Name: an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

نحن نتقدم بخالص الشكر الدكتور سيندي N. تشيو للمساعدة في هلام الكهربائي، واندي تشو ومايكل Grodick للتبرع السخي من الحمض النووي وانزيم قيود. ونحن نعترف بامتنان أستاذ J. هيث وأستاذ D. بروبير للوصول السخي على المعدات والمواد. نشكر الدكتور كارن Sorasaenee للحصول على اقتراحات مفيدة. نشكر ماري H. تانغ لخلق التوضيح المستخدمة في العرض التخطيطي في شريط الفيديو. تم توفير التمويل من قبل جونسون آند جونسون وUSC Y86786.

ملاحظة: عند العمل مع RNA الحفاظ على بيئة عمل نظيفة لتجنب التلوث الدناز وريبونوكلياز الإنزيمات التي تحط من DNA و RNA. ضمان نصائح ماصة والأنابيب هي الدناز وريبونوكلياز الحرة. ومن المفيد أيضا لمسح أسفل الأسطح المختبر والمعدات مثل الماصات، وأصحاب أنبوب، وما إلى ذلك مع حل إزا?...

يوضح هذا الاختبار أن إضافة جورجيا (tpfc) يمنع النسخ RNA نسبيا إلى الحمض النووي ملزم المجمعات المضادة للسرطان المعروف أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. سلوك السامة للخلايا من جورجيا (tpfc) (GI 50 = 58،1 حتي 154،7 ميكرومتر) قد ونظرا لخواصها مثبطة. منذ لم يلاحظ أي تثبيط النسخ في tpf...

غالبا ما ينطوي العلاج الكيميائي واسعة الطيف وكلاء السامة للخلايا مع آثار جانبية غير مرغوب فيها واستهداف محدود، ولكن مع مزيد من الفهم بيولوجيا السرطان، هناك الطلب المتزايد على وكلاء المضادة للسرطان مع ارتفاع فعالية استهداف السرطان وآثار جانبية أقل. 1 الخلايا السرطانية البشرية أصبحت في كثير من الأحيان تعتمد على الجين الورمي واحد المنشط أو overexpressed من أجل البقاء 2 وهكذا.، يتم تقييم العديد من الأدوية المضادة للسرطان من خلال قدرتها على تثبيط RNA النسخ. العلاجات التي تمنع التعبير عن هذه الجينات تحويل فعالة في القضاء على الخلايا السرطانية وتؤدي إلى موت الخلايا. 3 خلايا تحولت هي أكثر حساسية للاضطرابات في RNA النسخ من والمقابلة الخلايا الطبيعية. 4 الأدوية المضادة للسرطان التي تمنع النسخ من المتوقع أن تمنع بشكل انتقائي التعبير عن الجينات المسرطنة والتي هي ضرورية للخلية السرطانية إلى البقاء على قيد الحياة. 5 وبالتالي، RNA النسخ طnhibition هو وسيلة مفيدة لتحديد المرشحين المحتملين المضادة للسرطان المخدرات ومعرفة المزيد عن آلية عملها. يوضح هذا البروتوكول الذي الجا (tpfc) يمنع النسخ RNA على نفس الترتيب كما أدوية العلاج الكيميائي أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. مقارنات مماثلة يمكن إجراؤها باستخدام هذا البروتوكول مع غيرها من المرشحين المضادة للسرطان المخدرات. أكتينوميسين D هو النسخ مثبط RNA التي تستخدم عادة لعلاج السرطان الحمل الأرومة الغاذية، وسرطان الخصية، ورم WILM، وrhabdomyosacoma، وساركوما 6 في يوينغ. تم أكتينوميسين D المستخدمة في علاج السرطان منذ ما يقرب من خمسين عاما منذ أن تم الموافقة عليها من أول مرة من قبل ادارة الاغذية والعقاقير في 1964.Triptolide هو المانع النسخ الانتقائي التي تم التحقيق فيها في التجارب المختبرية ومختلف النماذج الحيوانية الحاملة للورم لمدة 30 عاما. 7 طبيعة macrocyclic محبة للجهتين من corroles يضفي مزايا هامة على أصناف الأدوية الأخرى مثل جزيئات صغيرة أو البيولوجيةالصورة. يسمح 8-14 الحرف macrocyclic لنفاذية الخلوية أكبر من المتوقع لمثل هذه الجزيئات الكبيرة، وكانت كبيرة بما يكفي للتفاعل مع أسطح الجزيئات، مثل تلك البروتينات. ومن المعروف 8 Corroles على شكل مجمعات noncovalent ضيقة مع الجزيئات الحيوية والمخدرات. 10 وبالإضافة إلى سمية الخلايا الكامنة في إطار corrole، لقد أثبتنا أن أعمال corrole المسلفنة كما جزيء الناقل عن وكلاء العلاج الكيميائي، وتحديدا أنثراسيكلين دوكسوروبيسين المخدرات الإقحام DNA. عندما تعطى معه في corrole المسلفنة مع دوكسوروبيسين، لوحظ وجود زيادة 3 أضعاف في IC 50 من دوكسوروبيسين لDU-145 الخلايا. 9 الإطار corrole مستقر ولديه الكامنة الامتصاصية ومضان الخصائص التي، عندما بين functionalized، الخضوع لتحولات الامتصاصية فريدة والتي يمكن استخدامها لتوصيف 10 Functionalization من السقالة لا affec بطبيعتهار خصائص photophysical من corrole، 9-15 ولكن، كما رأينا مع corrole المسلفنة، وتعديل انتقائي إطار corrole يمكن أن تتغير بشكل كبير خصائصه البيولوجية (16). ونحن تقييمها من قبل ستة metallocorroles ضد سبعة خطوط الخلايا السرطانية البشرية. وتشير النتائج إلى أن سمية تجاه الخلايا السرطانية البشرية تعتمد على أيون الفلز محددة، فضلا عن استبدال مجموعة وظيفية. على سبيل المثال، corroles الغاليوم المسلفنة شهدت امتصاص الخلوية عالية وتوغلت بشكل انتقائي في نواة الدماغ خلايا سرطان البروستاتا النقيلي (DU-145)؛ الخلايا نفسها corrole، على الرغم من أنها لا تخترق نواة من خطوط الخلايا الأخرى، يسلك أكبر سمية الخلايا لسرطان الثدي (MDA-MB-231)، سرطان الجلد (SK-MEL-28)، والمبيض (OVCAR-3) السرطان من ل سرطان البروستاتا. 9 المقايسات خلية القاعدة الأولية تشير إلى أن هذه المركبات تظهر الوعد كما المضادة للسرطان العوامل العلاجية، والتي تستحق فورثالتحقيق إيه في آلية العمل. ويلاحظ النسخ تثبيط مع بعض المجمعات الفلزية العضوية 17-27 وسعينا لدراسة هذه العملية كآلية محتملة لسلوك السامة للخلايا من عائلة corrole. يوفر هذا الاختبار النسخ طريقة واضحة وغير مكلفة، وسطحي لتقييم تثبيط النسخ، الأمر الذي سيؤدي إلى مزيد من المعلومات التفصيلية حول آثار هذه الجزيئات في الخلايا الحية. هنا، وتثبيط النسخ من الغاليوم (III) 5،10،15- يتم اختبار (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc)) والتناظرية فريبيس لها 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (الشكل 1). وخلافا لبعض المجمعات المعدن الانتقالية، الغاليوم (III) غير نشط الأكسدة ويست متورطة مباشرة في عملية الأكسدة من المسارات الأيضية القائم على الأكسدة وبالتالي 28 بغض النظر، الغاليوم (III) لا يحمل خصائص السامة للخلايا، وقد تم التحقيق لأغراض علاجية. الغاليوم هو ثاني أكثر المعادن واعد للعلاجات المضادة للسرطان بعد البلاتين وشهدت العديد من الدراسات والتحقيقات؛ وقد تم تقييم النترات والأملاح كلوريد الغاليوم في التجارب السريرية ضد الكبدي، سرطان الغدد الليمفاوية، سرطان المثانة، وأمراض أخرى. 29-34 الغاليوم (III) هو بالتالي مثالية للالمضادة للسرطان دراسات corrole. وتشير البيانات الأولية جورجيا (tpfc) وtpfc لديهم انخفاض GI 50، وتركيز الدواء الضروري لمنع 50٪ من تكاثر الخلايا القصوى، مع مختلف خطوط الخلايا السرطانية (انظر الشكل 2)؛ هذا يؤكد صحة مزيد من التجارب على هذين المركبين لتحديد خصائصها مثبطة. قارنا هذه المركبات مع الأدوية المضادة للسرطان شيوعا أكتينوميسين D وتريبتوليد triptolide. أكتينوميسين D intercalates DNA، RNA يمنع استطالة، ويدفع الخلايا في خلية خط معين في تركيزات بيكو مولي أظهرت 6،35-37 تريبتوليد triptolide لمنع نمو الورم؛ فإنه يلزم لXPB البشرية / ERCC3، وس فرعيةعامل و النسخ TFIIH، مما يؤدي إلى تثبيط RNA البلمرة II النشاط. 6-7،38-40 بينما هو معلوم أن corroles يحمل خصائص السامة للخلايا، هناك القليل من المعلومات عن مختلف آليات الناشئة عن functionalization. أن تثبيط Corrole من الحمض النووي الريبي النسخ تقديم مزيد من التبصر في تفاعلها مع الجزيئات الكبيرة الحيوية. المجمعات الأخرى المعروفة لربط الحمض النووي، مثل dirhodium (II، II) المجمعات والكروم (III) المجمعات، الروثينيوم (II) المجمعات polypyridyl، الروديوم (III) المجمعات، وغيرها مختلف، تعرضوا لفحوصات الحمض النووي الريبي النسخ، 18- 27 مما أدى إلى فهم أكبر لتفاعلها مع الجزيئات الكبيرة الحيوية. هذه التجربة السهلة والمتاحة على نطاق واسع هي أيضا اختبار أولي جيد لتقييم خصائص سمية الخلايا من جزيء معين، وتحديد ما إذا كانت مزايا الاختبار مزيد البيولوجي. الفحص RNA النسخ يسمح أيضا للعديد من التعديلات، مثل varyinز كمية من مركب أو الإنزيمات المستخدمة؛ متفاوتة فترة الحضانة وفترة رد الفعل ونقاط الوقت عينة. ومتفاوتة DNA طول قالب وتسلسل، وبين المتغيرات الأخرى ذات الاهتمام، وبالتالي يحتمل توفير كمية كبيرة من البيانات. هذا الاختبار النسخ هو أيضا متاحة بسهولة إلى مجموعات بأسعار معقولة مع جميع المكونات رد فعل الضرورية المقدمة، على الرغم من أن مكونات يمكن شراء وأعد بشكل فردي. في هذه التجارب، ونحن نستخدم مجموعة المتاحة تجاريا المعروف أن ارتفاع العائد. 41 لتقييم النسخ تثبيط، ونحن نستخدم طريقتين: الاغاروز الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة بسيطة وفعالة لفصل وتحديد، وتنقية 0.5- إلى DNA و RNA شظايا 25 كيلو بايت. يمكن استخدام 42 UV-فيس التحليل الطيفي لتحديد التركيز والنقاء من الحمض النووي الريبي. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

غالبا ما ينطوي العلاج الكيميائي واسعة الطيف وكلاء السامة للخلايا مع العديد من الآثار الجانبية واستهداف محدود. Corroles هي فئة من macrocycles tetrapyrrolic التي تظهر خصائص التفاضلية تثبيط الخلايا والسامة للخلايا في خطوط خلية معينة، اعتمادا على هويات المعادن بالكلاب والمجموعات الوظيفية. سلوك فريد من corroles بين functionalized نحو خطوط معينة من الخلايا يقدم إمكانية العلاج الكيميائي المستهدفة. يتم تقييم العديد من الأدوية المضادة للسرطان من خلال قدرتها على تثبيط RNA النسخ. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لRNA النسخ في وجود مثبطات المعروفة والمحتملة. تقييم المنتجات RNA من رد فعل النسخ التي كتبها الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي يوفر معلومات عن خصائص مثبطة للمرشحين المحتملين المضادة للسرطان المخدرات و، مع تعديلات على الفحص، أكثر حول آلية عملها. القليلومن المعروف عن الآلية الجزيئية عمل السمسة corrole. في هذه التجربة، ونحن نعتبر مجمعين corrole: الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc)) والتناظرية فريبيس 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole (tpfc). واستخدمت مقايسة RNA النسخ لدراسة خصائص مثبطة للcorroles. وقد أعدت خمسة ردود الفعل النسخ: DNA تعامل مع أكتينوميسين D، تريبتوليد triptolide، جورجيا (tpfc)، tpfc في [معقدة]: [قاعدة DNA قالب] نسبة 0.01، على التوالي، وعنصر تحكم غير المعالجة. وقد تم تحليل ردود الفعل النسخ بعد 4 ساعات باستخدام الاغاروز الكهربائي هلام والأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي. هناك تثبيط واضح من قبل جورجيا (tpfc)، أكتينوميسين D، وتريبتوليد triptolide. يمكن تعديل هذا الاختبار RNA النسخ لتقديم المزيد من التفاصيل الآلية من خلال تغيير تركيزات مجمع المضادة للسرطان، DNA، أو إنزيم البلمرة، أو التي يحتضنها DNA أو البلمرة مع مجمعاتXES قبل RNA النسخ؛ ان هذه التعديلات يفرق بين آلية تثبيط تنطوي على DNA أو الانزيم. واضاف ان المجمع بعد RNA النسخ يمكن استخدامها لاختبار ما إذا كان المجمعات تتحلل أو يتحلل الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا أن هذا الاختبار أن تستخدم لدراسة المرشحين المضادة للسرطان إضافية.

RNA النسخ نوعيا المقررة من قبل الاغاروز جل الكهربائي ويستخدم الاغاروز الكهربائي للهلام لصورة RNA كتب. إيثيديوم بروميد تتفلور على ملزمة (λ م = 605 نانومتر، λ = 210 نانومتر السابق، 285 نانومتر) 46 التصوير السماح من...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

الغاليوم (III) 5،10،15- (تريس) pentafluorophenylcorrole ونظائره فريبيس تظهر منخفضة السمية لخلايا مكرومولي. توضح هذه المخطوطة على رد فعل النسخ RNA، RNA التصوير مع إيثيديوم بروميد ملطخة هلام، وقياس RNA مع الأشعة فوق البنفسجية فيس التحليل الطيفي، من أجل تقييم النسخ تثبيط من قبل corroles وتبين طريقة واضحة لتقييم الخصائص المضادة للسرطان مرشح.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الأنزيمية الفحص لقياس النسخ تثبيط من قبل الغاليوم (III) وH<sub&gt; 3</sub&gt; 5،10،15-تريس (pentafluorophenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; بصري منصة لاختبار العدسات اللاصقة

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

مقايسة معياريه وقابله للتطوير لدراسة الخلايا الغشائية ثلاثية الابعاد المشتقة من iPSC في المختبر

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...