo, entonces es sólo un pequeño paso para producir GUVs que contienen proteínas de Proteo-SUV.

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			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

Gigante vesículas unilamelares (GUVs) son un sistema biomimético popular para el estudio de la membrana fenómenos asociados. Sin embargo, comúnmente utilizados protocolos para crecer GUVs deben modificarse con el fin de formar GUVs que contienen proteínas transmembrana funcionales. En este artículo se describen dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e hinchazón gel asistida - para formar GUVs contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP. En ambos métodos, una solución de pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas es parcialmente deshidratado para formar una pila de membranas, que después se deja a hincharse en un tampón de rehidratación. Para el método de electroformation, la película se deposita sobre electrodos de platino de manera que un campo de corriente alterna puede ser aplicada durante la rehidratación de la película. En contraste, el método de la hinchazón gel asistida utiliza un sustrato en gel de agarosa para mejorar la rehidratación de la película. Ambos métodos pueden producir en GUVs (por ejemplo, 100 mM) concentraciones bajas (por ejemplo, 5 mM) y fisiológicas de sal. Los GUVs resultantes se caracterizan por medio de microscopía de fluorescencia, y la función de los canales reconstituidas midieron utilizando la configuración de patch-clamp de dentro a fuera. Mientras que la hinchazón en la presencia de un campo eléctrico alterno (electroformation) da un alto rendimiento de GUVs libres de defectos, el método hinchazón gel asistida produce una distribución más homogénea de proteínas y no requiere equipo especial.

El crecimiento de GUVs se puede evaluar de forma rápida mediante el examen de la cámara de crecimiento bajo el microscopio. Para electroformation, los GUVs tienden a crecer en racimos a lo largo de los alambres de platino, como se muestra en la Figura 4. Durante la hinchazón gel asistida, GUVs aparecen como estructuras esféricas que crecen y se fusionan juntos (Figura 5) rápidamente. GUVs sin defectos son más fácilmente identificados y evaluados despu...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

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