Name: evaluating the effectiveness of cancer drug sensitization in vitro and in vivo
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Ce travail a été rendu possible par des subventions à JK des Centres d&#39;excellence de l&#39;Ontario et le Fonds de la recherche en Ontario. Nous tenons à remercier Siddika Pardhan et le Dr Peter Ferguson pour l&#39;assistance technique pendant le tournage.

REMARQUE: Le protocole suivant a été conçu pour une utilisation avec des cellules adhérentes. Modifications sont nécessaires pour appliquer la méthode à des cellules non-adhérentes cultivées en suspension. Les expériences CAM décrites dans le protocole sont conçus pour une utilisation avec des cellules qui expriment un marqueur fluorescent (par exemple, la GFP, RFP, etc.). Neuf jours embryons de poulet sont tenus le jour 2 du protocole expérimental pour les expériences de CAM. <p clas...

<ol>
	<li>Bouwman, P., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+deregulated+DNA+damage+signalling+on+cancer+chemotherapy+response+and+resistance.">The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance.</a> Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).</li><li>Bozic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+dynamics+of+cancer+in+response+to+targeted+combination+therapy.">Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy.</a> Elife. 2, e00747 (2013).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486, 537-540 (2012).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+genomic+markers+of+drug+sensitivity+in+cancer+cells.">Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells.</a> Nature. 483, 570-575 (2012).</li><li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+cisplatin-induced+cell+death.">Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death.</a> PLoS One. 6, e19714 (2011).</li><li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KISS1R+induces+invasiveness+of+estrogen+receptor-negative+human+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells.">KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells.</a> Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).</li><li>Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+cancer+cell+migration+and+metastatic+growth+in+vivo+in+the+chick+embryo+using+fluorescence+intravital+imaging.">Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging.</a> Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).</li><li>Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cytosolic+NADH-NAD(+)+redox+state+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor.">Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Cell Metab. 14, 545-554 (2011).</li><li>Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+pH+in+live+cells+with+a+genetically+encoded+red+fluorescent+protein+sensor.">Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor.</a> J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).</li><li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2+inhibition+enhances+cisplatin-mediated+alterations+in+tumor+cell+proliferation,+metabolism,+and+metastasis.">BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis.</a> Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).</li></ol>

En raison du coût inhérent et le risque associé à des essais cliniques, il est nécessaire de développer une meilleure et plus rigoureuse méthodologie de test pré-clinique pour évaluer adéquatement les nouveaux schémas thérapeutiques anti-cancéreuses. Techniques couramment utilisées toutes les faiblesses actuelles d&#39;exposition qui peuvent limiter leur capacité de distinguer entre cibles thérapeutiques / agents potentiellement prometteurs, et ceux qui peuvent être moins efficaces. Nous avons élaboré...

Résistance à la cible et / ou le traitement du cancer cytotoxique est un problème clinique important qui peut conduire à l&#39;échec du traitement, de la rechute acquise, et l&#39;augmentation de la mortalité des patients 1. Compte tenu du degré élevé d&#39;hétérogénéité dans la plupart des tumeurs, ce est une certitude mathématique qu&#39;une tumeur du nombre suffisamment élevé de cellules contient un sous-ensemble de cellules résistantes à des traitements simples ou combinés ciblant les voies moléculaires à laquelle ces cellules dépendent de survie de 2,3. Ces cellules tumorales peuvent être sélectionnées positivement pour pendant le traitement, conduisant à la réapparition de la maladie. Le développement de nouvelles thérapies qui ciblent simultanément différents mécanismes de survie des cellules cancéreuses, soit avant, soit après le choix du traitement à médiation, est donc d&#39;importance clinique. Un niveau élevé d&#39;instabilité du génome et la mutation dans le génome de la tumeur est une caractéristique fondamentale qui distingue les cellules cancéreuses à partir de cellules hôtes non tumorales 4. Par conséquent, un useful stratégie pour augmenter l&#39;efficacité de la chimiothérapie endommageant l&#39;ADN et d&#39;empêcher le développement de la résistance est active pour inhiber la réparation de l&#39;ADN dans les cellules tumorales 5. Ce est un champ actif de l&#39;enquête et une variété de cibles de réparation d&#39;ADN nouveaux sont à l&#39;étude dans un cadre pré-clinique. Un certain nombre de petites molécules ou des inhibiteurs à base antisens-de ces objectifs ont été élaborés et sont en cours de test 6-8. L&#39;objectif est d&#39;identifier les candidats pré-cliniques les plus prometteurs et d&#39;évaluer la sécurité et l&#39;efficacité dans les essais cliniques. Le coût élevé des essais cliniques et le risque d&#39;échec (pour une variété de raisons, y compris l&#39;évaluation pré-clinique sous-optimale) sont de formidables obstacles pour progresser dans le développement de nouvelles thérapies neuf. L&#39;utilisation de modèles appropriées et rigoureuses pré-clinique pour évaluer adéquatement nouvelles cibles thérapeutiques et médicaments candidats peut diminuer le taux d&#39;échec élevé de 10 essais cliniques </sup&gt;. Certaines méthodes précliniques couramment utilisés pour évaluer l&#39;efficacité des thérapies anticancéreuses sont les suivantes: a) mesure de la capacité à réduire la prolifération des cellules tumorales in vitro (les essais de prolifération cellulaire), b) la réduction induite par un traitement dans la capacité des cellules tumorales à colonies de culture sous forme de tissu (essais de formation de colonie), c) la réduction induite par un traitement dans des cellules tumorales activité métabolique in vitro (transformation de colorant redox), d) induction induit par le traitement d&#39;vitro la mort dans des cellules tumorales (apoptose, nécrose, autophagique, associé avec la mitose et autres) 11, et e) la réduction in vivo de la croissance ou l&#39;ablation de xénogreffes humaines et de souris induite par un traitement de 12 à 14. Une faiblesse majeure des méthodes énumérées in vitro, ce est qu&#39;aucun d&#39;entre eux fournissent évaluation en temps réel et en continu de l&#39;effet de thérapies candidats. Plutôt, ils fournissent des informations sélectionnées, seulement à des points de temps largement séparésau cours du traitement. Ces mesures ont diminué la capacité de refléter avec précision l&#39;ampleur et le calendrier des réponses des cellules tumorales. In vivo des modèles de xénogreffes de souris sont également limitées par le coût élevé, la longueur de temps pour terminer, et le risque de dosage et de traitement synchronisation sous-optimale (ordonnancement). En outre, il existe des preuves que les modèles rongeurs de xénogreffes sont des prédicteurs limitées d&#39;efficacité clinique chez l&#39;homme, par rapport à l&#39;évaluation in vitro de réponses des cellules primaires de tumeurs humaines et établies des lignées de cellules tumorales humaines à des interventions thérapeutiques candidats 15,16. Nous avons conçu un nouveau protocole de combinaison pour évaluer de nouvelles combinaisons de médicaments pré-clinique, d&#39;une manière qui répond aux faiblesses des procédures plus communs énumérés ci-dessus. A la place de la prolifération, la formation de colonies, ou de colorant redox essais de conversion, nous avons utilisé un appareil de mesure du métabolisme d&#39;analyser l&#39;adhérence cellulaire, la respiration, et l&#39;acidification en temps réelau cours de la période de traitement 17. En même temps, nous avons étudié les effets de la combinaison d&#39;un traitement in vivo par l&#39;utilisation d&#39;un embryon de poulet membrane chorio-allantoïde de modèle (CAM) de l&#39;invasion et de métastase 18,19. Nous avons utilisé ces méthodes pour évaluer la capacité d&#39;un oligonucleotide antisens (ASO) ciblage BRCA2 pour potentialiser l&#39;efficacité du cisplatine médicament chimiothérapeutique couramment utilisé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Name of Material/ Equipment</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A549 cells</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CCL-185</td>
			<td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AeraSeal film&#160;</td>
			<td >Carl Roth GmbH</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMEM</td>
			<td >Wisent Bioproducts</td>
			<td >210-011-QK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antisense oligodeoxynucleotides</td>
			<td >Avecia</td>
			<td ></td>
			<td>BRCA2 target sequence: 5&#39; - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3&#39; (bases 7241-7259 )</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio Zoom V16 Microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td ></td>
			<td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bionas Biosensor Chips</td>
			<td >Bionas GmbH and Micronas GmbH</td>
			<td >BIS8001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bionas Discovery 2500 System&#160;</td>
			<td >Bionas GmbH</td>
			<td ></td>
			<td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cisplatin</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fertilized chicken eggs</td>
			<td >Sourced locally</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td >Gibco - Life Technologies</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td >Invitrogen - Life Technologies&#160;</td>
			<td >12566014</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Wisent Bioproducts</td>
			<td >311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin (0.25%)/EDTA</td>
			<td >Wisent Bioproducts</td>
			<td >325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the effectiveness of cancer drug sensitization in vitro and in vivo

En raison du niveau élevé de l&#39;hétérogénéité et de mutations inhérentes dans les cancers humains, les thérapies d&#39;agents simples ou les traitements d&#39;association qui ciblent la même voie, sont susceptibles d&#39;échouer. L&#39;accent doit être mis sur l&#39;inhibition des voies qui sont responsables de la résistance intrinsèque et / ou d&#39;adaptation à la thérapie. Un champ actif de l&#39;enquête est le développement et les tests d&#39;inhibiteurs de réparation d&#39;ADN qui favorisent l&#39;action de, et empêchent la résistance à, couramment utilisé chimiothérapie et la radiothérapie. Nous avons utilisé un protocole selon l&#39;invention pour évaluer l&#39;efficacité de l&#39;inhibition de BRCA2 en tant que moyen de sensibiliser les cellules tumorales à la cisplatine préjudiciable de médicaments de l&#39;ADN. le métabolisme des cellules de la tumeur (acidification et la respiration) a été surveillé en temps réel pendant une période de 72 h à délimiter l&#39;efficacité du traitement sur une base minute par minute. En combinaison, nous avons effectué une évaluation de la fréquence métastatique utilisant une membrane chorioallantoïque d&#39;embryon de poulet (CAM) de modèle d&#39;extravasation et l&#39;invasion. Cetteprotocole répond à certaines des faiblesses des couramment utilisés in vitro et in vivo de méthodes pour évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques du cancer. Il peut être utilisé en plus des méthodes communes telles que des tests de prolifération cellulaire, les tests de la mort cellulaire, et les études in vivo de xénogreffes de souris, de discriminer davantage parmi les cibles et agents candidats, et ne choisissez que les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement.

Résultats et chiffres adaptés avec la permission de travaux publiés 22. BRCA2 inhibition induit une diminution de la respiration dans les cellules tumorales traitées au cisplatine Les cellules humaines de cancer du poumon A549 traitées avec BRCA2 ciblage ASO et le cisplatine exposé une baisse anticipée et irréversible dans la respiration, par rapport aux cellules qui ont reçu commande ASO et cisplatine seul; après 24 h de traitement ...

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Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Évaluation de l&#39;efficacité des médicaments contre le cancer Sensibilisation<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

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