Name: green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli at JoVE.com

The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

<ol>
	<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial,+archaean,+and+eukaryotic+organisms.">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).</li><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+diffraction+analysis+of+three-dimensional+crystals+of+bovine+rhodopsin+obtained+from+mixed+micelles.">X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles.</a> J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).</li><li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+rhodopsin:+A+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression.">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li><li>Schlegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+membrane+protein+overexpression+in+the+Escherichia+coli+strain+Lemo21(DE3).">Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3).</a> J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).</li><li>Chun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+partner+toolchest+for+the+stabilization+and+crystallization+of+G+protein-coupled+receptors.">Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors.</a> Structure. 20 (6), 967-976 (2012).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Busso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+protein+complexes+using+multiple+Escherichia+coli+protein+co-expression+systems:+a+benchmarking+study.">Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study.</a> J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).</li><li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+membrane+protein+detergent+stability+for+improving+throughput+of+high-resolution+X-ray+structures.">Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li><li>Low, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analytical+gel+filtration+screening+of+integral+membrane+proteins+for+structural+studies.">High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies.</a> Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल में, एक GFP संवाददाता वेक्टर में बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग तेजी से ई में कई झिल्ली प्रोटीन के रिश्तेदार अभिव्यक्ति स्क्रीन करने के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने के साथ संयुक्त है कोलाई। वैक्टर प्राथमिक अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग एक और सप्ताह लेने के साथ चार कार्य दिवसों में किया जा सकता है। में जेल पूरे कोशिकाओं के डिटर्जेंट lysates के प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति एक माध्यमिक स्क्रीन में आगे के विश्लेषण के लिए हिट पद के लिए प्रयोग किया जाता है। के रूप में प्रस्तुत प्राथमिक अभिव्यक्ति स्क्रीन के अलावा गहरे कुएं ब्लॉकों में कोशिकाओं को उगाने के लिए उपयुक्त एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर से किसी भी विशेषज्ञ उपकरण की आवश्यकता नहीं है। 96 अच्छी तरह से एसबीएस प्लेटों से जुड़े अन्य सभी तरल से निपटने मल्टी चैनल pipettes का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल आसानी से अलग अभिव्यक्ति शर्तों (जैसे कम तापमान) के तहत उगाया अन्य कोलाई उपभेदों शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। Rhamnose के स्तर titrating LEMO21 (DE3) के मामले में (0 से 2.0 मिमी करने के लिए)कुछ झिल्ली प्रोटीन 7 की अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ा सकते हैं प्रतिलेखन की दर मिलाना के लिए कहा। कठोर डिटर्जेंट शामिल किए जाने के शरीर से प्रोटीन solubilize और इसलिए झूठी सकारात्मक दे सकते हैं, हालांकि DDM के अलावा अन्य डिटर्जेंट प्राथमिक स्क्रीन में निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जाहिर है, अधिक प्रारंभिक स्क्रीन हो जाता है विस्तृत, और अधिक समय लेने वाली प्रयोग। माध्यमिक स्क्रीन प्राथमिक स्क्रीन में पहचान की अभिव्यक्ति हिट से कुल झिल्ली अंश की तैयारी शामिल है। यह यह ई की झिल्ली को संलयन प्रोटीन का स्थानीयकरण की पुष्टि करेगा के रूप में एक महत्वपूर्ण कदम है कोलाई कोशिकाओं। विभिन्न डिटर्जेंट में GFP संलयन प्रोटीन के बाद निकासी डिटर्जेंट प्रोटीन परिसरों की मोनो dispersity आकलन करने के लिए solubilized सामग्री की प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा नजर रखी है। इसके लिए सबसे उपयुक्त डिटर्जेंट की पहचान करता है के बाद से यह एक महत्वपूर्ण कदम हैबाद के बहाव के प्रसंस्करण के लिए झिल्ली प्रोटीन के solubilization। हालांकि, अनुभव डिटर्जेंट (एस) की पसंद के आगे अनुकूलन अभी भी शुद्धि और क्रिस्टलीकरण के दौरान आवश्यक हो सकता है कि पता चलता है। एक अपेक्षाकृत छोटे मिसेल आकार (जैसे LDAO) के साथ लोगों सहित विभिन्न डिटर्जेंट में वर्दी व्यवहार के साक्ष्य में कम से कम प्रोकार्योटिक झिल्ली प्रोटीन 14 के लिए क्रिस्टल diffracting अच्छी तरह से फार्म करने के लिए एक प्रवृत्ति का अच्छा संकेत प्रतीत होता है। इस संबंध में चित्रा 2B में झिल्ली प्रोटीन के लिए दिखाया गया प्रोफाइल अत्यधिक अनुकूल प्रतीत होता है। एक GFP संवाददाता का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि संयुक्त राष्ट्र के शुद्ध नमूनों में अभिव्यक्ति की एक तेजी से पढ़ने के लिए बाहर देता है। एक नुकसान यह GFP संलयन प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन की शुद्धि के दौरान हटा दिया जाना चाहिए कि है। यहां इस्तेमाल वैक्टर के मामले में, एक rhinovirus -3 सी प्रोटीज साइट GFP की दरार में सक्षम बनाता है। वैकल्पिक रूप से, यह स्पष्ट हैकेवल बाद शुद्धि के लिए एक polyhistidine या अन्य आत्मीयता टैग जोड़ने जो वैक्टर में स्क्रीन में पहचान उम्मीदवार प्रोटीन,-क्लोन फिर से करने के लिए। इस GFP के लिए फ्यूजन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक नहीं है कि मानता है। झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति और solubilization का पता लगाने के लिए GFP के लिए संलयन का उपयोग करने के लिए मुख्य विकल्प केवल एक हिस्टडीन टैग जोड़ने के लिए है। हालांकि इस दृष्टिकोण आम तौर पर कई वेरिएंट के मूल्यांकन के लिए बहुत समय लेने वाली बन जाएगा जो एक झिल्ली अंश 15 के साथ शुरू की आवश्यकता है। सारांश में, इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य झिल्ली प्रोटीन अनुक्रम की एक बड़ी संख्या तेजी से अभिव्यक्ति और डिटर्जेंट solubilization की दृष्टि से मूल्यांकन और गहरा विश्लेषण के लिए प्राथमिकता के आधार पर किया जाना है वेरिएंट के लिए सक्षम है।

यह झिल्ली प्रोटीन मानव जीनोम 2 सहित सभी अनुक्रम जीनोम 1, में कोडित जीनों का लगभग 20-30% के लिए खाते है कि अनुमान लगाया गया है। दवा लक्ष्य चयापचयों, ऊर्जा उत्पादन के उदाहरण परिवहन के लिए और के रूप में कई जैविक प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, उनके तीन आयामी संरचना का निर्धारण करने में गहन रुचि नहीं है। हालांकि घुलनशील प्रोटीन की तुलना में, झिल्ली प्रोटीन अत्यधिक तहत प्रतिनिधित्व प्रोटीन डाटा बैंक में हैं। वास्तव में, पी डी बी (में 99,624 जारी की संरचनाओं के <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) केवल 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) झिल्ली प्रोटीन के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। यह स्वाभाविक रूप से अपेक्षाकृत कम स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, जो झिल्ली प्रोटीन के साथ काम करने की तकनीकी कठिनाइयों को दर्शाता है; rhodopsin कुछ अपवादों 3,4 में से एक है। पुनः संयोजक संस्करण की अधिक अभिव्यक्तिheterologous कोशिकाओं में अक्सर उत्पादन के समग्र स्तर जो सीमा झिल्ली को misfolding और गरीब लक्ष्य-निर्धारण में यह परिणाम है। एक बार व्यक्त की एक झिल्ली प्रोटीन की निकासी और solubilization के लिए सबसे अच्छा डिटर्जेंट का चयन बाद में शुद्धीकरण कठिन बना देता है और सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है। Escherichia कोलाई 72% (के लिए लेखांकन झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति मेजबान रहता <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> बैक्टीरियल स्रोतों से लगभग विशेष रूप से कर रहे हैं, जो तारीख करने के लिए हल कर संरचनाओं के)। विशिष्ट ई कोलाई उपभेदों, C41 (DE3) और C43 (DE3), झिल्ली प्रोटीन की अधिक अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व और इसलिए अन्य BL21 के लिए मनाया विषाक्तता 5,6 उपभेदों के प्रभाव से बचने के लिए नहीं है, जो अलग-थलग कर दिया गया है। पुनः संयोजक झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर ट्यूनिंग उत्पादन 6,7 के स्तर के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। 6-8 का फायदा उठाने के लिए कई orthologues सहित कई संस्करणों के मूल्यांकन की आवश्यकता है। इसलिए, समानांतर में कई झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए एक विधि के लिए आवश्यक है। एक आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण प्रोटीन शुद्ध करने के लिए आवश्यकता के बिना पता लगाया जा करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को सक्रिय करने के अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन फ्यूज करने के लिए है। इस तरह, विभिन्न डिटर्जेंट में अभिव्यक्ति के स्तर, स्थिरता और व्यवहार के बारे में जानकारी संयुक्त राष्ट्र के शुद्ध सामग्री 9-12 की छोटी मात्रा के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। इस लेख में हम ई में झिल्ली प्रोटीन की क्लोनिंग और अभिव्यक्ति की स्क्रीनिंग के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन कोलाई उत्पादन और डिटर्जेंट के बाद के लक्षण वर्णन के एक पत्रकार के रूप में GFP के लिए फ्यूजन का उपयोग: प्रोटीन कंप्यूटर अनुप्रयोगlexes (चित्रा 1)।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए पुनः संयोजक झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन की वजह से अभिव्यक्ति के निम्न स्तर और एक बार डिटर्जेंट में solubilized कई झिल्ली प्रोटीन के निहित अस्थिरता के लिए तकनीकी रूप से चुनौती बनी हुई है। एक प्रोटोकॉल GFP प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया Escherichia कोलाई में अभिव्यक्ति के साथ GFP के fusions के रूप में झिल्ली प्रोटीन के बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग को जोड़ती है कि वर्णित है। यह कई झिल्ली प्रोटीन के निर्माण और अभिव्यक्ति की स्क्रीनिंग / समय और प्रयास के आगे निवेश के लिए उपयुक्त उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए वेरिएंट में सक्षम बनाता है। GFP संवाददाता एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) निम्न GFP प्रतिदीप्ति visualizing द्वारा अभिव्यक्ति का एक प्राथमिक स्क्रीन में प्रयोग किया जाता है। मुक्त GFP की अनुपस्थिति से संकेत के रूप में कम से कम गिरावट के साथ एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर दोनों बताते हैं कि झिल्ली प्रोटीन, एक माध्यमिक स्क्रीन के लिए चयन कर रहे हैं। इन निर्माणों पर पहुंचा और एक कुल झिल्ली अंश तैयार है और solubilize रहे हैंचार अलग अलग डिटर्जेंट में डी। डिटर्जेंट-अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए ultracentrifugation के बाद, lysates प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। GFP प्रतिदीप्ति द्वारा आकार अपवर्जन प्रोफाइल निगरानी अलग डिटर्जेंट में झिल्ली प्रोटीन के मोनो dispersity और अखंडता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। प्रोटीन: कम या कोई मुक्त GFP और न्यूनतम एकत्रीकरण के साथ एक सममित चोटी के साथ elute कि डिटर्जेंट संयोजन बाद शुद्धि के लिए उम्मीदवार हैं। इसके बाद के संस्करण कार्यप्रणाली, ई में heterologous अभिव्यक्ति का प्रयोग एसईडी (आकार, बढ़ाव, विभाजन, और sporulation) बैक्टीरिया के 47 विभिन्न प्रजातियों में से प्रोटीन की कोलाई विश्लेषण किया गया था। ये प्रोटीन आम तौर पर दस ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन है और कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक हैं। परिणाम बताते हैं कि ई में SEDS orthologues का उत्पादन कोलाई GFP संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के लिए सम्मान और निष्ठा के साथ अत्यधिक चर रहा था। प्रयोग मैंआगे की जांच के लिए एक सबसेट dentified।

प्रोटीन (आकार, बढ़ाव, विभाजन, और sporulation) की SEDS परिवार बैक्टीरिया कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक है। ये अभिन्न प्रोटीन आम तौर पर सेल के अंदर दोनों अमीनो और carboxy टर्मिनी के साथ दस ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उदाहरण देना करने के लिए, 47 SEDS orthologues वेक्टर pOPINE -3 सी-EGFP में क्लोन किया गया। निर्माणों के एक छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति स्क्रीन दो ई .coli उपभेदों में बाहर किया गया था, 0.25 मिमी की उपस्थिति में उगाई Lemo21 (DE3) नियमित तौर पर झिल्ली की अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है जो टपकाया अभिव्यक्ति और C41 (DE3) pLysS, ब्लॉक करने के लिए rhamnose प्रोटीन 5-8। प्रेरित संस्कृतियों का डिटर्जेंट solubilized lysates एसडीएस polyacrylamide वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया। में जेल प्रतिदीप्ति का प्रयोग व्यक्त GFP संलयन प्रोटीन 47 SEDS निर्माणों के बाहर दो उपभेदों के बीच 38 का उत्पादन किया गया पता चला है कि कल्पना करने के लिए। दिलचस्प बात यह है दो अभिव्यक्ति उपभेदों के बीच मतभेद थे। 38 निर्माणों व्यक्त की, केवल 18 दोनों में तनाव, केवल केवल C41 (DE3) pLysS में Lemo21 (DE3) और 6 में व्यक्त 14 में उत्पादन किया गया था। कुल मिलाकर, C41 (DE3) pLysS (24 बनाम 38) की तुलना में Lemo21 (DE3) के लिए एक उच्च सफलता दर वहां गया था। हालांकि कुछ प्रोटीन तनाव विशिष्ट होना को दिखाई अवलोकन है कि दोनों में स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है कि इसका मतलब है। 47 seds के 24 के लिए प्रतिनिधि डेटा निर्माणों चित्र 1 में दिखाया जाता है। बैंड की तीव्रता हालांकि दोनों उपभेदों में अच्छी तरह से अतिरिक्त व्यक्त किया जाता है जैसे चित्रा 1 ए और 1 बी में अच्छी तरह से c4 में संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का संकेत देता है, कम आणविक भार बैंड प्रोटीन आंशिक रूप से अपमानित है कि सलाह देते हैं। कई गलियों में अकेले GFP के लिए आकार में मेल खाती है, जो एक बैंड है। प्रोटीन की अखंडता के एक गुणात्मक मूल्यांकन मुक्त GFP के लिए संलयन प्रोटीन रिश्तेदार की तीव्रता को देखकर बाहर किया जा सकता है;उदाहरण के लिए जी -4 और एच 4 पूरी तरह से कुछ बरकरार प्रोटीन (चित्रा 1 ए) है Lemo21 (DE3) में जबकि C41 (DE3) pLysS (चित्रा 1 बी) में नि: शुल्क GFP के लिए टूट रहे हैं। 38 व्यक्त प्रोटीन के बाहर 14 के लिए नि: शुल्क GFP के बैंड की तीव्रता (मुक्त GFP के बैंड की तीव्रता संलयन प्रोटीन और संलयन प्रोटीन की एक अल्पसंख्यक की तुलना में अधिक है 21 के लिए, 3 संलयन प्रोटीन के समान है / 38) व्यक्त जैसे F6 और चित्रा 1 ए में G6 संलयन प्रोटीन की तुलना में अपेक्षाकृत कम मुक्त GFP है। और G6 (लिटिल मुक्त GFP) के व्यक्त किए गए थे और 500 मिलीलीटर सेल संस्कृति से तैयार कुल झिल्ली अंश (मुक्त GFP और संलयन प्रोटीन के लिए उच्च तीव्रता बैंड) प्राथमिक स्क्रीन बी 5 में अच्छी तरह से व्यक्त किया कि निर्माणों में से दो। Resuspended झिल्ली aliquots में विभाजित है और प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) द्वारा विश्लेषण किया गया। FSEC प्रोफाइल के Figur में प्रस्तुत कर रहे हैंई 2A और 2B क्रमशः और दो ​​SEDS प्रोटीन का परीक्षण चार डिटर्जेंट में अलग तरीके से व्यवहार करता है। एक मामले में (2A चित्रा: नमूना बी 5) प्रोटीन केवल इसलिए बाद में शुद्धीकरण के लिए पसंद की डिटर्जेंट होगा जो DDM में थोड़ा एकत्रीकरण के साथ एक सममित शिखर दे दी है। इसके विपरीत अन्य संलयन प्रोटीन द्वारा (चित्रा 2B: नमूना G6) का परीक्षण सभी डिटर्जेंट में एक समान प्रोफ़ाइल दिया। <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> चित्रा 1: ई में झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए कार्यप्रवाह के चित्र कोलाई एक GFP संवाददाता का उपयोग कर। <img alt="चित्रा 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> चित्रा 2: में जेल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्राथमिक स्क्रीन। </strongई के&gt; डिटर्जेंट lysates कोलाई एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया कोशिकाओं और जैल ब्लू महामारी रोशनी और एक 530/28 फिल्टर का उपयोग imaged। परिणाम (एक 96 अच्छी तरह से थाली में अपनी स्थिति के आधार पर ए 4-H6 लेबल) 24 निर्माणों के लिए दिखाए जाते हैं। मुक्त GFP और GFP संलयन प्रोटीन के लिए बैंड के पदों संकेत कर रहे हैं। Lemo21 (DE3)। (बी) C41 (DE3) pLysS में व्यक्त प्रोटीन में व्यक्त (ए) प्रोटीन। <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> चित्रा 3:। झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति की माध्यमिक स्क्रीन प्रतिदीप्ति का पता चला आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) का उपयोग कर कुल झिल्ली अंशों चार अलग अलग डिटर्जेंट में निकाले गए थे और solubilized झिल्ली प्रोटीन एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के लिए युग्मित एक FPLC प्रणाली का उपयोग कर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया। के लिए FSEC प्रोफाइल (ए) झिल्ली प्रोटीन B5 और (बी) </sटुनिशिया&gt; झिल्ली प्रोटीन G6। एकत्रित प्रोटीन, solubilized GFP संलयन प्रोटीन और मुक्त GFP के लिए इसी चोटियों की स्थिति संकेत कर रहे हैं। परीक्षण किया डिटर्जेंट प्रोफाइल के नीचे संकेत कर रहे हैं।

Watch this Scientific Journal Video about Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli at JoVE.com

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

झिल्ली प्रोटीन की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग में<em&gt; Escherichia कोलाई</em

हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए फ्यूजन पर आधारित Escherichia कोलाई में पुनः संयोजक झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है।

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

कार्बनिक सॉल्वेंट और एसिटिक एसिड के बिना जी 250 Coomassie के साथ जैल में प्रोटीन की धुंधला

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

की गतिविधि को मापने के लिए एक परख Escherichia कोलाई Lysine Decarboxyase inducible

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

झिल्ली प्रोटीन के lipídic Mesophases में Crystallization

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

फफूंद Endoglucanase में गतिविधि का उच्च Throughput स्क्रीनिंग Escherichia कोलाई</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

एक को लागू करने के लिए प्रोटोकॉल<em&gt; कोलाई</emसिंथेटिक बायोलॉजी के लिए&gt; आधार TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

में उत्पादित संयोजक Disulfide युक्त जहर प्रोटीन के लिए लागू उच्च Throughput मात्रात्मक अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और शोधन<em&gt; ई. कोली</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

से पेप्टाइड और प्रोटीन के साथ संयोजक Elastin तरह polypeptides और उनके fusions की गैर chromatographic शोधन<em&gt; कोलाई</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

प्रोटीन सह अभिव्यक्ति के बहुमुखी लाभ में<em&gt; Escherichia कोलाई</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...