Name: intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics
Uploaded: 2015-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af INSERM, University of Aix-Marseille og en Karriereudvikling pris fra HFSPO opnået ved CL Forestier.

Etik erklæring: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og protokoller, der blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Aix-Marseille Université, Frankrig. Female C57BI / 6 mus på 8-10 uger blev kommercielt fremstilles og håndteres i overensstemmelse med reglerne i dekret nr 8 87-848 19. oktober, 1987, Paris. Alle eksperimenter under anvendelse af L. donovani LD1S parasitter blev gennemført i overensstemmelse med biosikkerhed regler fra det franske og EU-lov...

<ol>
	<li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatic+microcirculation:+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair.">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).</li><li>Srinivasan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+blood+flow+measured+by+optical+methods.">Absolute blood flow measured by optical methods.</a> SPIE Newsroom. , (2011).</li><li>Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+liver+blood+flow:+a+review.">Measurement of liver blood flow: a review.</a> HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).</li><li>Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+pathology+and+parasite+persistence+in+experimental+visceral+leishmaniasis.">Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells.">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intravascular+immune+response+to+Borrelia+burgdorferi+involves+Kupffer+cells+and+iNKT+cells.">An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells.</a> Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immune+surveillance+by+CXCR6++NKT+cells+patrolling+liver+sinusoids.">Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids.</a> PLoS Biol. 3, e113 (2005).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li><li>Vacchina, P., Morales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+screening+test+using+Leishmania+promastigotes+stably+expressing+mCherry+protein.">In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).</li><li>Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+spleen:+quantitative+analysis+of+parasite+mobility+and+blood.">Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li><li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids,+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy.">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li></ol>

Den seneste udvikling i intravital mikroskopi af musen leveren åbner nye muligheder for undersøgelse af fysiologiske respons på infektion in vivo og i realtid 5,9,10. Orgel blodgennemstrømning er en kritisk fysiologisk parameter, der ofte ændres i mange sygdomme. Men status for leveren hæmodynamik under fysiologiske og infektiøse tilstande er stadig et dårligt udforsket område. I denne undersøgelse IVM-baserede metoder, som tidligere var tilpasset til undersøgelse af milten og tumorvaskula...

Organspecifikke hæmodynamik er vigtige fysiologiske funktioner i enhver mammal organ. Abnormaliteter i blodstrømmen kan være konsekvensen af inflammation og et tegn på organdysfunktion 1. Således blodgennemstrømning organisation, struktur og funktion vises som kritiske parametre til analyse under fysiologiske og patologiske tilstande. De teknikker, der har været almindeligt anvendt til analyse af blodgennemstrømning i et bestemt organ indeholde flere begrænsninger, herunder opløsning grænse for selve teknikken (f.eks Doppler-billeddannelse af blodgennemstrømning), kapaciteten til måling af absolut blodgennemstrømning kun (volumen af blod pr enhed betjener et organ) (f.eks Optical Sammenhæng tomografi) og målingen af gennemsnitlige ændringer i hastighed i en stor og heterogen population af blodkar 2,3. Leveren er kredsløbssygdomme forbinder forskellige fartøj undertyper, der er heterogene i deres størrelse, struktur og funktion. Idenne undersøgelse intravital mikroskopi (IVM) imaging-teknologi anvendes til at evaluere lever hæmodynamik in vivo, i realtid, ved høj opløsning og parallelt at afdække de egenskaber ved de enkelte blodkar, der omfatter den hepatiske organ. Den seneste udvikling i denne kraftfulde optiske imaging teknik gør det muligt for forskeren at indsamle dynamiske data om levende dyr på en høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Ved at lade den direkte visualisering og real time overvågning af specifikke og hurtige biologiske processer in vivo, IVM giver en unik mulighed for at forskeren til billedet individuelle blodkar, og måle og kvantificere hastigheden af enkelte røde blodlegemer (RBC) inden for et specifikt udvalgt hepatisk fartøj. I denne undersøgelse har vi implementeret den IVM teknik i muselever at undersøge indflydelsen af muse infektion med hepatotropisk Leishmania-parasitten på leveren hæmodynamik. L. donovanier agent ansvarlig for visceral leishmaniasis, en alvorlig sygdom kendetegnet ved akutte mod kroniske inflammatoriske responser og en patologi, der er til stede i multiple organer, herunder milten og leveren. I en eksperimentel musemodel af visceral leishmaniasis, leveren infektion er selvstændig løsning henviser miltcentret infektion er progressiv 4. Disse resultater af Leishmania-infektion i forhold til de enkelte organer er stadig ikke helt forstået. Undersøgelse af lever og milt hæmodynamik under patologiske tilstande vil kaste nyt lys over vært-parasit interaktioner og sygdom patogenese. Vores eksperimentelle model er baseret på at udsætte og billeddannelse leveren af ​​en bedøvet mus, der fik intravenøs injektion af specifikke fluorescerende farvestoffer til mærkning af den hepatiske intravasculature. Leveren er et gunstigt organ for intra-vital mikroskopi. Efter at have udført en lille incision i maven, er leveren blidt eksternaliseres og placeres på våd gaze, derefter et dækglas med det mål at reducere eventuelle bevægelsesartefakter grundet hjerteslag og åndedræt. Leveren placeres derefter inden visningen af ​​et mikroskop linse. Sammenlignet med milt og lymfeknude, som kræver brug af to foton mikroskopi for IVM undersøgelser, fordelen af ​​leveren ligger i dens homogen 3D arkitektur / anatomi, der tillader anvendelse af en konventionel konfokal mikroskop med en maksimal indtrængningsdybde ca. 50 um, for intravital mikroskopi billeddannelse 5-8. Denne undersøgelse beskriver to uafhængige billeddannende metoder til kvantitativ måling af RBC hastighed og blodgennemstrømning hastighed i de enkelte blodkar. Ved den første metode, er levergennemblødning erhvervet ved anvendelse af en xy bi-dimensional tilstand over tid. De resulterende XYT data analyseres ved hjælp af MtrackJ plugin i det frie ImageJ software, som muliggør sporing af individual RBC over tid. Ved den anden metode anvendes en enkelt blodkar udvalgt og dets tilsvarende blodgennemstrømning er analyseret ved anvendelse af linieskanning hurtig dataopsamling af konfokal laser-scanning-mikroskop. Fartøjet af interesse scannet ved høj frekvens langs dens centrale akse gennem en aksial linie. Blodet strømningshastighed kvantificeres derefter baseret på forskellen i kontrast mellem umærkede mørke erythrocytter og fluorescensmærket plasma. Fluorescensintensiteterne af RBC&#39;er og plasma erhvervet langs linien scanning afsættes mod tiden til opnåelse af striber, vinklerne af hvilke er proportionale med hastigheder af en individuel RBC. Målet med denne artikel er at give en enkel og reproducerbar metode til billedbehandling og måle blodgennemstrømning hastighed inden for de enkelte blodkar i leveren og til at stille de grundlæggende værktøjer for en vellykket udførelse af mus kirurgi, IVM og kvantitative analyser af hastigheden af individuelle RBC. Thans tilgang vil give forskerne at få ny indsigt i blod hastighed under patologiske tilstande.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Alexa 647</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>A34785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC 500 mol wt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>46947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>PanPharma</td>
			<td>20434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP07KEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetedine</td>
			<td>Pharma Animal</td>
			<td>6869029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate liquid</td>
			<td>Cyanolit</td>
			<td>5833300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N&#176;: 5013</td>
			<td>Molecular machines</td>
			<td>50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm</td>
			<td>DiaPath</td>
			<td>61061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS-SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF viewer&#160;</td>
			<td>Leica software</td>
			<td>Version 3.1.0 buid 8587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics

Intravital mikroskopi (IVM) er en kraftfuld optisk billeddannelse teknik, der har gjort det muligt visualisering, overvågning og kvantificering af forskellige biologiske begivenheder i realtid og i levende dyr. Denne teknologi har i høj grad avancerede vores forståelse af fysiologiske processer og patogen-medierede fænomener i specifikke organer. I denne undersøgelse er IVM påføres muselever og protokoller er designet til at afbilde in vivo kredsløbssystemet af leveren og måle røde blodlegemer (RBC) hastighed i individuelle hepatiske fartøjer. At visualisere de forskellige fartøj undertyper, der karakteriserer den hepatiske orgel og udfører blodgennemstrømning hastighedsmålinger, er C57BL / 6-mus injiceret intravenøst ​​med en fluorescerende plasma reagens, som mærker leveren vaskulatur. IVM muliggør in vivo, realtid, måling af RBC hastighed i et bestemt fartøj af interesse. Etablering af denne metode vil gøre det muligt atundersøge lever- hæmodynamik under fysiologiske og patologiske tilstande. I sidste ende vil dette imaging-metode være vigtig for at studere indflydelsen af L. donovani infektion på hepatiske hæmodynamik. Denne metode kan anvendes på andre infektiøse modeller og museorganer og kunne forlænges yderligere præklinisk afprøvning af et lægemiddels virkning på inflammation ved at kvantificere dets virkning på blodgennemstrømningen.

Den specifikke arkitektoniske organisering af sinusoiderne i leveren kan visualiseres baseret på autofluorescerende egenskaben af dette organ (figur 1, felt B og C, grøn), intraperitoneal injektion af Hoechst for mærkning af hepatocyt kerner (figur 1B, blå) og intravenøs injektion af fluorescerende BSA til farvning af hepatiske kredsløb (figur 1C, rød). Leveren er sammensat af flere forskellige undertyper fartøj med forskellige funktioner og strukturer og størr...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics at JoVE.com

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravital Microscopy Imaging af Liver efter<em&gt; Leishmania</em&gt; Infektion: En Vurdering af Nedsat Hæmodynamik

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Billeddannelse af mus popliteale lymfeknude

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Stærkt Løst Intravital Striped-belysning mikroskopi af kimcentre

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term Intravital multiphoton Microscopy Imaging af immunceller i rask som syg Lever Brug CXCR6.Gfp Reporter Mus

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

To-foton Intravital billeddannelse af leukocytter under immunrespons i LPS-behandlede mus lever

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging celle interaktion i trakeal slimhinde under Influenza virusinfektion ved hjælp af to-foton Intravital mikroskopi

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...