Name: human pluripotent stem cell based developmental toxicity assays for chemical safety screening and systems biology data generation
Uploaded: 2015-06-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation at JoVE.com

We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia B&#246;ttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).

Le protocole suivant a été réalisée en utilisant la ligne Embryonic Stem Cell humaine (CSEh) H9. Cette lignée cellulaire a été cultivées en routine sur des fibroblastes de souris mitotiquement inactivé embryonnaires (MEF) dans les milieux de culture de CSEh complété avec bFGF puis cultivées dans des milieux de cellules souches sur 6 cm boîtes de Pétri revêtues de la matrice de la membrane basale comme matrigel, de se débarrasser de MEF. Les cellules H9 de&gt; 80% de plaques co...

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	<li>Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+for+Drug+Discovery+and+Toxicology+Studies.">Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).</li><li>Zuba-Surma, E. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+and+disturbed+neural+development+in+a+human+embryonic+stem+cell-based+model+relating+to+the+fetal+valproate+syndrome.">Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).</li><li>Smirnova, L., Hogberg, H. 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J., Pavelic, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+drug+discovery.">Accelerating drug discovery.</a> EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).</li></ol>

Les approches traditionnelles de tests toxicologiques impliquent de vastes études animales rendant ainsi tests coûteux et chronophage. En outre, en raison des différences entre les espèces les études de sécurité précliniques animale ne sont pas toujours valable pour prédire les effets de la toxicité des médicaments potentiels pertinents pour les humains. Bien que les primates non-humains sont le plus prévisible, encore forte éthique, et les demandes socioeconomical élèvent rapidement par les sociétés mo...

La capacité des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à se différencier en divers types de cellules a ouvert une nouvelle ère de tests de toxicité in vitro 1, modélisation de la maladie et la médecine régénérative 2. Les cellules souches sont dotés de la capacité de se reproduire, de garder leur état ​​pluripotent, et de se différencier en cellules spécialisées 3,4. Les propriétés de CSEh (capacité de se différencier à tous les principaux types de cellules) se trouvent également dans d&#39;autres cellules souches pluripotentes humaines, telles que les cellules d&#39;origine humaine souches pluripotentes (hiPSC) ou des cellules générées par transfert nucléaire 5. Par exemple, de nombreuses lignées de CSEh différents ont été différenciées en neurones 6, 7 cellules rénales, des cellules de la crête neurale 8, 9-12, cardiomyocytes ou des hépatocytes comme les cellules 13,14. En outre, les CSEh peut spontanément se différencier en cellules de tous les trois feuillets embryonnaires 15-18 en corps embryoïdes (EBS) 19,20. Ele développement embryonnaire Arly est réglementé par l&#39;expression différentielle de divers gènes liés aux différentes couches de germe qui a été capturé au niveau ARNm par la transcriptomique utilisant la technologie des puces 15. Ces efforts ont abouti à l&#39;établissement de modèles toxicologiques spécifiques orgue basés sur les CSEh / hiPSC et d&#39;analyse transcriptomique (pour revue, voir 21,22). Ces modèles ont des avantages sur l&#39;utilisation traditionnelle des animaux de laboratoire pour les études toxicologiques, les études précliniques utilisant des animaux de laboratoire ne sont pas toujours prédictives de la sécurité humaine. Les effets toxiques des médicaments induite rencontrés chez les patients sont souvent liés à des processus métaboliques ou signalisation qui diffèrent entre les humains et les animaux de laboratoire. La différence de l&#39;espèce a empêché la détection précoce et fiable de toxicité pour le développement chez l&#39;homme, et pour les médicaments d&#39;instance comme la thalidomide 23,24 et 25,26 diéthylstilbestrol ont été retirés du marché en raison de tératogénicité. ThaliDomide n&#39;a pas montré de toxicité pour le développement chez les rats ou les souris. Produits chimiques environnementaux tels que le mercure de méthyle 27 ont abouti à la toxicité pour le développement prénatal par rapport au système nerveux chez diverses espèces, mais les manifestations humaines ont été difficiles à modéliser des animaux. Pour résoudre le problème des questions de spécificité d&#39;espèce, les scientifiques travaillant sous différents projets basés sur les cellules souches comme ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc. sont engagés dans le développement de différents modèles de toxicité embryonnaire, neurotoxicité, cardiotoxicité, l&#39;hépatotoxicité et néphrotoxicité utilisant toxiques humains suspectés de affecter les humains. Dans le cadre du projet de consortium européen «embryonnaire Novel Stratégies alternatives de tests à base de cellules souches (ESNATS) &#39;cinq systèmes de test ont été établis. Un système de test que l&#39;on appelle UKK (U niversitäts k linikum K OLN) système de test capture partiellement développement embryonnaire humaine tôt. Dans cette smeactuel cellules H9 embryonnaires humaines sont différenciés en trois feuillets embryonnaires (ectoderme, l&#39;endoderme et le mésoderme) 15 et de la couche de germe signatures spécifiques ont été capturés par transcriptomique profil en utilisant la plateforme de biopuces Affymetrix. Divers toxiques pour le développement comme la thalidomide 28, l&#39;acide valproïque, le mercure de méthyle 16,17 ou cytosine arabinoside 15 ont été testés dans ce système, et les signatures de gènes toxiques spécifiques ont été obtenus. Dans un second système de test, que l&#39;on appelle la (U niversité de K onsta n z) UKN1 système de test 1, les cellules H9 sont différenciées aux cellules progénitrices neuroectodermique (NEP) pour 6 jours. Ceci est démontré par une expression élevée de gènes marqueurs neuronaux tels que PAX6 et OTX2. Pendant la différenciation pour 6 jours, les cellules NEP ont été exposés à des neuro-toxiques pour le développement tels que l&#39;APV, le mercure de méthyle. Toxique profils spécifiques déréglementés transcriptomique ont été obtenie ainsi en utilisant la plate-forme de puces à ADN Affymetrix 16,29. La nouvelle vision de la toxicologie de la 21 ème siècle prévoit que les systèmes de test ne donnent pas seulement des descriptions phénotypiques comme histopathologie in vivo, ou des modifications du transcriptome à la fin de incubations de produits toxiques à long terme. Il suggère plutôt que les essais fournissent des informations mécaniste 3, et que ces informations peuvent être mappées à ce qu&#39;on appelle les voies d&#39;issue défavorable (AOP) qui fournissent une justification scientifique pour les effets dangereux 30. Pour fournir de telles informations, les systèmes de test appliquées doivent être hautement de qualité contrôlée 31, comme par exemple documenté par des procédures de fonctionnement standard robustes. En outre, les changements dépendant du temps doivent être mappé avec une grande résolution. Cela nécessite des systèmes de test avec des changements synchronisés 32. Les systèmes de test et UKN1 UKK décrits ici ont été optimisés pour ces exigences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320082</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td>MEM Nonessential Amino Acids Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-0144</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V bottom plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0483</td>
			<td>Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vbottom plate lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-0011</td>
			<td>Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Penicillin- Streptomycin, Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15230-089.</td>
			<td>Sterile Distilled Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2 (bFGF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003AF-100UG</td>
			<td>Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>Stericup-GP, 0.22 &#956;m, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro EZPassageTM Disposablte</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23181010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>354277</td>
			<td>5 ml vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td>Cell strainer with 70 &#956;m Nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &#956;m Lid cell strainer, 5 ml tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile Polypropylene tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10296010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well optical bottom plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Blue</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apotransferin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Worthington Biochemicals</td>
			<td>LS002104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10829-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>719-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris Biosciences</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Tocris Biosciences</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List of Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>900721, 22, 23</td>
			<td>This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase-Free DNase Set</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">List of equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genechip Hybridisation Oven - 645</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genechip Fluidics Station-450</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M5</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>List of softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affymetrix GCOS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partek Genomic Suite 6.25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online tools for Functional annotation 
			DAVID 
			Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human pluripotent stem cell based developmental toxicity assays for chemical safety screening and systems biology data generation

Protocoles efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines à divers tissus en combinaison avec les technologies -omiques ouvert de nouveaux horizons pour les tests in vitro de toxicité de médicaments potentiels. Pour fournir une base scientifique solide pour ces essais, il sera important d&#39;obtenir des informations quantitatives sur l&#39;évolution dans le temps de développement et sur les mécanismes de régulation sous-jacents par des approches de biologie des systèmes. Deux essais ont donc été à l&#39;écoute ici pour ces exigences. Dans le système d&#39;essai UKK, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) (ou d&#39;autres cellules pluripotentes) sont laissés à différencier spontanément pendant 14 jours dans des corps embryoïdes, afin de permettre la génération de cellules des trois couches germinales. Ce système récapitule les principales étapes du développement embryonnaire humaine début, et il ne peut prédire la toxicité embryonnaire précoce / tératogénicité humain spécifique, si les cellules sont exposées à des produits chimiques lors de la différenciation. Le système de test est fondé sur UKN1 hESC différenciation à une population de neuroectodermale progénitrices (NEP) cellules pour 6 jours. Ce système récapitule le développement neural précoce et prédit la neurotoxicité développementale précoce et les changements épigénétiques provoqués par des produits chimiques. Les deux systèmes, en combinaison avec des études transcriptome de puces à ADN, sont appropriées pour l&#39;identification de biomarqueurs de toxicité. En outre, elles peuvent être utilisées en combinaison pour générer des données d&#39;entrée pour l&#39;analyse de biologie des systèmes. Ces systèmes de test ont des avantages sur les études toxicologiques traditionnels nécessitant de grandes quantités d&#39;animaux. Les systèmes de test peuvent contribuer à une réduction des coûts de développement des médicaments et l&#39;évaluation de la sécurité chimique. Leur combinaison éclaire en particulier sur les composés qui peuvent influer sur le développement neurologique spécifiquement.

L&#39;exposition au méthylmercure dans le système de test UKK L&#39;essai de cytotoxicité a été effectué avec H9 EB pour obtenir une valeur de CI 10 (réduction de la viabilité de 10%) pour la cytotoxicité de mercure de méthyle (figure 1). Nous avons également effectué une puce à base (plate-forme Affymetrix) étude de biomarqueurs. L&#39;EB H9 ont été exposées au mercure de méthyle (0,25 et 1 uM) pendant 14 jours. Au jour 14, des échantillons ont...

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Les protocoles décrivent deux vitro systèmes de test de toxicité sur le développement dans (UKK et UKN1) basée sur les cellules souches embryonnaires humaines et des études de transcriptome. Les systèmes de test prédisent risque de toxicité pour le développement humain, et peuvent contribuer à réduire les études sur les animaux, les coûts et le temps requis pour l&#39;essai de la sécurité chimique.

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

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Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

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Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

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Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

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