Name: sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models at JoVE.com

This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

1. 3D Cell Culture och Förberedelse för Imaging <ol><li> Kultur en lämplig cellinje, dvs HCT116 kolonkarcinom cellinje, i två dimensionella, monoskiktskultur. </li><li> Väx HCT 116 celler i en T-25 kolv med McCoys 5A-medium + 10% fetalt bovint serum i en 5% CO2 inkubator tills 50-70% konfluens, som i allmänhet tar ett par dagar. </li><li> Release celler med 0,25% trypsin-EDTA-lösning och räkna en del av cellerna med användning av en hemocytometer och trypanblått-färgning för att kontrollera celltäthet och livsduglighet. </li><li> Efter räkning, späd celler med komplett medium för att uppnå en lämplig sådd densitet på 6.000 celler / brunn, eller 30.000 celler / ml. </li></ol> 2. Förbered agarosbelagda 96 brunnars plattor <ol><li> Lägg 0,19 g agaros till 10 ml standard medier i ett 50 ml koniskt rör (1,5% -ig lösning i media) 10. Säker införlivande genom försiktig blandning. Autoklavera agarosen i ett vattenbadunder 20 min. </li><li> Med hjälp av en flerkanalig pipett aspirera 50 pl av agaros + media blandningen i de 60 centrala brunnarna i flatbottnade 96 brunnar odlingsplatta. Som brunnarna vid perifera kanterna av plattan har något högre avdunstningshastigheter, tillsätt 200 | il 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i stället för agaros till dessa kanter. </li><li> När agarosen blandningen har lagts till de inre brunnarna, ställ plattan åt sidan för att svalna till ~ 37 ° C före tillsats av cellerna. </li></ol> 3. Utsäde och Tenderar den tredimensionella kultur OBS: Fler eller färre celler kan ympas beroende på kraven av kulturen inblandade, men det har fastställts att dessa betingelser resulterar i 3D cellodlings strukturer av ungefär 1 mm i diameter efter 10-14 dagars odling (data ej visade) . <ol><li> Tillsätt 200 pl av den lämpliga cellösningen (utspätt att innehålla ~ 6.000 celler) till agarosen belagda96 brunnars platta. Täck plattan och inställt i fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C för celltillväxt. </li><li> Ändra cellmedia minst varje 48 h, eller när mediet verkar vara att ändra färg. <ol><li> Ändra media genom att försiktigt suga den gamla medier från hela lilla 3D cellodling (synliga för blotta ögat vid dag 2) i botten av agarosen. Lägg 200 | il färskt medium försiktigt över 3D cellodling. </li><li> (Valfritt steg) Under dessa medieförändringar, lägger kemoterapeutika eller andra droger för att testa. Späd droger till den slutliga koncentrationen med kompletta medier och lägg de nödvändiga 200 l till varje brunn. </li><li> Övervaka 3D cellodlingstillväxt genom optiskt mikroskop, tills 3D cellkulturer är ungefär 1 mm i diameter. </li></ol></li></ol> 4. Skörda 3D Cell Cultures <ol><li> Använd en 2 ml serologisk pipett för att försiktigt ta bort 3D cellodling från agaros sängen. </li> &lt;li&gt; Tvätta 3D cellkulturerna med PBS genom att försiktigt pipettera dem i ca 1 ml PBS i en väntande 24-brunnsplatta. </li><li> Överföring skördas 3D cellkulturer via serologisk pipett till centrifugrör för protein eller metabolit utvinning, eller bädda in dem i en skärande medium för att hjälpa till att skivning för bildprogram. </li></ol> 5. Bädda 3D cellkulturer i Gelatin <ol><li> Bered en lösning av ~ 175 mg / ml gelatin i hög renhet vatten (18 Mohm dras). 22,23 Blanda gelatinet kraftigt. Observera lösningen blir trögflytande och svår att manipulera. Placera gelatininnehållande koniskt rör i ett vattenbad vid ~ 60 ° C och varm tills lösningen blir klar och lätt att aspirera. OBS: Den varma gelatinlösningen hårdnar snabbt som det svalnar, så utför alla följande steg snabbt före frysning. </li><li> Efter den uppvärmes, ta gelatinet omedelbart till cellodlings huven. Håll röret med gelatin i en beaker med förvärmt vatten vid ca 60 ° C för att undvika härdning av gelatinlösningen. </li><li> Med användning av en 2 ml serologisk pipett, deponera 0,6 ml av den varma gelatinlösningen i brunnen på en 24 flatbottnad platta. Denna volym är tillräcklig för att täcka botten i ett tunt skikt. Deponera försiktigt 3D cellkulturer omedelbart ovanpå gelatinskiktet med användning av en annan 2 ml pipett för att undvika bristning av 3D-strukturen. OBS: Man måste vara försiktig i detta skede inte placera PBS i gelatinet. Om detta händer, desto mindre att det PBS från toppen av gelatin med användning av en 200 l pipett. </li><li> Efter 3D cellkulturer är placerade på ytan av gelatinskiktet, försiktigt pipettera ytterligare 0,6 ml av den varma gelatinblandningen över 3D cellkulturer, för att inte störa positionen av kulturerna. Efter det andra skiktet är placerat, frysa gelatininbäddade 3D cellkulturer vid -80 ° C. </li></ol> 6. Skiva och Tina Mount the Gelatin-inbäddade 3D cellkulturer för Masspektrometrisk Imaging <ol><li> Ta bort 24 brunnar innehåller 3D cellkulturer från frysen. Värm botten av plattan med värmen från din hand tills en pincett eller skalpell kommer att glida försiktigt längs sidan av brunnen. </li><li> Smidigt skjut pincett eller skalpell, befria gelatinet utan att tina i mitten. Ta en vattendroppe att kryostaten stöd och använda detta för att vidhäfta gelatinskivan till bäraren. <ol><li> 3D cellkulturer inbäddade i gelatin är mest mottagliga för skivning vid -30 ° C. Rengör kryostat bladet och glas med 70% etanol före användning. Använd en annan del av bladet eller ett nytt blad för varje 3D cellodling-gelatin-skiva för att förhindra dulling av bladet. </li></ol></li><li> Använda kryostatens försiktigt möter bort överskottet gelatinet tills 3D cellkulturer blir synliga. </li><li> Vid denna punkt skär långsamt 3D cellkulturer med en mjuk rörelse i 12-16 um sektioner. OBS: Kritiska faktorer till skivning inkluderar avståndet av glaset till bladet, bladvinkeln, temperaturen i kryostaten, och vinkeln hos skivan på bäraren, så alla dessa måste kontrolleras för att säkerställa jämna resultat. </li><li> Försiktigt tina skivor och montera dem på indium titanoxid (ITO) -belagda glas märkta på lämpligt sätt och förvara den i en torkapparat. Använd skivor så snabbt som möjligt för maximal kvalitet. </li></ol> 7. Matrix Ansökan och Provberedning för MALDI Imaging <ol><li> Före MALDI imaging, förbereda skivor med lämplig matris. <ol><li> För analys av små molekyler, är inga tvättsteg i allmänhet krävs. För intakt proteindetektion, tvätta skivorna i kall 100% aceton, till Carnoys vätska, eller 70% / 95% isopropanol avlägsna små molekyler, såsom lipider som kan dölja signalen 24 -. 26 </li><li> Tvätta försiktigt för högst 30 sekunder åt gången. Gör intestöra eventuella skivor. </li></ol></li><li> Förbered matrisen i en lösning av organiskt lösningsmedel och vatten, med 0,1% TFA. För liten molekyl såsom α-cyano-4-hydroxikanelsyra (CHCA), använd 60% ACN: 40% H2O: 0,1% TFA (10 mg / ml). För proteindetektering såsom sinapinsyra (30 mg / ml), använda samma lösningsmedelslösningen. För optimal löslighet av sinapinsyra, upplöses först i acetonitril före tillsats av TFA: H 2 O lösning. Andra matriser kan användas som lämpligt. OBS: Matrix kan tillämpas med flera olika metoder, men det bör noteras vissa matriser har befunnits samverka kristallisera med gelatinet, såsom ferulsyra, rendering provet oanvändbar. Mindre kristaller producera mer konsekvent masspektra, vilket möjliggör fler molekylära species som skall detekteras och hänföras till biologiska skillnader snarare än matriseffekter. </li><li> Applicera matrisen genom handspotting metod. <ol><li> Använd en spetsig spruta för att tillämpa 0,5 ul av matrix lösningen på 3D cellodlings skiva och låt matrisen för att kristallisera. </li></ol></li><li> Alternativt kan du använda airbrush metoden. Fyll en kommersiell kvalitet airbrush med matrislösningen. <ol><li> Håll sprutan 8-12 inches bort från bilden, sikta en fin spray på skiva. I mellan passeringar, tillåta matrisen att torka i en minut för att tillåta den bästa kristallbildning. Upp till 10-20 passager av airbrush krävs för att producera en optimal skikt av matrisen 22. </li></ol></li><li> Alternativt kan du använda sublimemetoden beskrivs på annat håll. 25,27 </li><li> Torra glasen i en exsickator i minst 30 min före MALDI-MSI, oavsett vilken metod för matris ansökan. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI-analys med användning en MALDI-TOF-systemet (dvs., Autoflex III) OBS: Det här avsnittet innehåller anvisningar och råd för att sätta parametrar för en MALDI-TOF avbildning experiment. Beroende på instrument tillverkare och programvara som används, kan processen variera. <ol><li> Montera glasen i en adapter gjord för att säkert hålla 75 mm x 25 mm diabilder till bilden 3D cellodlings skivor bifogas ITO belagda diabilder. Fyll på glidadaptern i instrumentet. </li><li> Förbered instrumentet för MALDI-MSI genom att välja en lämplig kalibreringsstandard för massområdet i fråga. För förhör av små molekyler, de signaler som detekteras som motsvarar den matris som används, α-CHCA, är en gemensam grupp av kalibreringsstandarderna. För analys av proteiner, är kända protein standarder (dvs., ubiquitin, trypsinogen) i massområdet av intresse väljs och spotted intill 3D cellkulturer som kalibrerings. Kalibrera instrumentet innan du fortsätter med metodutveckling. </li><li> Före avbildning, utveckla datainsamlingsmetoder för mass valmöjligheter använder programvaran tillhandahålls av instrumenttillverkaren. Se figur 1 och 2 försmåmolekylära och protein avbildning. För liten molekyl avbildning, använd reflektronen läget för högsta massupplösning. <ol><li> Justera massintervallet för liten molekyl datainsamling mellan 100-1000 m / z och för proteiner mellan 8,000- 25,000 m / z. Justera massområdet att omfatta regionen val samtidigt som den högsta massupplösning möjligt med instrumentet. </li><li> Justera lasereffekt, frekvens, antal laserskott och punktstorlek med hjälp av kalibreringslösning och en närliggande &quot;offer&quot; 3D cellodlings skiva. Följ dessa inställningar i huvudinstrumentet styrprogram. Använd följande inställningar som en rekommenderad startpunkt: 60% power, 400 laserskott, ultra liten punktstorlek. Dessa inställningar kommer att variera mellan instrument och metoder, så optimera instrumentparametrar för att ge högsta kvalitet spektra för varje specifikt instrument. Andra parametrar som kan justeras inkluderar detektorförstärkningen, samplingshastighet, och elektronisk förstärkning. Save denna metod för användning i bildprogram (dvs.., AutoExecute metod att FlexImaging kommer att bygga på). OBS: Undertryck joner under massområde av intresse (återigen i instrumentkontroll) för att inte störa detekteringen. </li><li> Utveckla proteindatainsamlingsmetoder för mass valmöjligheter. Följ samma steg som beskrivs ovan, men för mitten till hög massintervall, över omkring 3 kd, använder linjärt läge. OBS: Inställningar kommer att skilja sig från dem som används för småmolekylära metoder. </li></ol></li><li> Setup specifika instrumentparametrar MS med hjälp av bildbehandlingsprogram tillhandahålls av instrumenttillverkaren, som FlexImaging för Bruker MALDI-TOF-system. <ol><li> Skapa en ny bild filer och mappar, med hjälp av de metoder som utvecklats före och sparat. Välj de instrumentparametrar såsom rasterpunktstorlek (förändring från standard ca 200 nm till 50 nm), inrättat instrumentstyrningsmetod (setup i steg 8.3.2 eller 8.3.3), och position där för att skanna i 3D cellodling. </li><li> Välj tre lämpliga undervisar punkter på provet, flytta lasern till var och en i tur och ordning. Skaffa den optiska fotografiet från laserstyrprogram MALDI-TOF använder &quot;print screen&quot;. OBS: Många bildbehandling program kräver en optisk fotografi av provet till &quot;lära&quot; programvaran där lasers ligger, som kan erhållas med en skanner eller ofta instrumentkameran. </li></ol></li><li> Starta sedan bildprocessen från bildbehandlingsprogram (inte instrumentkontroll) och skaffa masspektra från varje skiva. Observera flesta massorna i hela 3D-cellodling och andra lokaliserade till vissa områden. </li></ol> 9. Valfria dataanalysmetoder <ol><li> För riktad analys, utföra manuell analys av spektra genom att klicka på en massa i medelspektrum, eller låta bildbehandlingsprogram för att automatiskt plocka massor över en viss tröskel (t.ex.., Toppar above topp 20% tröskel). För kvalitetskontroll, undersöka fördelningen av matristoppar eller medelspektrum. </li><li> Utför statistiska analyser med extraherade dataset i matematisk programvara såsom R eller Matlab. <ol><li> Exportera enda spektra i ASCII-format, en läsbar textfil, för laddning i mjukvaran val. </li><li> Konvertera den individuella spektra till ASCII, mzXML, för mzML format för läsning av flera olika program, 28 -. 31 eller exportera data som en Analysera (.img)-fil, ett gemensamt format som används för andra bildprogram såsom MRI 32 Två öppen källkod alternativ för analys är MSiReader och BioMap 32,33. </li><li> När filerna exporteras till ett format som kan läsas av programvaran, ladda dataset via instruktionerna i respektive program. Efter lastning, utför efter förvärvet behandling, såsom baslinje borttagning och normalisering. </li><li> Med denna dataset, utför statistical behandlingar såsom principalkomponentanalys av hierarkisk klustring med antingen egna skript eller byggda i algoritmer i program som Matlab 18. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., R&#246;mpp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+imaging.">Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).</li><li>Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-FTICR+imaging+mass+spectrometry+of+drugs+and+metabolites+in+tissue.">MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue.</a> Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).</li><li>Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+drug+candidates+in+tissue+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).</li><li>Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+molecular+analysis+of+whole-body+animal+tissue+sections+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).</li><li>Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).</li><li>Guenther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+by+mass+spectrometry:+label-free+tissue+characterization+obtained+from+high-accuracy+bioanalytical+imaging.">Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).</li><li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+by+mass+spectrometry--looking+beyond+classical+histology.">Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. a., Kreutz, M., Knuechel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids:+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+to+study+tumour+biology.">Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology.</a> Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Fernandes, T. G., Kwon, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+a+three-dimensional,+microarray+environment+on+human+cell+culture+in+drug+screening+systems.">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).</li><li>Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry:+From+tissue+sections+to+cell+cultures.">Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).</li><li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+three-dimensional+cell+culture+systems.">Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems.</a> Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li><li>Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Therapeutics+in+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry.">Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).</li><li>Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+Mass+Spectrometry+Imaging+and+Confocal+Raman+Microscopy+for+Studies+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Sections.">Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections.</a> Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).</li><li>Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures.">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PloS one. 6 (5), 18940 (2011).</li><li>Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. a. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+protein+in+3D+neural+stem+cell+culture:+a+hybrid+visualization+methodology.">Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology.</a> J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).</li><li>He, W., Kuang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Comparison+of+3D+and+2D+Glioma+Models+Reveals+Increased+HLA-E+Expression+in+3D+Models+is+Associated+with+Resistance+to+NK+Cell-Mediated+Cytotoxicity.">Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).</li><li>Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Imaging+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).</li><li>DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+of+Neuropeptides+in+Decapod+Crustacean+Neuronal+Tissues.">Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).</li><li>Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+paper+based+tissue+washing+method+for+mass+spectrometry+imaging:+localized+washing+and+fragile+tissue+analysis.">An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Sublimation/Recrystalization+for+Imaging+Proteins+by+Mass+Spectrometry+at+High+Spatial+Resolution.">Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution.</a> Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).</li><li>Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+protein+sensitivity+for+MALDI+imaging+mass+spectrometry+after+chemical+treatment+of+tissue+sections.">Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).</li><li>Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-mass+spectrometric+imaging+for+the+investigation+of+metabolites+in+Medicago+truncatula+root+nodules.">MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules.</a> J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).</li><li>Deutsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML:+a+single,+unifying+data+format+for+mass+spectrometer+output).">mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output).</a> Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).</li><li>Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+open+representation+of+mass+spectrometry+data+and+its+application+to+proteomics+research.">A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research.</a> Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).</li><li>Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+mzXML+good+for.">What is mzXML good for.</a> Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).</li><li>Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+the+data+explosion.+A+report+on+the+HUPO-PSI+Workshop.+August+2008,+Amsterdam,+The+Netherlands.">Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands.</a> Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction.</a> Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).</li></ol>

This article is part of a special issue on Multimodal Pre-Clinical Imaging, sponsored by Bruker Biospin. The MALDI-TOF system used to obtain the representative results is a Bruker AutoFlex III.

Använda metoder som beskrivs ovan, kan 3D cellkulturer odlas och analyseras med MALDI-MSI. Många odödliga cellinjer bildar 3D strukturer när de odlas på lämpligt sätt. 9,10 Försiktighet bör vidtas för att odla celler som inte har passerat för många gånger, det vill säga har låga passagenummer. I allmänhet, celler med passagenummer tio och lägre är optimala för växande 3D cellkulturer. Växande 3D cellkulturer i en traditionell agaros stöd ger ett kostnadseffektivt sätt för forskargrupper intresserade av 3D cellodling att prova detta system. Denna metod använder få komponenter inte redan är i de flesta däggdjurscellodlings laboratorier. Noggrann uppmärksamhet måste ägnas utarbetandet av agarosplattor för tillväxt så att 3D-cellkulturer är konsekventa i storlek och form; några aspekter som kräver noggrann uppmärksamhet innefattar kontroll att inga luftbubblor är infångade till blandningen och att en ordentlig menisk bildas på botten av varje well. Om menisken inte utgör korrekt, kan cellerna växer i icke-sfäroida former eller i små klumpar. Dessutom måste man vara försiktig att inte placera PBS i gelatinet med sfäroider. Om detta händer, ta bort PBS från toppen av gelatinet med hjälp av en 200 l pipett. Om kostnaden är inte en faktor, ultralåg bindande runda bottenplattor är kommersiellt tillgängliga och erbjuda förenkling av dessa steg. Medan andra vävnads inbäddningsmetoder kan också vara kostsamma och icke-masspektrometri kompatibel, har gelatin-inbäddning visats vara både billig och mångsidig. Förberedelser strategier som anges ovan har optimerats för 3D cellkulturer för att få de högsta kvalitetsdata. Medan gelatin-inbäddning har visat sig vara kompatibla med masspektrometrianalys, gör denna process begränsa de tillgängliga matriser grund av co-kristallisering. När frysta, 3D cellkulturer är stabila i månader, så länge de inte frys tinas. Gelatinet blir ogenomskinlig när frysta, och 3D-cellenkulturer är en liknande färg, så det är lämpligt före frysning att dokumentera 3D cellodlingsplacering till stöd i skivning. När man förbereder diabilder kan matris appliceras med flera olika metoder, men det bör noteras att vissa matriser har befunnits samverka kristallisera med gelatinet, såsom ferulsyra, rendering provet oanvändbar. Mindre matriskristaller producera mer konsekvent masspektra. Medan handspotting är den enklaste metoden för matris ansökan, kan den större volymen lösningsmedel resultera i större kristallstorlekar och betydande analyt migration. Vid masspektrometer, avancerar i MALDI-MSI-teknik har minskat den kompetens som behövs för början analyser. Datainsamling och analys är enkel på de flesta system, vilket gör även en nybörjare att få information av hög kvalitet från ITO-belagda diabilder. Noggrant urval av instrumentparametrar, optimerad på närliggande icke-image värdig 3D cell cultures, är avgörande för att få data av hög kvalitet. Till exempel kan öka lasereffekt ökar toppintensitet men minskande lasereffekt kan förbättra upplösningen och ge mer symmetriska toppformer. 3D cellkulturer bör användas snabbt efter skivning för att säkerställa optimal provkvalitet. Nedbrytning av proteinsignal kan ses i mindre än en vecka utan ordentlig förvaring (exsickator / -80 ° C frys), särskilt i höga mass regionen (över 20 kDa). På grund av den växande efterfrågan, har många olika visualisering program utvecklats och är fria att allmänheten forskningen. De flesta bild Masspektrometrar har installerat programvara som krävs för att visualisera enstaka massor med proprietära format som används på varje instrument. Dessa mjukvaruprogram kan användas för att erhålla enkel-massbilder och exportera data. De flesta program kommer också att möjliggöra överlagring av två eller flera massor av intresse. Dessutom har många olika tittare för MSI uppgifter är fria att ladda ner, såsom MSiReader ettd BioMap. 32,33 masspektrometri data som erhållits får också behandlas efter förvärvet med lätthet, vilket mer användbar information i förgrunden. Från läkemedel till lipider till proteiner, systemet beskrivs ovan möjliggör snabb insamling av data för att utvärdera fördelningen av molekyler av intresse över en 3D cellodlingsstruktur. Seriella sektioner kan vidtas för att avbilda hela 3D-struktur genom att bygga från varje 2D-bild av en skiva av 3D-cellkulturen. De tekniker och anteckningar i protokollet kommer att vara till nytta för forskare som vill börja tredimensionella cellodling som en bro mellan monolager kultur och djurmodeller. När behärskar, kan dessa tekniker tillämpas på flera typer av 3D cellkulturer, vävnader och cellkulturer, där forskarna till bilden beroende på vilket prov de väljer.

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1&#8211;4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5&#8211;7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8&#8211;11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12&#8211;14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15&#8211;21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCT116 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-247</td>
			<td>Potential hazard, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McCoy&#39;s 5A media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16600-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin, unflavored</td>
			<td>Knox</td>
			<td>--</td>
			<td>Available at most grocery stores in single-packets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITO-coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Limited</td>
			<td>CG-90IN-S115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sinapic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set</td>
			<td>RoyalMax Airbrush</td>
			<td>--</td>
			<td>Many options available on sites such as Amazon.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3d cell culture models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

MSI avbildning har potential att avslöja många olika molekylfördelning i 3D cellkulturer. Med användning av metoden som beskrivs ovan, kan arter från små molekyler (Figur 1) till stora proteiner (figur 2) spåras över kulturen. Dessa resultat visar visualisering av en enda jon med gratis verktyg MSiReader. 32 Resultaten kan analyseras för enstaka joner av intresse i hela 3D cellodling med visualiseringsprogram antingen i en region av intresse eller hela skannade området. Dessutom de flesta program automatiskt visualisera joner över ett visst tröskelvärde som fastställts av användaren, vilket kan underlätta upptäckt insatser. När enstaka jon kartor erhålls, innehåller de flesta program en förmåga att överlagra bilderna för att se colocalization av joner. Antingen i upplevelsebaserade metoder eller på ett målinriktat sätt, är masspektrometri imaging ett kraftfullt verktyg för att analysera 3D cellkulturer. Figur 1. Representativa resultat från 3D cellodlingstillväxt och snittning. Left) Optisk bild av en intakt kolorektal HCT-116 3D cellodlingsstruktur sett på dag 14 före skörd. Right) Optisk bild av en ca ekvatorial bit av en kolorektal 3D cellodlings tina monteras på en ITO-belagd slide för avbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Figur 2. Representativa resultat av småmolekylära MALDI-MSI av en tvärsnitts av en 3D-cellodling. Top) Genomsnittlig vikt spektra uppnås med α-CHCA i låg massa (liten molekyl) intervall. Bottom) Representativa bilder aven enda massa: 327,8 m / z lokaliserad i första hand till det inre av 3D cellodling och 429,7 m / z primärt lokaliserad till kanten av 3D cellodling. Streckad linje visar den ungefärliga kanten av sfäroid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Figur 3. Representativa resultat av protein avbildning av MALDI-MSI av en tvärsnitts av en 3D-cellodling. Top) Genomsnittlig vikt spektra uppnås med sinapinsyra i högre (protein) massområde. Botten) Representativa bilder av en enda massa: 10871 m / z primärt lokaliserad till kanten av den sfäroid, och 12184 m / z lokaliserad mer mot det inre av sfäroid. Streckad linje visar den ungefärliga kanten av sfäroiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models at JoVE.com

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Immortaliserade cancer cellinjer kan odlas som 3D cellkulturer, en värdefull modell för biologisk forskning. Detta protokoll beskriver masspektrometri avbildning av 3D cellkulturer, inklusive förbättringar i provberedning plattform. Målet med detta protokoll är att instruera användarna att förbereda 3D cellkulturer för masspektrometrianalys avbildning.

Provberedning Strategier för masspektrometri avbildning av 3D cellodlingsmodeller

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

En enkel droppe cellodling protokoll för generering av 3D spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Beredning av 3D Fibrin ställningar för Kultur Stem Cell Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Avbildning av biologiska vävnader genom desorption elektrospray masspektrometri

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selektiv Cell Eliminering från Mixed 3D kultur med hjälp av en Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Hela kroppen masspektrometri Imaging av Infrared Matrix-assisterad laserdesorption elektrosprayjonisering (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Avstämbar Hydrogeler från Lung Extracellulär Matrix för 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Byggandet av ett Multilayered mesenkymala stamceller blad med ett 3D dynamisk kultur System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

En mänsklig 3D extracellulär matrix-Adipocyte kultur modell för att studera Matrix-cell metabola överhörning

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantifiering av utvalda kynukreniner analyserade av flytande kromatografi-masspektrometri i medium som samlats in från cancercellkulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...