Name: an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

Vi oprigtigt takke Dr. Cindy N. Chiu om hjælp med gelelektroforese, og Andy Zhou og Michael Grodick for deres generøse donation af DNA og restriktionsenzym. Vi takker professor J. Heath og professor D. Prober for generøse adgang til udstyr og materialer. Vi takker Dr. Karn Sorasaenee for nyttige forslag. Vi takker Mary H. Tang for at skabe illustrationen anvendes i den skematiske oversigt i videoen. Finansieringen blev leveret af Johnson &amp; Johnson og USC Y86786.

BEMÆRK: Når du arbejder med RNA opretholde et rent arbejdsmiljø at undgå forurening med DNase og RNase enzymer, der nedbryder DNA og RNA. Sørg for, at pipettespidser og rør er DNase og RNase gratis. Det er også nyttigt at tørre ned lab overflader og udstyr såsom pipetter, rørholdere mv med en dekontaminering løsning. 1. RNA-transkription med Corrole Behandling <ol><li> Forbered corrole og inhibitorforbindelser i et 0,01: 1 molforhold [kompleks]: [DNA]. BEMÆRK: I vores ti...

Dette assay demonstrerer, at tilsætningen af ​​Ga (tpfc) inhiberer RNA-transkription sammenligneligt med de kendte DNA-bindende anticancer komplekser Actinomycin D og triptolide. Den cytotoksiske adfærd Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 til 154,7 uM) kan på grund af sin inhibitive egenskaber. Da ingen transkription inhibering blev observeret i tpfc, cytotoksicitet tpfc ikke skyldes RNA-transkription hæmning men er forårsaget af andre midler endnu ikke undersøgt. I de fire transkri...

Kemoterapi involverer ofte bredspektrede cytotoksiske midler med uønskede bivirkninger og begrænset målretning, men med større forståelse af cancer biologi, er der et stadigt stigende behov for anticancermidler med højere cancer-targeting effekt og færre bivirkninger. 1 cancerceller Menneskelige ofte blevet afhængige af en enkelt aktiveres eller overudtrykt onkogen for overlevelse. 2 er således mange anticancerlægemidler vurderes efter deres evne til at inhibere RNA-transkription. Behandlinger, der blokerer ekspression af disse transformerende gener er effektiv til at eliminere cancerceller og føre til celledød. 3 Transformerede celler er mere følsomme over for forstyrrelser i RNA-transkription end der tilsvarende normale celler. 4 anticancerlægemidler, der hæmmer transkription forventes at selektivt inhiberer ekspression af onkogener, som er nødvendige for cancercelle at overleve. 5 Følgelig RNA-transkription inhibition er en nyttig måde at identificere potentielle anticancer lægemiddelkandidater og lære mere om deres virkningsmekanisme. Denne protokol viser, at Ga (tpfc) hæmmer RNA-transkription på samme rækkefølge som kemoterapi narkotika Actinomycin D og triptolide; lignende sammenligninger kan foretages ved hjælp af denne protokol med andre anticancer lægemiddelkandidater. Actinomycin D er en RNA-transkription inhibitor almindeligt anvendt til behandling gestational trophoblastic cancer, testikelkræft, Wilms tumor, rhabdomyosacoma og Ewings sarkom 6. Actinomycin D har været anvendt i cancerterapi i næsten 50 år, siden den først blev godkendt af FDA i 1964.Triptolide er en selektiv transkription inhibitor, er blevet undersøgt in vitro og i forskellige tumorbærende dyremodeller for 30 år. 7 Den amfifile makrocykliske karakter corroles bibringer væsentlige fordele i forhold til andre lægemiddelklasser, såsom små molekyler eller biologiskes. 8-14 den makrocykliske karakter tillader cellulær permeabilitet, der er større end forventet for sådanne store molekyler, og de ​​er store nok til at interagere med makromolekylære overflader, såsom dem af proteiner. 8 Corroles er kendt for at danne tætte ikke-kovalente komplekser med biomolekyler og lægemidler. 10 Ud over den iboende cytotoksicitet corrole ramme, har vi vist, at en sulfoneret corrole virker som et bærermolekyle for kemoterapeutiske midler, specifikt DNA-interkalerende anthracyclin lægemiddel doxorubicin. Når den sulfonerede corrole blev administreret samtidig med doxorubicin blev en 3-fold forøgelse i IC 50 af doxorubicin observeret for DU-145-celler. 9 corrole ramme er stabil og har iboende absorbans og fluorescensegenskaber at når funktionaliseret, undergår unikke absorbans skift der kan anvendes til karakterisering. 10 funktionalisering af stilladset ikke selv affect de fotofysiske egenskaber af corrole, 9-15, men som set med en sulfoneret corrole, selektivt modificere for rammerne af corrole kan væsentligt ændre sine biologiske egenskaber. 16. Vi har tidligere vurderet seks metallocorroles mod syv menneskelige kræftceller. Resultaterne indikerer, at toksicitet mod humane cancerceller er afhængig af det specifikke metal ion, såvel som funktionelle gruppe substitution. For eksempel sulfonerede gallium corroles oplevet høj cellulær optagelse og trængte selektivt i kernen i hjernen metastatisk prostatacancer celler (DU-145); samme corrole, selvom det ikke trænger ind i kernen af ​​andre cellelinjer udviser større cytotoksicitet for brystkræft (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) og ovarie (OVCAR-3) cancerceller end for prostatacancer. 9 Indledende cellebaserede assays indikerer, at disse forbindelser viser lovende som anti-cancer terapeutiske midler, som fortjener FürthER undersøgelse af virkningsmekanismen. Transskription hæmning observeres med visse organometalliske komplekser 17-27 og vi søgte at undersøge denne proces som en mulig mekanisme for den cytotoksiske adfærd corrole familie. Denne transskription assay giver en enkel, billig og letkøbt metode til vurdering af transskription hæmning, hvilket vil føre til mere detaljerede oplysninger om virkningerne af disse molekyler i levende celler. Her transskription hæmning af gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og dens Freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) testes. I modsætning til nogle overgangsmetalkomplekser, gallium (III) er redox inaktiv og derfor ikke er direkte involveret i redox proces med redox-baserede metaboliske veje. 28. Uanset, gallium (III) har cytotoksisk egenskaber og er blevet undersøgt til terapeutiske formål. Gallium er den anden mest lovende metal til anticancer lægemidler efter platin og har gennemgået mange undersøgelser og undersøgelser; nitrat og klorid gallium salte er blevet evalueret i kliniske forsøg mod hepatom, lymfom, blære kræft og andre sygdomme. 29-34 Gallium (III) er derfor ideel til anticancer corrole studier. Indledende data viser Ga (tpfc) og tpfc har lav GI 50, den nødvendige koncentration lægemiddel for at inhibere 50% af maksimal celleproliferation, med forskellige cancercellelinier (se figur 2); dette bekræfter gyldigheden af ​​yderligere forsøg på disse to forbindelser for at bestemme deres inhibitive egenskaber. Vi sammenligner disse forbindelser med de fælles lægemidler mod cancer Actinomycin D og triptolide. Actinomycin D interkalerer DNA, inhiberer RNA forlængelse, og inducerer apoptose i visse cellelinie ved picomolære koncentrationer 6,35-37 Triptolide har vist sig at hæmme tumorvækst.; det binder til humant XPB / ERCC3 en underenhed of transkriptionsfaktor TFIIH, hvilket fører til hæmning af RNA-polymerase II-aktivitet. 6-7,38-40 Selv om det er almindeligt kendt, at corroles udviser cytotoksiske egenskaber, der findes kun få oplysninger om de forskellige mekanismer, der følger af funktionalisering. Corrole hæmning af RNA-transkription vil give større indsigt i deres interaktion med biomakromolekyler. Andre komplekser vides at binde til DNA, såsom dirhodium (II, II) komplekser, chrom (III) komplekser, ruthenium (II) polypyridyl komplekser, rhodium (III) komplekser, og forskellige andre blev udsat for RNA-transkription assays, 18- 27 medfører større forståelse for deres samspil med biomakromolekyler. Denne letkøbt og bredt tilgængelige eksperiment er også en god indledende test for at vurdere cytotoksicitet egenskaber af en given molekyle og afgøre, om det fortjener yderligere biologisk test. Den RNA-transkription assay også giver mulighed for mange modifikationer, såsom varying mængden af ​​forbindelsen eller enzymer; variere inkubationstiden, reaktionstid og Prøvetidspunkter; og varierende DNA-skabelonen længde og sekvens, blandt andre variabler af interesse, hvilket potentielt giver en stor mængde data. Denne transskription assay er også let tilgængelige som overkommelige kits med alle nødvendige reaktionskomponenter forudsat, selvom dele kan købes og udarbejdes individuelt. I disse eksperimenter bruger vi et kommercielt tilgængeligt kit kendt for at have et højt udbytte. 41 For at vurdere transkription hæmning, bruger vi to metoder: agarosegelelektroforese og UV-VIS spektroskopi. Agarosegelelektroforese er en enkel og effektiv metode til at adskille, identificere og oprense 0,5- til 25-kb DNA-og RNA-fragmenter. 42 UV-Vis-spektroskopi kan anvendes til at bestemme koncentrationen og renheden af RNA. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Kemoterapi indebærer ofte bredspektrede cytotoksiske midler med mange bivirkninger og begrænset målretning. Corroles er en klasse af tetrapyrroliske makrocykler der udviser differentielle cytostatiske og cytotoksiske egenskaber i specifikke cellelinier, afhængigt af identiteten af ​​den chelaterede metal og funktionelle grupper. Den unikke opførsel af funktionaliserede corroles til specifikke cellelinier indfører en mulighed for målrettet kemoterapi. Mange anticancerlægemidler evalueres ved deres evne til at inhibere RNA-transkription. Her præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen for RNA-transkription i nærvær af kendte og potentielle inhibitorer. Evalueringen af ​​RNA produkter af transkription reaktion ved gelelektroforese og UV-Vis spektroskopi giver oplysninger om inhibitive egenskaber af potentielle anticancer lægemiddelkandidater, og med modifikationer af analysen, mere om deres virkningsmekanisme. Lilleer kendt om den molekylære virkningsmekanisme af corrole cytotoksicitet. I dette forsøg ser vi to corrole forbindelser: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) og Freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). En RNA-transkription-assay blev anvendt til at undersøge de inhiberende egenskaber corroles. Fem transkriptionsreaktioner fremstillet: DNA behandlet med Actinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc på en [kompleks]: [template DNA basen] forhold på 0,01, henholdsvis og en ubehandlet kontrol. Transkriptionen reaktioner blev analyseret efter 4 timer ved anvendelse af agarosegelelektroforese og UV-Vis-spektroskopi. Der er klare hæmning af Ga (tpfc), Actinomycin D, og ​​triptolide. Denne RNA-transkription assay kan modificeres for at tilvejebringe mere mekanistisk detalje ved at variere koncentrationerne af komplekset anticancer, DNA eller polymerase enzym eller ved at inkubere DNA eller polymerase med komplexes før RNA-transkription; Disse modifikationer vil skelne mellem en inhibering, der omfatter DNA eller enzymet. Tilføjelse komplekset efter RNA-transkription kan anvendes til at teste, om komplekserne nedbrydes eller hydrolysere RNA. Dette assay kan også anvendes til at studere yderligere kandidater anticancer.

RNA-transkription vurderet kvalitativt ved agarosegelelektroforese Agarosegelelektroforese anvendes til at afbilde det transkriberede RNA. Ethidiumbromid fluorescerer efter binding (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 tillader billeddannelse af RNA. Mørkere bånd i gelen svarer til højere koncentrationer af RNA. Hvis Actinomycin D, triptolide, eller enten corrole kompleks hæmmer RNA-transkription, er produktionen af ​​RNA reduce...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In vitro</em&gt; Enzymatisk assay til måling Transskription Inhibering af gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) corroles

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole og dets frie base analog udviser lav mikromolære celle cytotoksicitet. Dette håndskrift beskriver en RNA-transkription reaktion, imaging RNA med en ethidiumbromid-farvet gel, og kvantificere RNA med UV-Vis-spektroskopi med henblik på at vurdere transkription inhibering med corroles og viser en enkel metode til at evaluere anticancer kandidat egenskaber.

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Brug af Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging at måle realtid Ændringer i cellulær adhæsion og De-vedhæftning induceret af Matrix Ændring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Ocular Platform til Test Kontaktlinser

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som et fundament for In Vivo delvis lever ingeniør i rotten

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

En automatiseret metode til udførelse af in vitro-Mikronukleusanalysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Standardiseret og skalerbar analyse til undersøgelse af Perfuserende 3D Angiogen spiring af iPSC-afledte endotelceller in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...