Name: green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli at JoVE.com

The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

<ol>
	<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial,+archaean,+and+eukaryotic+organisms.">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).</li><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+diffraction+analysis+of+three-dimensional+crystals+of+bovine+rhodopsin+obtained+from+mixed+micelles.">X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles.</a> J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).</li><li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+rhodopsin:+A+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression.">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li><li>Schlegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+membrane+protein+overexpression+in+the+Escherichia+coli+strain+Lemo21(DE3).">Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3).</a> J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).</li><li>Chun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+partner+toolchest+for+the+stabilization+and+crystallization+of+G+protein-coupled+receptors.">Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors.</a> Structure. 20 (6), 967-976 (2012).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Busso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+protein+complexes+using+multiple+Escherichia+coli+protein+co-expression+systems:+a+benchmarking+study.">Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study.</a> J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).</li><li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+membrane+protein+detergent+stability+for+improving+throughput+of+high-resolution+X-ray+structures.">Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li><li>Low, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analytical+gel+filtration+screening+of+integral+membrane+proteins+for+structural+studies.">High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies.</a> Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

В методике, описанной в этой статье, лигирование независимое клонирование в GFP репортерного вектора в сочетании с флуоресцентной детекции быстро экран относительную экспрессию нескольких мембранных белков в E. палочка. Векторы могут быть сделаны в четырех рабочих дней с первичной скрининга выражение принимает дополнительно неделю. В-гель флуоресценции моющих лизатов целых клеток используется для ранжирования выражение парад для дальнейшего анализа в средней экране. Экран первичное выражение, как представлено не требует, кроме шейкер-инкубатор, пригодной для выращивания клеток в глубоких блоков также любое специальное оборудование. Все другие жидкости обработки с участием 96-а SBS пластины может быть осуществлена ​​с использованием многоканальных пипеток. Протокол может быть легко модифицирован, чтобы включать в себя другие штаммов E.coli, выращенных в различных условиях экспрессии (например, ниже температура). В случае LEMO21 (DE3) титрованием уровень рамнозы (от 0 до 2,0 мм)добавлен, чтобы модулировать скорость транскрипции может повысить уровень экспрессии некоторых мембранных белков 7. Кроме DDM Моющие могут быть использованы для извлечения в основной экран, хотя более жесткие моющие средства могут солюбилизации белков из телец включения и, следовательно, дает ложных срабатываний. Очевидно, что чем сложнее начальный экран становится более трудоемким эксперимент. Дополнительный экран включает подготовку общей мембранной фракции хитов экспрессии определенных в основной экран. Это очень важный шаг, поскольку он подтвердит локализацию слитых белков в мембраны Е. палочки клетки. После экстракции белка GFP слитого в различных моющих средствах будет контролироваться с помощью флуоресцентной-обнаружено эксклюзионной хроматографии растворенного вещества, чтобы оценить моно-дисперсность детергента-белковых комплексов. Это еще один важный шаг, поскольку он определяет наиболее подходящий стиральный порошок длясолюбилизации мембранного белка для последующей обработки вниз по течению. Тем не менее, опыт показывает, что дальнейшая оптимизация выбора моющего средства (ов) таки может потребоваться во время очистки и кристаллизации. Свидетельство единого поведения в различных моющих средств в том числе с относительно небольшим размером мицелл (например LDAO) появляется, чтобы быть хорошим индикатором склонности к образованию и дифракция, кристаллы, по крайней мере для прокариотических мембранных белков 14. В этом отношении профиль показан на мембранного белка на фиг.2В представляется весьма выгодно. Основное преимущество использования GFP репортер, что она дает быстрое считывание экспрессии в образцах не-очищали. Недостатком является то, что белок GFP слитый должен быть удален в течение очистки белка дл кристаллизации. В случае векторов, используемых здесь, протеазы сайт риновирусов 3C обеспечивает расщепление GFP. С другой стороны, это простоповторно-Clone кандидатов белки, выявленных на экране, в векторы, которые добавляются только полигистидиновый или другой аффинной метки для последующей очистки. Это предполагает, что слитый с GFP не является необходимым для экспрессии. Основной альтернативой использованию сплав с GFP для обнаружения экспрессии белка мембраны и солюбилизации является добавление только гистидин тег. Однако этот подход, как правило, требует, начиная с мембранной фракции 15, которая для оценки многих вариантов стала бы очень много времени. Таким образом, основная цель протокола, описанного в этой статье, для того, чтобы большое количество последовательности мембранных белков варианты, чтобы быстро оценить с точки зрения выражения и моющих средств солюбилизации и приоритеты для более глубокого анализа.

Было подсчитано, что мембранные белки составляют приблизительно 20-30% генов, кодируемых в геномах всех секвенированных 1, в том числе человеческого генома 2. Учитывая их решающую роль во многих биологических процессах, например для транспортных метаболитов, производства энергии и, как лекарственных препаратов, есть большой интерес в определении их трехмерную структуру. Однако по сравнению с растворимых белков, мембранные белки очень слабо представлены в белке банка данных. В самом деле, из 99 624 выпущенных структур в PDB ( <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) только 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) классифицируются как мембранных белков. Это отражает технические трудности работы с мембранными белками, которые, естественно, высказанных на относительно низких уровнях; родопсина является одним из немногих исключений 3,4. За экспрессия рекомбинантного версиис в гетерологичных клетках часто приводит к неправильного сворачивания и плохой ориентации на мембране, который ограничивает общий уровень производства. Выбор наилучшего моющее средство для извлечения и солюбилизации мембранного белка в свое время высказал делает последующую очистку сложно и требует тщательного оптимизации. Кишечной палочки остается наиболее часто используемым хост выражение для мембранных белков, приходящихся на 72% ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) структур решена до сих которые почти исключительно из бактериальных источников. Удельный E. штаммы кишечной палочки, C41 (DE3) и C43 (DE3), были выделены, которые не приводят к чрезмерной экспрессии мембранных белков и, следовательно, избежать последствий токсичность наблюдается и для других BL21 штаммов 5,6. Настройка уровня экспрессии рекомбинантного белка мембраны по-видимому, важны для оптимизации уровня производства 6,7. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Во многих случаях успешного производства мембранных белков для определения структуры потребовало оценку нескольких версий, включая амино- и карбоксильных-концевые делеции, несколько ортолагами с целью извлечения изменение естественной последовательности и различные слитые белки 6-8. Таким образом, способ скрининга экспрессии нескольких мембранных белков параллельно имеет важное значение. Один широко используемый подход к слиянию белка зеленого флуоресцентного белка (GFP), позволяющей экспрессии, которые необходимо отслеживать без необходимости очистки белка. Таким образом, информация о уровня экспрессии, стабильность и поведение в различных моющих средствах могут быть оценены с небольшими количествами не-очищенного материала 9-12. В этой статье мы расскажем, упорядоченных протокол для клонирования и экспрессии скрининга мембранных белков в E. палочка с помощью слияния в GFP в качестве репортера производства и последующей характеристики моющего средства: белка компlexes (Рисунок 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

Получение рекомбинантных мембранных белков для структурных и функциональных исследований остается технически сложным из-за низких уровней экспрессии и присущего нестабильность многих мембранных белков раз растворимым в моющих средствах. Данный протокол описывается, что сочетает в себе перевязки независимое клонирование мембранных белков, GFP слияния с выражением в кишечной палочки, обнаруженных флуоресценции GFP. Это позволяет строительство и выражение показ многократного мембранного белка / варианты по определению кандидатов, подходящих для дальнейшего инвестирования времени и усилий. GFP репортер используют в первичном скрининге экспрессии путем визуализации флуоресценции GFP после электрофореза в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE). Мембранные белки, которые показывают как высокий уровень экспрессии с минимальной деградацией, как показано отсутствие свободного GFP, выбирают для вторичного экрана. Эти конструкции масштабировать и общая доля мембрану, приготовленную, и солюбилизациид в четырех различных моющих средств. После ультрацентрифугирования, чтобы удалить нерастворимый моющий материал, лизаты анализировали с помощью обнаружения флуоресценции гель-проникающей хроматографии (фс). Мониторинг профиль гель-флуоресценции, GFP предоставляет информацию о моно-дисперсности и целостности мембранных белков в различных моющих средств. Белок: комбинации моющее средство, которое элюируют симметричный пик с мало свободного GFP и минимальной агрегации являются кандидатами для последующей очистки. По описанной методике, гетерологичная экспрессии в E. палочка СЭД (форма, относительное удлинение, разделение, и спорообразования) белков из 47 различных видов бактерий были проанализированы. Эти белки обычно имеют десять трансмембранных доменов и имеют важное значение для деления клеток. Результаты показывают, что производство SED, ортолагами в E. палочка была сильно варьируется по отношению к уровням экспрессии и целостности белков GFP синтеза. Эксперимент яdentified подмножество для дальнейшего расследования.

SEDS семейство белков (форма, относительное удлинение, разделение, и спорообразования) имеет важное значение для разделения бактериальной клетки. Эти интегральные белки обычно имеют десять трансмембранных доменов с обеих амино- и карбокси-концах внутри клетки. В качестве примера протокола, описанного выше, 47 SEDs ортологи были клонированы в вектор pOPINE-3C-EGFP. Маленький экран шкалы экспрессии конструкций проводилась в двух штаммов E .coli, Lemo21 (DE3) выращивали в присутствии 0,25 мМ рамноза блокировать экспрессию и вытекающей C41 (DE3) pLysS, которые обычно используемый для экспрессии мембраны белки 5-8. Моющие солюбилизировали лизаты индуцированных культур анализировали с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле. Использование флуоресценции в геле для визуализации выраженные слитые белки GFP показал, что между этими двумя штаммами 38 из 47 SEDs конструкций были произведены. Интересно было различия между двумя штаммами экспрессии, Из 38 выразил конструкции, только 18 были произведены в обоих штаммов, 14 экспрессируется только в Lemo21 (DE3) и 6 только в C41 (DE3) pLysS. В целом, было выше вероятность успеха для Lemo21 (DE3) по сравнению с C41 (DE3) pLysS (38 против 24). Однако факт, что некоторые белки оказались штамм-специфическими означает, что скрининг в обоих полезно. Репрезентативные данные по 24 из 47 SED, конструкции показаны на рисунке 1. Интенсивность полос дает представление об уровне экспрессии, например, слитого белка в хорошо С4 на рис 1А и 1В хорошо выражена в обоих штаммов однако дополнительная нижние полосы рные предположить, что белок является частично снижается. Во многих полос есть группа, которая соответствует по размеру, чтобы в одиночку GFP. Качественная оценка целостности белка может быть осуществлена, глядя на интенсивности слитого белка по отношению к свободной GFP;к примеру, G4 и H4 полностью разрушены, чтобы освободить GFP в C41 (DE3) pLysS (рис 1б), тогда как в Lemo21 (DE3) есть некоторые интактный белок (1А). Для 14 из 38 экспрессированных белков интенсивность свободного GFP группы аналогично слитого белка, на 21 интенсивность свободной GFP полосы больше, чем у слитого белка и меньшинство слитых белков (3 / 38 выражены), например, F6, G6 на фиг.1А, имеют относительно мало свободного GFP сравнению с слитого белка. Два из конструкций, которые хорошо выражена в основной B5 экран (полосы высокой интенсивности для свободного GFP и слитых белков) и G6 (немного свободного GFP) были высказаны и общей мембранной фракции, полученной из 500 культуры мл клеток. Ресуспендированные мембраны разделяли на аликвоты и анализировали с помощью флуоресцентно-обнаружено гель-проникающей хроматографии (фс). В фс профили представлены в Figurе 2А и 2В, соответственно, и показывают, что два SEDs белки себя по-разному в четырех протестированных моющих средств. В одном случае (2А: Образец B5) белок только дал симметричный пик с небольшим агрегации в DDM поэтому, которая была бы моющее средство выбора для последующей очистки. В отличие от этого другой слитый белок (фиг.2В: Образец G6) дает аналогичный профиль во всех испытанных моющих средств. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> Рисунок 1: Схема процесса для скрининга экспрессии белка мембраны в E. палочка с помощью GFP репортер. <img alt="Фиг.2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> Рисунок 2: главный экран выражения мембранных белков с помощью флуоресценции в геле. </strong&gt; Моющие лизаты Е. палочки клетки анализировали SDS-PAGE и гели визуализируют с помощью подсветки синий эпидемию и 530/28 фильтр. Полученные результаты приведены в течение 24 конструктов (обозначенный A4-Н6 в зависимости от их позиции в 96-луночный планшет). Позиции групп для свободного GFP и GFP слитых белков указаны. (A) белки, экспрессируемые в Lemo21 (DE3). (B) белки, экспрессируемые в C41 (DE3) pLysS. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> Рисунок 3:. Вторичный экран экспрессии белка мембраны с использованием флуоресцентно-обнаружено эксклюзионной хроматографии (фс) Всего мембранные фракции экстрагировали в четырех различных моющих средств и растворенные мембранные белки анализировали с помощью гель-проникающей хроматографии с использованием FPLC системе, связанной с флуоресцентным детектором. Фс профили (А) мембранным белком B5 и (В) </sЧонг&gt; мембранный белок G6. Положение пиков, соответствующих агрегированного белка, солюбилизированного белка GFP слитого и свободного GFP указаны. Моющие средства испытанные указаны ниже профилей.

Watch this Scientific Journal Video about Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli at JoVE.com

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

Обтекаемой подход к скрининга для экспрессии рекомбинантных мембранных белков в кишечной палочки на основе слияния с зеленого флуоресцентного белка представлена.

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Тест для измерения активности Кишечной палочки Индуцибельной Лизин Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Протоколы для Реализация<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; На основании TX-TL Cell-СВОБОДА СЛОВА Система синтетической биологии

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Высокая пропускная количественном выражении Скрининг и очистка Применительно к рекомбинантный дисульфид-богатые Venom белков, продуцируемых в<em&gt; Е. палочка</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Многогранная Преимущества белка ко-экспрессия в<em&gt; Кишечная палочка</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...